Rilevamento e rimozione di nucleasi contaminazione durante la purificazione del prototipo ricombinanti Virus schiumoso integrasi

L'obiettivo generale di questo protocollo è identificare ed eliminare l'attività di nucleasi contaminante durante la purificazione delle proteine. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della retrovirologia, come la biochimica, la struttura e la dinamica dell'integrazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'identificazione e la rimozione dell'attività di nucleasi su DNA contaminante da una proteina ricombinante di interesse durante il processo di purificazione.

Iniziare scongelando un pellet di E.coli che esprime l'integrasi del virus schiumoso prototipico su ghiaccio. Utilizzare un sonicator dotato di un biohorn con diametro di 0,5 pollici e una micro-punta conica con diametro di 0,125 pollici per sottoporre a sonicazione per 30 secondi a un'ampiezza del 30%, mantenendo il tubo su ghiaccio. Dopo la sonicazione, trasferire il campione cellulare in un tubo per ultracentrifuga freddo e centrifugare a 120.000 ×g per 60 minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo la centrifugazione, dovrebbe essere visibile un precipitato evidente e il surnatante potrebbe avere un colore giallo. Trasferire il surnatante in un tubo conico da 50 millilitri freddo. Successivamente, preparare la colonna FPLC lunga 110 millimetri e con diametro di 5 millimetri, contenente una resina carica di nichel da 1,5 millilitri.

Per prima cosa, collegare la colonna allo strumento FPLC ed applicare il tampone. Lo strumento dovrebbe raccogliere in tempo reale i dati di conducibilità e di assorbanza UV a 280 nanometri. Le letture di conducibilità e UV dovrebbero stabilizzarsi.

Se necessario, continuare a far passare tamponi attraverso la colonna fino a quando le letture non saranno stabili. Utilizzando un superloop, caricare il campione proteico sulla colonna a una velocità di flusso di 0,15 millilitri al minuto con un limite di pressione massima di 0,5 megapascal. Collegare il superloop all'AKTA FPLC.

Dopo aver lavato la colonna ed eluito le proteine, prelevare aliquote di 15 microlitri del flusso iniziale, del lavaggio e delle frazioni di assorbanza a 280 nanometri del picco, e aggiungere 15 microlitri di tampone campione 2X per SDS-PAGE a ciascun campione. Far bollire i campioni per tre minuti. Caricare 10 microlitri di ciascun campione su gel SDS-PAGE al 10%, insieme a quattro microlitri di standard proteici pre-colorati.

Ispezionare visivamente il gel per identificare le frazioni che sembrano contenere integrasi del virus della schiuma di tipo prototipico quasi pura. Combinare queste frazioni e prendere nota del volume durante la pipettaggio. Tale volume è tipicamente compreso tra otto e dieci millilitri.

Utilizzando uno spettrofotometro, misurare l'assorbanza UV a 280 nanometri delle frazioni combinate e calcolare la quantità totale di proteina integrasi del prototipo del virus della schiuma. Un rendimento tipico è di circa 10 milligrammi per litro di coltura indotta. Per rimuovere il tag esacistidinico, aggiungere all'integrasi del prototipo del virus della schiuma una concentrazione finale di DTT 10 millimolare ed EDTA 0,1 millimolare.

Quindi aggiungere 15 microgrammi di proteasi 3C del rinovirus umano per milligrammo di integrasi del virus della schiuma prototipico e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte. Per eseguire la frazionatura mediante cromatografia di affinità su eparina dell'integrasi del virus della schiuma prototipico, ridurre la concentrazione di cloruro di sodio del campione a 200 millimolari aggiungendo 1,5 volumi di buffer C. Successivamente, caricare il campione diluito di integrasi del virus della schiuma prototipico sulla colonna di eparina Sepharose a una velocità di flusso di 0,5 millilitri al minuto con un limite di pressione massima di un megapascal. Dopo aver lavato la colonna e raccolto il gradiente e l'ultimo lavaggio, analizzare il carico, il flusso iniziale, il lavaggio e le frazioni mediante SDS-PAGE all'8%.

Quindi valutare le frazioni colorando il gel con blu di Coomassie. L'integrasi del virus spumoso prototipico e la nucleasi contaminante presentano affinità diverse per la cromatografia su eparina Sepharose. Identificare le frazioni di eparina Sepharose che sembrano contenere integrasi del virus spumoso prototipico quasi pura da utilizzare nel saggio della nucleasi.

Per iniziare il saggio di nuclease, unire tre microlitri di frazione di eparina e 50 nanogrammi di DNA plasmidico superavvolto di tre chilobasi e tampone di reazione fino a un volume finale di 15 microlitri. Incubare a 37 gradi Celsius per 90 minuti. Arrestare la reazione con Proteinasi K a un milligrammo per millilitro e SDS allo 0,5%, quindi incubare a 37 gradi Celsius per un'ora.

Quindi aggiungere 3,5 microlitri di colorante di carico 6X alle reazioni del saggio nucleasico e caricare l'intero volume su un gel di agarosio all'1%. Far correre il gel a 100 volt a temperatura ambiente per un'ora o fino a quando il fronte del colorante raggiunge l'estremità del gel. Al termine dell'elettroforesi, un'immagine del gel ottenuta con uno scanner fluorescente dovrebbe mostrare che il DNA lineare migra in base alla sua dimensione reale di tre kb, il DNA superavvolto migra più velocemente a circa due kb e il DNA circolare rilassato migra più lentamente a circa 3,5 kb.

Utilizzando un software di analisi delle immagini, calcolare il volume in pixel dei plasmidi a cerchio superavvolto, lineare e rilassato in ogni corsia. Definire la somma dei volumi in pixel di queste tre forme di DNA come valore totale del DNA e utilizzarlo per calcolare la percentuale di forme lineari e circolari rilassate. Le frazioni che contengono nucleasi contaminanti mostrano una percentuale maggiore di forme lineari e circolari rilassate rispetto al controllo negativo.

Combinare le frazioni di eparina Sepharose che non mostrano attività di nucleasi contaminante e trasferirle in tubi da dialisi con cutoff di peso molecolare di 6-8 chilodalton e diametro di 10 millimetri. Eseguire la dialisi a quattro gradi Celsius durante la notte contro un litro di soluzione di dialisi. Il giorno successivo, recuperare il campione di integrasi del virus foam prototipico privo di nucleasi dal tubo di dialisi.

Misurare l'assorbanza a 280 nanometri e calcolare la concentrazione finale della proteina. Aliquotare la proteina e congelare rapidamente in azoto liquido. Successivamente, conservare le aliquote a meno 80 gradi Celsius.

L'assay della nucleasi è stato eseguito come descritto in questo video. I controlli negativi includono DNA plasmidico senza proteina e una precedente purificazione dell'integrasi del virus della foamy prototipo di tipo selvaggio, nota per essere priva di nucleasi. Un controllo positivo per l'attività di nucleasi contaminante è una precedente purificazione dell'integrasi del virus della foamy prototipo cataliticamente inattiva, nota per contenere nucleasi contaminante.

Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come saggi biochimici o imaging a singola molecola, al fine di rispondere a ulteriori domande, come la cinetica e la dinamica enzimatica. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come identificare e rimuovere l'attività nucleasica contaminante da una proteina ricombinante.