Name: Rilevamento e rimozione di nucleasi contaminazione durante la purificazione del prototipo ricombinanti Virus schiumoso integrasi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Impara a purificare l'integrasi del virus schiumoso prototipo da Escherichia coli rimuovendo le nucasi contaminanti mediante cromatografia di affinità all'eparina. Questo metodo garantisce preparazioni proteiche pure per studi biochimici.

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Questo lavoro è stato supportato da NIH AI099854 e AI126742 a chiave.

1. indurre PFV nell'espressione in e. coli
<ol><li>
Aggiungere 1 μL di plasmide di espressione IN PFV (10 ng / µ l) a 20 μL di e. coli BL21 (DE3) pLysS (aliquota da 20 μL di celle disponibili in commercio è > 2 x 106 CFU/μg plasmide) in una provetta da 1,5 mL. Mescolare delicatamente dal dito toccando o sfogliando il tubo. Incubare in ghiaccio 5 min.
	<ol>
<li>Calore shock per esattamente 30 s in un 42 ˚ c bagno d'acqua e quindi tornare immediatamente in ghiaccio per 2 min.</li>
		<li>Aggiungere 80 µ l di brodo super ottimale di temperatura ambiente con media di repressione (SOC) dei cataboliti. Incubare per 1 h a 37 ° c con 225 giri al minuto (rpm) agitazione.</li>
		<li>Piastra 25 µ l della miscela su un 100 mm x 15 mm di Petri contenente 25 mL di agar di brodo (LB) di Luria (L 1 LB agar: bacto-tryptone di 10 g, 10 g NaCl, 5 g Estratto di lievito, 15 g di agar) e 100 μg/mL ampicillina (100 mg/mL di soluzione madre).</li>
		<li>Il restante 75 μL di cellule trasformate in un secondo piatto identico della piastra. Incubare le piastre con i coperchi giù durante la notte a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recuperare le piastre di trasformato Escherichia coli. Utilizzare una singola Colonia per inoculare 3 mL di LB (1 L LB: 10 g di bacto-tryptone, 10 g di NaCl, 5 g di lievito estratto) completati con 100 ampicillina μg/mL in una provetta di polipropilene cultura fondo tondo 14-mL. Incubare per ~ 8 h a 37 ° c con agitazione 225 giri/min.
	<ol>
<li>Aggiungere 3 mL di cultura a 50 mL LB completati con 100 μg/mL ampicillina e cloramfenicolo 34 μg/mL (34 mg/mL di soluzione madre) in una beuta da 250 mL. Incubare la coltura durante la notte a 37 ° C con agitazione 225 giri/min.</li>
		<li>Trasferire i 53 mL di coltura LB 1 L, 100 µ g/mL ampicillina e 34 cloramfenicolo μg/mL in un matraccio di Erlenmeyer 4L. Incubare a 37 ° C con agitazione 225 giri/min.</li>
		<li>Misurare la densità ottica a 600 nm (OD600) della cultura periodicamente. Inizialmente, controllare la cultura OD600 ogni h. Come la cultura raggiunge il desiderato OD600, controllare ogni 15 min per non invadere. Far crescere la cultura a un OD600 tra 0,9 e 1.0. Trasferire il pallone in un bagno di ghiaccio e agitare per ridurre la temperatura della cultura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Trasferire 1 mL della coltura in una provetta da 1,5 mL per un'analisi successiva denaturando analisi SDS-PAGE.
	<ol>
<li>Agglomerare le cellule nel tubo da 1,5 mL mediante centrifugazione per 1 minuto in un microfuge a 14.000 x g a temperatura ambiente. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet in 150 μL Tampone fosfato salino (PBS) di pipettaggio. Il PBS può essere con o senza CaCl2 e MgCl2.</li>
		<li>Aggiungere 150 µ l di tampone di SDS-PAGE: 2x (150 mM Tris-HCl, pH 6.8, SDS 1,2%, 30% glicerolo, 15% β-mercaptoetanolo (βME), blu di bromofenolo 0,0018%) e mescolare accuratamente da dispensare o vortice. Far bollire per 3 min. Conservare a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere la coltura batterica: una concentrazione finale di 0,25 mM isopropilico-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG, soluzione di riserva di 0,25 M) e 50 μM ZnCl2 (soluzione 50 mM). IPTG induce l'espressione del gene PFV IN dal promotore T7 e ZnCl2 viene aggiunto come un supplemento per il corretto ripiegamento di un dominio del dito di zinco terminale amminico in PFV IN. Incubate la cultura a 25 ° C con agitazione immediatamente a 225 giri/min per 4 h. trasferire il pallone in un bagno di ghiaccio. Salvare 1 mL di coltura per analisi SDS-PAGE, seguendo lo stesso protocollo come sopra al punto 1.3.</li>
	<li>
Trasferire la coltura batterica bottiglie di dimensioni appropriate della centrifuga. Ad esempio, una cultura di 1 L può essere trasferita a quattro bottiglie di polipropilene fondo conico sterile monouso da mL 250. Girare le bottiglie in una centrifuga refrigerata da tavolo a 3000 x g per 20 min a 4 ° c. Scartare i surnatanti versando.
	<ol>
<li>Tutti i pellet da una coltura batterica 1 L in un volume totale di 25 mL (6,25 mL per flacone) PBS freddo (con o senza CaCl2 e MgCl2) Risospendere pipettando. Combinare e trasferire le sospensioni batteriche in una provetta conica da 50 mL. Girare in una centrifuga refrigerata a 3.000 x g per 20 min a 4 ° C. Scartare il surnatante di versamento o di pipettaggio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Risospendere il pellet batterico in 10 mL di tampone di risospensione (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl e l'inibitore della proteasi phenylmethylsulfanoxide (PMSF) 500 μM) di pipettaggio. Snap congelare il pellet inserendo il tubo in un pallone Dewar con azoto liquido sufficiente per immergere il tubo da 50 mL. Rimuovere il tubo da azoto liquido con cautela e conservare a-80 ° C. Nota: Pellet batteriche possono essere conservati per diversi mesi a-80 ° C. Non abbiamo visto nessuna perdita di proteina attiva dopo stoccaggio di-80 ° C per due anni.</li>
	<li>
Analizzare i campioni di pre- induzione e post-induzione di 8,3 cm di larghezza, 7,3 cm di altezza, 0,75 mm spessore SDS-PAGE gel con poliacrilammide 6% 1,5 mL accatastamento strato (125 mM Tris-HCl, pH 6.8, 6% di acrilammide, 0.1% SDS, 0,1% ammonio persolfato, 0.001% TEMED) e 3,5 mL 10% poliacrilammide risoluzione strato (375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 10% di acrilammide, 0.1% SDS, 0,1% ammonio persolfato, 0.001% TEMED)12.
	<ol>
<li>Dopo aver versato il gel d'impilamento, inserire un pettine di ben 10. Quando il gel è polimerizzato, montare l'apparecchiatura di pagina e aggiungere sufficienti buffer in esecuzione di SDS-PAGE (25 mM Tris, glicina 192 mM, 0,1% SDS).</li>
		<li>Caricare 10 µ l di ogni campione e 4 μL di standard di proteina precolorati. Eseguire a 16,5 V/cm fino a quando la parte anteriore della tintura raggiunge il fondo del gel, circa 60 min.</li>
		<li>Smontare le lastre di gel e trasferire il gel in una vasca di plastica. Aggiungi Coomassie Brilliant Blue macchiatura soluzione (0,1% R-250 di blu brillante Coomassie, 40% metanolo, acido acetico 10%) per generosamente coprire il gel e macchiare per 20 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione colorante versando e Sostituisci con decolorare soluzione (40% metanolo, 10% acido acetico) fino a quando le bande sono facilmente visibili. Rimuovere la soluzione decolorante versando e sostituire con acqua deionizzata. PFV IN dovrebbe essere facilmente identificati nel campione post-induzione. PFV IN con un tag di hexahistidine ha un peso molecolare di 47374 Da.</li>
		<li>Se non è visibile IN PFV, ripetere l'induzione a partire con una colonia di diversa da una delle piastre trasformazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. nickel cromatografia di affinità
<ol><li>Scongelare una batterica precipitato sul ghiaccio. Nota: Questo richiederà molto tempo (circa 2-3 h). Quando la pallina si è sciolto per liquami una cella, aggiungere un ulteriore 500 μM PMSF (soluzione 100 mM).</li>
	<li>Tenere il tubo da 50 mL di batteri dei residui sul ghiaccio. Sottoporre ad ultrasuoni i batteri ad ampiezza di 30% per 30 s (1 s on, 1 s off) a pellet derivato dalla cultura 1L utilizzando un sonicatore con un corno di bio del diametro di 0,5 pollici con un diametro di 0,125 pollici conica microtip, una frequenza di 20 kHz e potenza massima di 400 w.</li>
	<li>Trasferire il campione di cellule in una provetta di freddo ultracentrifuga. Utilizzare in policarbonato bottiglia assembly (diametro 25 mm, 89 mm altezza) compatibile con un rotore ad angolo fisso tipo 60 Ti. Rotori e tubi alternativi possono essere utilizzati se non si ottiene la stessa forza di gravitazione. Spin di 120.000 x g per 60 min a 4 ° C. Ci dovrebbe essere una pallina di ovvia. Il supernatante può avere un colore giallo.</li>
	<li>Trasferire il surnatante da versarsi o pipettare in una provetta conica freddo 50 mL. Nota il volume; Questo volume dovrebbe essere circa il volume di tampone di risospensione utilizzato prima del congelamento di snap. Se il supernatante è viscoso, può essere contaminato da DNA batterico che poteva intasare la colonna di cromatografia. In questo caso, ripetere l'ultracentrifugazione per pellet il DNA batterico.</li>
	<li>
Preparare 500 mL Tampone un (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF) e 500 mL Tampone B (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF, imidazolo 200 mM). Nota: In questo protocollo, mantenere il sistema di cromatografia in fase liquida (FPLC) proteine veloci, tutti i buffer e il campione a 4 ° C in una camera fredda.<ol>
<li>Filtro sterile buffer A e B, con 0,2 μm filtro monouso. A seconda del sistema FPLC, lavare pompa A e pompa B con tampone A e B di Buffer, rispettivamente. Flusso di tampone al 90% e 10% tampone B attraverso il sistema fino a stabilizzano la conducibilità e letture di UV. La portata massima dipenderà sullo strumento; utilizzare una portata di 5 mL/min con un limite di pressione massima di 1,0 MPa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare una colonna FPLC 110mm Diametro 5 mm long, con 1,5 mL di resina carica di nichel (capacità di legame massimo 50 mg/mL, massima pressione di 1 MPa). La colonna può essere preparata il giorno prima purificazione e conservata a 4 ° c.</li>
	<li>Collegare la colonna allo strumento FPLC. Equilibrare la colonna con 20 mL di tampone al 90% e 10% tampone B (imidazolo 20 mM) con una portata di 0,5 mL/min con un limite di pressione di 0,5 MPa. Lo strumento dovrebbe essere raccolta dati in tempo reale di conducibilità e di capacità di assorbimento UV a 280 nm (A280). Si dovrebbero stabilizzare la conducibilità e letture di UV. Se queste letture non sono stabilizzati, continuare a buffer del flusso attraverso la colonna fino a quando non sono stabili.</li>
	<li>
Caricare il campione della proteina (~ 10 mL / pellet) alla colonna ad un flusso di 0,15 mL/min con un limite di pressione di 0,5 MPa. La portata e colonna la pressione rimane la stessa durante la purificazione. Raccogliere il flusso attraverso in una provetta da 50 mL.
	<ol>
<li>Lavare la colonna con 20 mL di tampone al 90% e 10% Buffer B. raccogliere il lavaggio in un tubo da 50 mL. Eluire le proteine con una sfumatura lineare di 20 mL di 10% a 100% tampone B (20mm-imidazolo 200 mM).</li>
		<li>Infine, lavare la colonna con 5 mL 100% tampone B (imidazolo 200 mM). Raccogliere il lavaggio gradiente e finale in frazioni 0,27 mL.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Combinare 15 μL di tampone del campione SDS-PAGE 2 x con 15 μL del flusso attraverso, lavare e le frazioni di picco A280 . Bollire i campioni per 3 min.
	<ol>
<li>Preparare due 10% SDS-PAGE gel come descritto in precedenza nel passaggio 1.6 tranne con ben 15 pettini. Caricare 10 µ l di ogni campione per il gel e 4 μL di standard di proteina precolorati. Eseguire, macchia e analizzare i gel come descritto al punto 1.6.</li>
		<li>Combinare le frazioni che sembrano contenere quasi puro IN PFV basato su ispezione visiva. Misurare il volume di pipettaggio, solitamente 8-10 mL.</li>
		<li>Misurare A280 delle frazioni combinate con uno spettrofotometro e calcolare la quantità totale di PFV di proteine; il nostro rendimento tipico è ~ 10 mg / L di cultura indotta. Il coefficiente di estinzione di PFV IN con il tag hexahistidine è 59360 cm-1 M-1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per rimuovere il tag hexahistidine, supplemento al PFV IN con 10 mM dithiothreitol (DTT, soluzione madre 1 M) e 0,1 mM EDTA, pH 8.0 (soluzione 0,5 M). Aggiungere 15 μg di proteasi 3C rhinovirus umano (HRV) per mg PFV IN. Incubate a 4 ˚ c durante la notte. Clivaggio riduce il peso molecolare IN PFV da 47374 Da a Da 44394 e può essere verificato dall'analisi di 10% SDS-PAGE.</li>
</ol>3. cromatografia di affinità eparina
<ol><li>
Preparare 250 mL C Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 μM PMSF) e 250 mL Tampone D (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 μM PMSF, NaCl di 1m). Nota: In questo protocollo, il sistema FPLC, buffer e campione sono tenuti in una cella frigorifera a 4 ˚ c.<ol>
<li>Filtro sterile buffer C e D con 0,2 unità di filtrazione monouso μm. A seconda del sistema FPLC, lavare pompa A e pompa B con Buffer C e D del Buffer, rispettivamente. Flusso di Buffer C l'80% e 20% Buffer D attraverso il sistema fino a stabilizzano la conducibilità e letture di UV. La portata massima dipenderà sullo strumento; Utilizziamo abitualmente una portata di 5 mL/min con un limite di pressione massima di 1,0 MPa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare una colonna FPLC lunga, 5 mm diametro 80 mm con 1 mL di resina di sepharose eparina (massima capacità legante 2,0 mg di bovino in resina di antitrombina III / mL; pressione massima 1,4 MPa). La colonna può essere preparata il giorno prima purificazione e conservata a 4 ° C. Collegare la colonna allo strumento FPLC.
	<ol>
<li>Equilibrare la colonna con 20 mL di Buffer C l'80% e 20% D Buffer (200 mM NaCl) ad una portata di 0,5 mL/min con un limite di pressione di 1 MPa. Lo strumento dovrebbe essere raccolta dati in tempo reale di conducibilità e di capacità di assorbimento UV a 280 nm (A280). Si dovrebbero stabilizzare la conducibilità e letture di UV. Se queste letture non sono stabilizzati, continuare a buffer del flusso attraverso la colonna fino a quando non sono stabili.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ridurre la concentrazione di NaCl del campione PFV IN a 200 mM con l'aggiunta di 1,5 volumi C. Buffer Ad esempio, aggiungere 15 mL di Buffer C 10ml PFV in. Il nostro volume totale è in genere ~ 25 mL.</li>
	<li>
Il campione diluito IN PFV alla colonna di sepharose eparina a 0,5 mL/min di portata con pressione massima di carico limite 1,0 MPa. La portata e colonna la pressione rimane la stessa durante la purificazione. Raccogliere il flusso attraverso in una provetta conica da 50 mL.
	<ol>
<li>Lavare la colonna con 20 mL di Buffer C l'80% e 20% D Buffer (200 mM NaCl), raccogliendo il lavaggio in una provetta conica da 50 mL. Eluire la colonna con una sfumatura lineare di 30 mL di 20% a 100% D Buffer (200 mM a 1 M NaCl).</li>
		<li>Lavare la colonna con 5 mL di 100% Buffer D. raccogliere il gradiente e lavaggio finale in frazioni di 0,37 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analizzare il carico, il flusso attraverso, lavare e frazioni dell'8% SDS-PAGE come descritto in 2.9. PFV IN seguito clivaggio del tag hexahistidine ha un peso molecolare di 44394 Da e il coefficiente di estinzione rimane 59360 cm-1 M-1 senza il tag hexahistidine. Memorizzare tutte le frazioni a 4 ˚ c fino al completamento di un'analisi di nucleasi.</li>
</ol>4. analisi di nucleasi
<ol><li>
Identificare le frazioni di sepharose eparina che sembrano contenere quasi puro PFV poll. combinare 3 μL di frazione di eparina e 50 ng di 3 kb plasmide supercoiled DNA nella reazione del buffer (10 mM HEPES, pH 7.5, 110 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 4 μM ZnCl2 10 mM DTT) con un volume finale di 15 μL. Incubare a 37 ° c per 90 min Include un controllo negativo con nessun PFV IN.
	<ol>
<li>Fermare la reazione con proteinasi K di 1 mg/mL (20 mg/mL di soluzione madre) e 0,5% SDS (10% soluzione di riserva). Incubare a 37 ° C per 1 h. campioni possono essere conservati a-20 ° C per un'analisi successiva.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare un gel 125 mL di 1% in peso per volume (p/v) agarose in tampone di x TAE 1 (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA) con 0.1 µ g/mL etidio bromuro (10 mg/mL di soluzione madre)13. Sciogliere la soluzione di agarosio e versate ad un vassoio di colata di gel 15 x 10 cm. Inserire un pettine di ben 15 con ampia, pozzi di spessore 0,75 mm 5 mm. Pozzi sottile resa migliore risoluzione di banda rispetto ai pozzi spessore 1,5 mm. Lasciare che il gel a solidificare a temperatura ambiente.
	<ol>
<li>Immergere il gel in 1 x TAE con 0,1 µ g/mL di bromuro di etidio. Aggiungere 3,5 μL di 6x loading dye (50% glicerolo, 0,15% Orange G tintura) per le reazioni di dosaggio di nucleasi. Caricare l'intero volume al gel. Esegua il gel a tensione costante, 10 volt per centimetro (100 V) a temperatura ambiente per 1 ora o fino a quando la parte anteriore della tintura di Orange G raggiunge la fine del gel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immediatamente l'immagine del gel dell'agarosi con uno scanner fluorescente impostato per rilevare il bromuro di etidio. DNA lineare deve essere eseguito con taglia indicata 3 kb, DNA supercoiled dovrebbe più veloce (~ 2 kb), e rilassato cerchio DNA va più lento (~3.5 kb).
	<ol>
<li>Utilizzando software di analisi di immagine, calcolare il volume di pixel del plasmide supercoiled, lineare e rilassante cerchio in ogni corsia. Chiamare la somma del pixel volumi per queste tre forme di DNA "DNA totale" valore e utilizzano per calcolare la percentuale dei cerchi lineare e rilassati. Ad esempio, il volume di pixel dei cerchi rilassati è diviso per il valore del pixel del DNA totale in quanto Vicolo, moltiplicare questo numero per 100 per determinare una percentuale. Le frazioni che contengono contaminante nucleasi visualizzano una percentuale più elevata dei cerchi lineare e rilassati rispetto al controllo negativo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Combinare le frazioni di sepharose eparina che non vengono visualizzati attività della nucleasi contaminanti. Dializzare in 10 mm 6-8 kDa peso molecolare in taglio tubi dialisi (MWCO) a 4 ° C durante la notte contro 1 L di 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 200 mM NaCl, 50 μM ZnCl2, 10 mM DTT, 20% glicerolo.</li>
	<li>Recuperare il campione di PFV IN nucleasi-free da tubi di dialisi. A280 di misurare e calcolare la concentrazione finale di proteine. Aliquotare e snap congelamento in azoto liquido. Conservare le aliquote a-80 ° C.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Proteine ricombinanti che interagiscono con il DNA, come proteine, spazzini di ossigeno per le applicazioni di microscopia di singola molecola, o retrovirali integrases, di riparazione del DNA dovrebbero essere liberi di contaminanti batterici nucleasi2,3. Questi contaminanti possono confondere l'interpretazione dei risultati durante saggi biochimici o singola molecola alla rinfusa.
Abbiamo trovato che una nucleasi batterica frequentem...

Gli studi biochimici e singola molecola delle interazioni della proteina con DNA richiedono proteine ricombinanti eccezionalmente pure. Contaminando nucleasi da batteri possa oscurare i risultati di queste analisi. Una nucleasi contaminante è stata trovata in preparazioni a base di proteine ricombinanti ossigeno scavenger protocatecuato-3,4-diossigenasi (PCD) e prototipo virus schiumoso (PFV) integrasi (IN) isolato da Escherichia coli (Escherichia coli)1 , 2 , 3.
Integrazione retrovirale saggi si basano sulla conversione del DNA supercoiled ai prodotti intaccati o lineare come una misura di attività4. Durante l'infezione cellulare IN unisce le due estremità di un cDNA virale per l'host della cromatina5. Ogni estremità unendo la reazione è chiamato filo trasferimento. Saggi di ricombinante IN attività possono aderire due oligomeri del DNA che imita il cDNA virale termina ad un target di DNA in un'integrazione concertata reazione4,5,6,7,8. In alternativa IN ricombinante possono aderire solo un'estremità del DNA in un non-fisiologicamente rilevanti metà sito integrazione reazione9,10. Quando il DNA del plasmide supercoiled è la destinazione di integrazione, i prodotti sono concordate linearizzato DNA e mezza sito integrazione prodotti sono cerchi rilassati. Questi prodotti di reazione sono individuati dalla loro mobilità relativa nel corso di elettroforesi su gel di agarosio1. Se il ricombinante IN ha una nucleasi contaminante, ci saranno spurie cerchi rilassati o un plasmide linearizzato possibilmente confondendo i risultati sperimentali. Oligomeri del DNA virali possono essere etichettati fluorescente per identificare i prodotti di integrazione, al contrario di prodotti nuclease conclusivamente. Tuttavia, IN notevolmente favorisce target DNA supercoiled; qualsiasi perdita del plasmide supercoiled a cerchi rilassati o DNA lineare di contaminante nucleasi potrebbe inclinare risultati e interpretazione di dati11. Quindi è assolutamente necessario rimuovere nucleasi batteriche da retrovirali nelle preparazioni.
PFV IN ha una diversa affinità per l'eparina sepharose rispetto alla nucleasi batterica1. PFV IN e le nucleasi possono essere separati da un'eluizione di pendenza lineare da eparina sepharose. Le nucleasi non è rilevata prontamente da un'assorbanza di ultravioletti (UV) a 280 nm picco o di elettroforesi di analitica sodio dodecil solfato del gel di poliacrilammide (SDS-PAGE). Invece, la nucleasi viene rilevata da un'analisi di attività della nucleasi che impiegano la conversione di un plasmide supercoiled a cerchi rilassati o prodotti lineari. Ogni frazione seguendo cromatografia sepharose eparina è testato per attività della nucleasi. PFV IN e il contaminante nucleasi non hanno alcuna differenza nell'affinità per resina anionica Mono-Q. C'è una piccola differenza di affinità per resina del catione Mono-S. Tuttavia, la risoluzione di Mono-S di nucleasi batterica e PFV IN non consentirebbe efficiente separazione delle proteine. In definitiva, la purificazione di affinità di eparina sepharose offre la migliore separazione di nucleasi batterica da PFV IN e ha il vantaggio di volume di carico illimitato.
Test per attività della nucleasi di contaminanti possono essere adattati ad altre proteine. La proteina di interesse probabilmente avrà caratteristiche di affinità alternativi rispetto IN PFV; la differenza nelle caratteristiche della proteina di interesse e il contaminante di nucleasi di associazione deve essere determinata empiricamente. Questa metodologia per l'identificazione di contaminazione nucleasi può essere adattata a altre resine tra cui Mono-S catione o resine a scambio anionico Mono-Q. Affinità e scambio ionico resine possono offrire un metodo affidabile per isolare una proteina ricombinante di interesse da parte di contaminanti nucleasi senza limiti sul volume della proteina durante la cromatografia.

<table><tbody><tr><td>BL21/DE3 Rosetta E. coli</td><td>EMD Millipore</td><td>70956-4</td><td></td></tr><tr><td>LB brodo</td><td>EMD biosciences</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Amresco</td><td>0339</td><td></td></tr><tr><td>Cloramfenicolo&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0230</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>IPTG&nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>CI8280</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr><tr><td>Tris Ultra Pure</td><td>Gojira Fine Chemicals</td><td>UTS1003</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>P212121</td><td>RP-S23020</td><td></td></tr><tr><td>PMSF&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0754</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0250</td><td></td></tr><tr><td>DTT&nbsp;</td><td>P212121</td><td>SV-DTT</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Amresco</td><td>0662</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio&nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>G37-20</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>Eparina Sefarosio 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0998-01</td><td></td></tr><tr><td>HRV14 3C proteasi&nbsp;</td><td>Prodotti chimici EMD</td><td>71493-3</td><td></td></tr></tbody></table>

rilevamento e rimozione di nucleasi contaminazione durante la purificazione del prototipo ricombinanti virus schiumoso integrasi

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

La proteina di integrasi (IN) del virus schiumoso del prototipo di retrovirus (PFV) è un enzima di modello per studiare il meccanismo di integrazione retrovirale. Rispetto IN da altri retrovirus, PFV IN è più solubile e più suscettibili di manipolazione sperimentale. Inoltre, è sensibile a inibitori dell'IN clinicamente rilevanti virus di immunodeficenza umana (HIV-1), suggerendo che il meccanismo catalitico di PFV IN è simile a che di HIV-1 pollici pollici catalizza l'Unione covalente di virale DNA complementare (cDNA) per destinazione DNA in un processo chiamato trasferimento strand. Questa reazione di trasferimento del filo introduce Nick al DNA dell'obiettivo. Analisi dei prodotti di reazione di integrazione possono essere confuso dalla presenza di nucleasi quel nick allo stesso modo del DNA. Una nucleasi batterica è stata indicata per co-purificare con ricombinante IN PFV espressa in Escherichia coli (Escherichia coli). Qui descriviamo un metodo per isolare PFV IN dalla nucleasi contaminante dalla cromatografia di affinità di eparina. Le frazioni sono facilmente schermate per contaminazione di nucleasi con un plasmide supercoiled e l'elettroforesi del gel dell'agarosi. PFV IN e i contaminante nucleasi display alternativo affinità per eparina sepharose permettendo una preparazione nucleasi-free of recombinant PFV IN adatto per analisi biochimiche o singola molecola di massa di integrazione.

Ricombinante IN PFV è spesso contaminato con una nucleasi batterica1. Le analisi biochimiche integrazione dipendono la quantificazione della conversione del DNA del plasmide supercoiled cerchi rilassati e prodotti lineari. La presenza di una contaminante nucleasi potrebbe portare a spuria quantificazione di queste analisi. Espressione di PFV IN con un tag hexahistidine è indotta in e. coli (Figura 1) e prima purificati mediante cromatografia di affinità di ni...

Proteina di integrasi del virus schiumoso prototipo ricombinante è spesso contaminata con una nucleasi batterica durante la purificazione. Questo metodo identifica contaminazione nucleasi e lo rimuove dalla preparazione finale dell'enzima.

Rilevamento e rimozione di nucleasi contaminazione durante la purificazione del prototipo ricombinanti Virus schiumoso integrasi

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è identificare ed eliminare l'attività di nucleasi contaminante durante la purificazione delle proteine. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della retrovirologia, come la biochimica, la struttura e la dinamica dell'integrazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'identificazione e la rimozione dell'attività di nucleasi su DNA contaminante da una proteina ricombinante di interesse durante il processo di purificazione.Iniziare scongelando un pellet di E.coli che esprime l'integrasi del virus schiumoso prototipico su ghiaccio. Utilizzare un sonicator dotato di un biohorn con diametro di 0,5 pollici e una micro-punta conica con diametro di 0,125 pollici per sottoporre a sonicazione per 30 secondi a un'ampiezza del 30%, mantenendo il tubo su ghiaccio. Dopo la sonicazione, trasferire il campione cellulare in un tubo per ultracentrifuga freddo e centrifugare a 120.000 ×g per 60 minuti a quattro gradi Celsius.Dopo la centrifugazione, dovrebbe essere visibile un precipitato evidente e il surnatante potrebbe avere un colore giallo. Trasferire il surnatante in un tubo conico da 50 millili

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