Sistemi costitutive e inducibile per la modificazione genetica In Vivo degli epatociti Mouse usando l'iniezione della vena della coda idrodinamica

L'obiettivo generale di questo metodo è la trasfezione stabile di epatociti in vivo, con costrutti vettoriali per l'espressione di geni inducibili o shRNA. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sul fegato. Ad esempio, può essere applicato per studiare i meccanismi del cancro al fegato e della rigenerazione.

Il vantaggio principale di questa tecnica è l'espressione combinata di CreER insieme all'espressione inducibile del transgene R shRNA negli epatociti di topo in vivo, ottenuta mediante iniezione idrodinamica della vena caudale. A dimostrare la procedura sarà Eric Hübner, uno studente di medicina del nostro laboratorio. Inizia combinando 150 nanogrammi di vettore di ingresso contenente l'RNA a forcina corta per la proteina bersaglio con 150 nanogrammi di vettore pTC Tet e tampone TE per un volume totale di otto microlitri.

Quindi trasferire la miscela di enzimi LR clonasi II nel ghiaccio e incubare per due minuti. Vortice due volte durante l'incubazione. Quindi aggiungere due microlitri di miscela di enzimi LR clonasi II alla reazione e incubare a 25 gradi Celsius per un'ora.

Dopo l'incubazione, arrestare la reazione aggiungendo un microlitro di soluzione di proteinasi K. Quindi incubare a 37 gradi Celsius per dieci minuti. Successivamente, trasformare i batteri competenti Stbl3 con due microlitri di miscela di clonazione utilizzando un protocollo standard di shock termico.

Dopo aver galvanizzato la trasformazione su piastre di agar contenenti ampicillina, incubare a 30 gradi Celsius per 24 ore. Il giorno successivo, raccogliere singole colonie e inoculare piccoli volumi di terreno di crescita batterica per l'incubazione durante la notte. Dopo aver isolato il DNA e confermato l'integrità del vettore mediante sequenziamento Sanger, preparare le preparazioni del DNA su larga scala del costrutto per l'iniezione.

Inizia pesando i topi. Quindi preparare una soluzione salina sterile contenente 15 microgrammi per millilitro di costrutto vettoriale della Bella Addormentata senza endotossine e un microgrammo per millilitro di pchsB5 privo di endotossine. Preparare una quantità sufficiente di soluzione per iniettare in ciascun topo un volume pari al 10% del suo peso corporeo.

Riempire una siringa sterile da 3 millilitri con il volume necessario per un topo e inserire un ago calibro 27. Dopo aver aggiunto una quantità adeguata di carta velina per lasciare uno spazio minimo per il movimento ma sufficiente per la respirazione, inserire il mouse in un apposito sistema di ritenuta con fori per la respirazione. Riscalda la coda usando una lampada a infrarossi per 30-60 secondi osservando attentamente i segni di surriscaldamento come il movimento rapido della coda o altri segni di agitazione.

Quindi pulire la coda con un tampone imbevuto di alcol. Inserisci l'ago quasi orizzontalmente in una delle due vene laterali della coda vicino alla base della coda. Se posizionato correttamente, una piccola quantità di sangue potrebbe rifluire nel cono dell'ago.

Iniettare il volume totale nella vena caudale entro otto-dieci secondi. Dopo l'iniezione, rimuovere immediatamente il mouse dal sistema di contenzione. Comprimere la ferita da iniezione con una garza sterile per almeno 30 secondi o fino a quando l'eventuale sanguinamento non si attenua.

Il successo dell'iniezione idrodinamica della vena caudale è fondamentale per la trasfezione e dipende soprattutto dalla velocità, dal volume e dal tempo di iniezione. Per facilitare l'iniezione endovenosa, assicurarsi che i topi non siano stressati o disidratati il giorno dell'iniezione. Dopo 30-60 minuti di stabulazione da solo in una gabbia di recupero, trasferisci il topo nella sua gabbia originale.

Iniziare l'induzione della Cre ricombinasi da 10 a 15 giorni dopo l'iniezione della vena caudale per consentire la clearance dei vettori non integrati. Sciogliere dieci milligrammi di tamoxifene in 40 microlitri di etanolo e incubare a 55 gradi Celsius per dieci minuti agitando. Agitare più volte fino a quando il tamoxifene non si è sciolto.

Quindi aggiungere 960 microlitri di olio di mais e incubare per cinque minuti a 55 gradi Celsius. Dopo il raffreddamento, aspirare la soluzione in una siringa da insulina da 1 millilitro con un ago da 20 gauge. Quindi passare a un ago calibro 27.

Per iniettare, prima posiziona il mouse afferrando con cura il collo del mouse con il pollice e il secondo dito, fissando la coda tra la base della mano e il quarto e il quinto dito. Quindi iniettare intraperitonealmente 0,1 millilitri di soluzione nel quadrante inferiore sinistro dell'addome. Per esperimenti di durata inferiore a dieci giorni, somministrare continuamente doxiciclina tramite acqua potabile utilizzando il seguente protocollo.

Per prima cosa, sciogliere cinque grammi di saccarosio in 100 millilitri di acqua di rubinetto e in autoclave. Quindi sciogliere 100 milligrammi di doxiciclina iclilato in cinque millilitri della soluzione di saccarosio in un tubo conico da 15 millilitri. Successivamente, utilizzare una siringa da 10 millilitri per filtrare sterilemente la soluzione attraverso un filtro da 0,2 micron.

Quindi aggiungere la soluzione di doxiciclina filtrata ai restanti 95 millilitri di soluzione di saccarosio e fornire la soluzione al topo invece di bere acqua. Controllare quotidianamente e sostituire immediatamente se la soluzione diventa torbida, poiché ciò indica una proliferazione batterica eccessiva. Preparare una siringa da 1 millilitro con un ago calibro 27 con un millilitro di soluzione di paraformaldeide al 4%.

Utilizzare forbici da dissezione e pinze anatomiche per eseguire una laparotomia mediana ed esporre il fegato del topo soppresso. Spostare l'intestino tenue verso destra per esporre la vena porta e la vena cava inferiore. Inserire l'ago della siringa preparata nella vena cava inferiore e tagliare la vena porta.

Iniettare lentamente un millilitro di PFA per abbondantere il tessuto epatico e rimuovere i globuli rossi autofluorescenti. Dopo aver rimosso il fegato, sciacquarlo in acqua e trasferirlo in cinque-dieci millilitri di soluzione di PFA al 4% per post-fissare prima del sezionamento. L'iniezione di un costrutto di trasposone che combina l'espressione costitutiva di una ricombinasi Cre inducibile con l'espressione inducibile di un transgene o di un shRNA di scelta in topi reporter Cre ha mostrato una robusta espressione del gene reporter GFP dopo l'attivazione della ricombinasi Cre da parte del tamoxifene.

Dopo il trattamento con doxiciclina, l'espressione del transgene inducibile può essere visualizzata da anticorpi appropriati negli epatociti trasfettati. Per l'espressione inducibile di shRNA, l'espressione citoplasmatica di GFP rilevata mediante immunocolorazione può essere utilizzata come marcatore surrogato per l'espressione di shRNA. È stato iniettato un costrutto di trasposone che ospita una cassetta di espressione della luciferasi sotto il controllo di un costrutto promotore specifico per il fegato.

Dopo l'iniezione con luciferina, i topi sono stati sottoposti a imaging utilizzando un sistema di imaging in vivo due settimane dopo l'iniezione idrodinamica della vena caudale. L'imaging ha mostrato una bioluminescenza robusta e stabile della luciferasi nel fegato 15 giorni dopo l'iniezione, dimostrando che il sistema può essere utilizzato con successo per seguire la presenza di cellule trasfettate in vivo mediante imaging a bioluminescenza. Una volta padroneggiate, le iniezioni idrodinamiche della vena caudale possono essere eseguite in circa 15 minuti, mentre l'intera procedura, dalla clonazione della nostra iniezione di topi, all'induzione dell'espressione del transgene R shRNA alla preparazione del fegato, richiederà circa tre o quattro settimane.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante tenere a mente le dimensioni e l'integrità della sequenza dei plasmidi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come applicare il sistema pTC Tet con il tuo transgene R shRNA di scelta a qualsiasi modello murino Crelux Pbase.