Cella singola quantificazione dei tassi di degradazione delle proteine mediante microscopia a fluorescenza time-lapse in coltura delle cellule aderenti

L'obiettivo generale di questo approccio di imaging a fluorescenza è determinare l'emivita di una proteina di interesse in singole cellule viventi utilizzando uno SNAP-tag. Le proteine cellulari sono ampiamente trasformate con velocità di sintesi e degradazione specifiche per ciascuna proteina e soggette a regolazione fisiologica. Tuttavia, i metodi più comunemente usati per determinare l'emivita delle proteine sono limitati alle medie della popolazione delle cellule dei pidocchi o richiedono l'uso di inibitori della sintesi proteica.

In questo video, dimostriamo come un tag SNAP-tag in combinazione con la microscopia time lapse a fluorescenza possa essere utilizzato per misurare l'emivita delle proteine nelle cellule viventi. Il vantaggio di questo metodo è che raggiunge la risoluzione di una singola cellula e quindi fornisce una stima dell'eterogeneità dell'emivita in una popolazione di cellule in coltura. La procedura sperimentale qui presentata può essere applicata a qualsiasi tipo di cellula in coltura aderente, esprimendo una proteina di interesse fusa con uno SNAP-tag.

Ciò può essere ottenuto mediante marcatura endogena delle proteine o utilizzando la sovraespressione di proteine marcate. Lo SNAP-tag è una versione mutante dell'enzima di riparazione del DNA, O6-alchilguanina-DNA alchiltransferasi che reagisce specificamente con la benzilguanina, che può essere accoppiata a sonde molecolari. Pertanto, qualsiasi proteina di fusione SNAP-tag può essere marcata in modo irreversibile con un colorante permeabile alle cellule di florescenza.

Dopo il lavaggio del colorante residuo, la popolazione proteica marcata decadrà in modo esponenziale e si può dedurre l'emivita della proteina corrispondente. In questo video utilizziamo cellule staminali embrionali, che formano colonie strette quando vengono coltivate classicamente su piatti rivestiti di gelatina. Per consentire loro di crescere come un monostrato di cellule, e quindi di ottenere una risoluzione di una singola cellula per esperimenti di imaging in florescenza, le abbiamo coltivate su piastre rivestite aderenti all'inc, che riduce le interazioni cellula-cellula mediate dall'adesione dell'inc cellulare espressa sulla membrana plasmatica.

Diluire l'inc ricombinante aderente a cinque nanogrammi per microlitro in PBS e aggiungere 30 microlitri di inc diluito aderente per valvola in una piastra a 96 valvole, adatta per l'imaging. Evitare il pipettaggio esteso, poiché l'adesione del ricombinante è molto fragile. Incubare a 37 gradi per un'ora e mezza.

Aspirare la soluzione aderente all'inc, lavare una volta con 100 microlitri di PBS e aggiungere fino a 200 microlitri di terreno di coltura ESL pre-sverminato. Utilizzare linee ESL che esprimono una proteina di interesse fusa con lo SNAP-tag. Lavare le cellule con cinque ml di PBS.

Quindi aggiungere due ml di Tripson e incubare per quattro minuti a 37 gradi. Aggiungere quattro ml di terreno di coltura ESL, risospendere e far girare a 1000 T per quattro minuti. Aspirare il surnatante, risospendere in terreno fresco e contare le cellule.

Posizionare 30.000 cellule per centimetro quadrato nella piastra di imaging rivestita aderente. Procedere con la colorazione del colorante SNAP 24 ore dopo l'inserimento delle celle. Diluire il colorante cellulare nel terreno di coltura ELS alla concentrazione ottimale precedentemente determinata.

Aspirare il terreno utilizzando una pipetta e aggiungere con cura 50 microlitri del colorante SNAP diluito. Incubare per 30 minuti a 37 gradi. Aspirare il colorante e lavare tre volte con 200 microlitri di PBS pre-verme.

Aggiungere 200 microlitri di terreno di coltura ESL e incubare per 15 minuti a 37 gradi. Eseguire le fasi di lavaggio con una pipettatura delicata e non utilizzare un aspiratore automatico poiché le cellule tendono a staccarsi facilmente. Ripetere gli stessi passaggi di lavaggio altre due volte, quindi aggiungere 200 microlitri di terreno di imaging.

Utilizzare un terreno privo di rosso fenolo per ridurre il fondo di fioritura. Utilizzare un microscopio che consenta di controllare la temperatura e la CO2. Impostare la temperatura a 37 gradi e la CO2 al cinque percento prima dell'uso e lasciare equilibrare per una o due ore.

Posizionare la piastra nel microscopio e selezionare il punto adatto per l'imaging. Le immagini in campo chiaro mostrano l'ESL attaccato al piatto rivestito aderente in un monostrato. Seleziona l'obiettivo, un obiettivo 20X è appropriato per queste dimensioni di ESL.

Selezionare le impostazioni di illuminazione per il canale di florescenza da registrare. Regola la potenza e l'esposizione del laser per ottenere un segnale forte, poiché diminuirà nel corso del film. Selezionare i parametri di acquisizione per l'esperimento time lapse.

Per le proteine con emivita prevista da due a venti ore, scegliere tempi di acquisizione da 12 a 24 ore con intervalli di tempo di 15 minuti. Avvia l'esperimento di imaging. Utilizzare il software FIJI per l'elaborazione e l'analisi del filmato.

Raccogli le immagini acquisite come una pila e deformala. Usa la funzione sottrai sfondo FIJI per rimuovere lo sfondo da tutte le immagini nella pila. Seleziona una cella di interesse, disegna una regione di interesse attorno ad essa utilizzando la barra degli strumenti FIJI e aggiungi la regione di interesse a ROI Manager.

Procedi al fotogramma successivo e ripeti le azioni precedenti. Segui la cella di interesse nel corso del film e salva il ROI impostato per ogni cella tracciata. Fare clic su misura per ottenere i valori dell'intensità media e dell'area dei ROI.

Per stimare lo sfondo locale, aggiungere una regione di interesse vicino alla cella di interesse per ogni intervallo di tempo. Alla fine, fare clic su misura per ottenere i valori per l'intensità media dello sfondo. Innanzitutto, calcola l'intensità media della cella moltiplicando il valore ottenuto per l'intensità media del ROI cellulare per la sua area.

Quindi, procedere al calcolo del valore di fondo integrato della cella, moltiplicando l'intensità media della ROI di fondo con l'area della ROI cellulare. Infine, per ottenere un valore corretto per il fondo per l'intensità integrata della cella, sottrarre il valore dell'intensità di fondo integrato dal valore dell'intensità cellulare integrata. Per ottenere un'emivita media della popolazione cellulare, normalizzare i valori ottenuti al valore di intensità del primo fotogramma per ogni cellula.

Ciò garantisce che ogni cellula contribuisca con lo stesso peso al valore medio dell'emivita indipendentemente dalla sua intensità assoluta di fioritura. Dopo la divisione cellulare, le cellule figlie vengono tracciate separatamente e sommano le loro intensità integrate dopo la sottrazione di fondo per tenere conto della diluizione delle proteine durante la divisione cellulare. Salvare i set ROI per entrambe le celle figlie.

Per la stima dell'emivita della proteina, utilizzare lo strumento di adattamento della curva in MATLAB. Il decadimento della proteina segue un esponenziale dove F(x) è l'intensità della fioritura in un dato punto temporale, a"l'intensità iniziale e b"il tasso di decadimento. Dopo aver ottenuto i valori per il tasso di decadimento b"dall'adattamento, l'emivita può essere calcolata dividendo il logaritmo di due per b"Questo filmato mostra il decadimento della fioritura del colorante SNAP in una linea cellulare di fusione SNAP-tag opt four inutilizzabile doxiciclina.

Il segnale di florescenza osservato dipenderà dalla linea cellulare utilizzata, dal livello di espressione della corrispondente proteina di interesse, nonché dalle proprietà del colorante utilizzato. Per gli esperimenti di decadimento delle proteine è importante utilizzare un'adeguata concentrazione di colorante SNAP. La concentrazione dovrebbe essere sufficientemente alta da produrre un segnale di fioritura luminosa all'inizio del lasso di tempo.

Tuttavia, l'uso di concentrazioni di colorante troppo elevate potrebbe causare la presenza di residui di colorante nel mezzo, anche dopo il lavaggio. Il colorante libero potrebbe successivamente legarsi alle molecole SNAP-tag appena prodotte nel corso del film, il che distorcerebbe la curva di decadimento. È quindi fondamentale ottimizzare la concentrazione del colorante SNAP testando diverse diluizioni.

Questa figura mostra le curve di decadimento per otto diverse concentrazioni di un colorante SNAP in florescenza testato su una linea cellulare inutilizzabile di doxiciclina. È stata scelta una concentrazione iniziale di colorante di tre micromolari secondo le istruzioni del produttore per l'imaging di cellule vive ed è stata eseguita una diluizione seriale da uno a tre fino a raggiungere una concentrazione di 1,4 nanomolari. Per le due concentrazioni più alte il segnale non diminuisce, mentre il decadimento osservato segue una curva esponenziale per concentrazioni più basse.

In questo esempio è stata selezionata una concentrazione ottimale di 12 nanomolari, poiché questa concentrazione garantisce quantità minime di colorante residuo rimasto nel terreno dopo il lavaggio, ma il segnale di florescenza è ancora abbastanza luminoso da osservare una chiara curva di decadimento. Il protocollo descritto fornisce una stima della variabilità e dell'emivita da cellula a cellula per ogni data proteina fusa con SNAP-tag. Questa figura mostra il decadimento delle singole cellule e la media della popolazione per tre diverse linee cellulari di fusione SNAP-tag inutilizzabili con doxiciclina.

Nanog"e Oct4" hanno una vita piuttosto breve con emivite medie di 2,9 e 4,8 ore. Mentre Srsf11" è più longevo avendo un'emivita media di 25,3 ore. I grafici a scatola mostrano la distribuzione delle emivite per le tre proteine.

Abbiamo dimostrato che l'uso di uno SNAP-tag, in combinazione con la microscopia time lapse a florescenza, consente di determinare l'emivita di qualsiasi proteina di interesse. Le misurazioni del decadimento di una singola cellula forniscono una stima dell'eterogeneità dell'emivita in una popolazione di cellule, che viene omessa quando si utilizzano altri metodi per determinare l'emivita delle proteine. Uno dei passaggi più cruciali quando si utilizza uno SNAP-tag per monitorare il decadimento delle proteine, è garantire che non rimanga alcun colorante non legato residuo nel terreno o nelle cellule dopo il lavaggio.

In caso contrario, potrebbe legarsi a molecole SNAP-tag di nuova produzione più avanti nel corso dell'esperimento e quindi compromettere la curva di decadimento. Ciò si ottiene da un lato eseguendo attentamente tutte le fasi di lavaggio descritte. D'altra parte, la concentrazione del colorante SNAP dovrebbe essere mantenuta il più bassa possibile, pur rimanendo in un intervallo che consenta di ottenere un buon rapporto segnale/rumore.

La concentrazione del colorante SNAP deve essere ottimizzata per ogni esperimento in base alla linea cellulare e al tipo di colorante utilizzato. Sebbene sia possibile che lo SNAP-tag possa alterare l'emivita delle proteine candidate in alcuni casi, non vediamo prove di tali effetti, poiché l'emivita determinata del test delle proteine candidate aderisce a valori pubblicati strettamente corrispondenti. Per escludere ulteriormente un effetto dello SNAP-tag sulla degradazione delle proteine, un'opzione potrebbe essere quella di bloccare la sintesi proteica con cicloesimide ed eseguire blot in bagno in diversi punti temporali, utilizzando un anticorpo che riconosce la proteina indigena.

E per confrontare direttamente il decadimento della proteina candidata SNAP-tag con la versione indigena non marcata.