Name: Sistemi costitutive e inducibile per la modificazione genetica In Vivo degli epatociti Mouse usando liniezione della vena della coda idrodinamica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Scopri la trasfezione stabile degli epatociti murini in vivo mediante iniezione idrodinamica della vena della coda. Questo metodo consente l'espressione inducibile di transgeni e shRNA per studiare il cancro epatico e la rigenerazione.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato supportato da Deutsche Krebshilfe, Germania (codice di autorizzazione 111289 per UE), il Lucile Packard Foundation per salute dei bambini (Ernest e Amelia Gallo dotato Postdoctoral Fellowship - numero di concessione CTSA UL1 RR025744 per UE). Grazie Dr Mark A. Kay per vettore costrutti e consulenza sperimentale e Dr Julien Sage per topi e sperimentali supportano.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono stati approvati dalle autorità responsabili (Regierung von Oberbayern, Monaco di Baviera, Germania e Stanford istituzionale Animal Care e utilizzare Comitato, Stanford, CA, USA). In tabella supplementare S1 viene fornito un elenco di tutti i plasmidi per la clonazione (passo 1 a 4).
1. clonazione di un Transgene per espressione genica costitutiva
<ol><li>Disegnare primers per transgene amplificazione13,14.</li>
	<li>Aggiungere siti di restrizione per PacI (TTAATTAA) all'estremità 5' del primer in avanti. Aggiungere siti di restrizione per AscI (GGCGCGCC) o FseI (GGCCGGCC) all'estremità 5' del reverse primer.</li>
	<li>Amplificare il transgene mediante PCR utilizzando condizioni ottimizzate per il transgene desiderato14. Purificare utilizzando un kit di purificazione di DNA commercialmente disponibile. Nota: Tempo di ricottura dipende il primer disegnati al punto 1.1., tempo di allungamento dipende dalla lunghezza del costrutto. Ad esempio, per un costrutto di 1.000 bp durata uso 60 s di tempo di allungamento.</li>
	<li>Digerire il transgene e vettore per gene costitutivo espressione15 con nucleasi di restrizione rispettivi (Vedi punto 1.2) e buffer in un volume totale di 50 µ l a 37 ° C durante la notte. Ad esempio, digerire costrutto con 5 unità PacI e 5 unità FseI se appropriato (Vedi punto 1.2).</li>
	<li>Gel di purificare vettore digerito e inserimento utilizzando un kit di estrazione del gel commerciale secondo le istruzioni del produttore. Eseguire una legatura standard di 100 ng di vettore e 100 – 1.000 ng di inserimento mediante 400 U T4 ligasi a 14 ° C per 16 h. calore inattivare a 65 ° C per 10 min.</li>
	<li>Trasformare batteri competenti utilizzando standard calore-shock-protocollo16.</li>
	<li>Piastra su agar piastre contenenti 100 ampicillina di µ g/mL. Incubare a 30 ° C per 24 h.</li>
	<li>Scegliere singole colonie, purificare il DNA plasmidico utilizzando un kit commerciale miniprep secondo le istruzioni del produttore e verificare la sequenza di sequenziamento Sanger17 (primer di sequenziamento: 5' TGCTGGAGTTCTTCGCC 3').</li>
	<li>Utilizzare positivo colonie per maxi scala amplificazione del DNA del plasmide e purificano utilizzando un plasmide privo di endotossina preparazione kit18 secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Costrutto è pronto per l'iniezione, quindi continuare con il passaggio 5.</li>
</ol>2. clonazione di un Transgene per l'espressione genica viscoelastica
<ol><li>Disegnare primers per transgene amplificazione13,14.</li>
	<li>Aggiungere siti di restrizione per SacI (GAGCTC), SpeI (ACTAGT) o KpnI (GGTACC) all'estremità 5' del primer in avanti. Aggiungere siti di restrizione per NotI (GCGGCCGC) o XhoI (CTCGAG) all'estremità 5' del reverse primer.</li>
	<li>Amplificare il transgene mediante PCR utilizzando condizioni ottimizzate per il transgene desiderato14. Purificare utilizzando un kit di purificazione di DNA commerciale.</li>
	<li>Digerire il transgene purificato e 4 µ g di vettoriale voce (pEN_TTmcs-vettoriale, Vedi Tabella materiali)19 separatamente con nucleasi di restrizione appropriato (Vedi punto 2.2) e buffer in un volume totale di 50 µ l a 37 ° C durante la notte.</li>
	<li>Gel di purificare vettore digerito e inserimento utilizzando un kit di estrazione del gel commerciale secondo le istruzioni del produttore. Eseguire la legatura standard con 100 ng di vettore e 100 – 1.000 ng di inserto utilizzando 400 U T4 ligasi a 14 ° C per 16 h. calore inattivare a 65 ° C per 10 min.</li>
	<li>Trasformare batteri competenti utilizzando standard calore-shock-protocollo16.</li>
	<li>Piastra su agar piastre contenenti gentamicina 15 µ g/mL. Incubare a 37 ° C per 16 h.</li>
	<li>Scegliere singole colonie, purificare il DNA del plasmide e verificare inserto di sequenziamento17 utilizzando il primer forward pCEP: 5' AGAGCTCGTTTAGTGAACCG 3'. Nota: PCR sulle singole colonie può essere eseguita senza previa purificazione con primer pCEP avanti e pCEP inversa (AGA AAG CTG GGT CTA GAT ATC GCC 3' 5'). Questo passaggio può essere utile per la pre-selezione di colonie positive.</li>
	<li>Procedere al passaggio 4.</li>
</ol>3. clonazione di un miR-shRNA per Inducible Gene Knock-down
<ol><li>Progettare oligonucleotidi miR-shRNA secondo il pSLIK clonazione protocollo19. Tempri e purificare oligonucleotidi e diluire 01:20 in ddH2O.</li>
	<li>Digest 3 µ g del vettore di ingresso con 5 U BfuAI a 50 ° C per 3 h, quindi inattivare la reazione a 65 ° C per 20 min. Nota: Se si desidera co-espressione della proteina fluorescente verde (GFP), uso pEN_TTGmiRc19 come vettore di entrata, altrimenti usare pEN_TTmiRc219.</li>
	<li>Gel di purificare digerito vettoriale come descritto al punto 2.5. Eseguire la legatura standard di 100 ng di vettore e 1 µ l di purificato diluito shRNA oligonucleotidi (punto 3.1) utilizzando 400 U T4 ligasi a temperatura ambiente per 1 h. calore inattivare a 65 ° C per 10 min.</li>
	<li>Trasformare batteri competenti utilizzando standard calore-shock-protocollo16.</li>
	<li>Piastra su agar piastre contenenti gentamicina 15 µ g/mL. Incubare a 37 ° C per 16 h.</li>
	<li>Scegliere singole colonie, purificare il DNA del plasmide e inserto per verificare di sequenziamento Sanger17 (primer di sequenziamento: 5' TAGTCGACTAGGGATAACAG 3').</li>
	<li>Procedere al passaggio 4.</li>
</ol>4. recombinational clonazione per generare cloni pronto per l'iniezione
<ol><li>Mix 150 ng del vettore di ingresso (da passo 2 o 3) e 150 ng di pTC TET-vector20.</li>
	<li>Aggiungere buffer di TE per un volume totale di 8 µ l (pH = 8).</li>
	<li>Trasferire il mix di enzima di LR-clonase II (Vedi Tabella materiali) per il ghiaccio, incubare per 2 min Vortex due volte.</li>
	<li>Aggiungere 2 µ l di miscela di enzima LR-clonase II alla reazione e incubare a 25 ° C per 1 h.</li>
	<li>Fermare la reazione aggiungendo 1 µ l di proteinasi K-soluzione. Incubare a 37 ° C per 10 min.</li>
	<li>Trasformare Stbl3 batteri competenti con 2 µ l di recombinational clonazione mescolano utilizzando standard calore-shock-protocollo16.</li>
	<li>Piastra su agar piastre contenenti 100 ampicillina di µ g/mL. Incubare a 30 ° C per 24 h.</li>
	<li>Scegliere singole colonie, purificare il DNA plasmidico utilizzando un plasmide privo di endotossina preparazione kit18 secondo le istruzioni del produttore e confermare l'integrità vettoriale da di sequenziamento Sanger17 (primer di sequenziamento 5' AGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGG 3').</li>
	<li>Costrutto è pronto per l'iniezione, continuare con il passaggio 5.</li>
</ol>5. preparare la soluzione per iniezione della vena della coda idrodinamica
Nota: Preparazione di costrutti per l'espressione genica costitutiva e inducibile sono descritti nel passaggio 1, 2, 3 e 4.
<ol><li>Preparare soluzione fisiologica 0,9% sterile iniettabile (fare non uso PBS). Utilizzare il volume corrispondente a circa il 10% del peso corporeo del mouse. Esempio: per un mouse peso 20 g, preparare 2 mL di soluzione.</li>
	<li>Preparare i vettori di iniezione che sono stati purificati utilizzando un kit di purificazione plasmide privo di endotossina18 (Vedi punto 1.8 o 4.8, rispettivamente).</li>
	<li>Aggiungere 10 µ g o 15 µ g di endotossina-libero addormentata vettore costrutto (da passo 1 uso 10 µ g, da passo 4 uso 15 µ g, rispettivamente) e 1 µ g di endotossina-free pc-HSB521 per mL di soluzione fisiologica sterile.</li>
	<li>Conservare la soluzione per fino a 4 h a 4 ° C. Non congelare.</li>
</ol>6. esecuzione di iniezione della vena della coda idrodinamica
<ol><li>Utilizzare un dispositivo di ritenuta per iniezione della vena della coda (commerciale o preparati da un tubo conico da 50 mL con fori per la respirazione e per la coda). Riempire il fondo del tubo con la carta velina.</li>
	<li>Per l'iniezione, è possibile utilizzare topi di circa 8 – 10 settimane di età con pesi di 20 – 25 g.</li>
	<li>Pesare i topi prima dell'iniezione e preparare il volume di iniezione secondo il peso corporeo (corrispondente al 10% del peso corporeo, vedi punto 5.1). Preparare un 3 mL-siringa sterile con un 27 G-ago per iniezione e riempire con il volume richiesto.</li>
	<li>Posizionare il mouse nel dispositivo di ritenuta. Regolare la quantità di carta velina (Vedi punto 6.1) di lasciare solo un minimo spazio per il movimento ma abbastanza spazio per respirare.</li>
	<li>Assicurarsi che il mouse è respirando regolarmente.</li>
	<li>Caldo la coda utilizzando una lampada a raggi infrarossi per 30-60 s. attentamente attenzione ai segni di surriscaldamento.</li>
	<li>Pulire la coda con un tampone imbevuto di alcool.</li>
	<li>Inserire l'ago quasi orizzontalmente in uno delle due vene coda laterale vicino alla base della coda. Nota: Se posizionato correttamente, una piccola quantità di sangue potrebbe fluire nuovamente dentro il cono dell'ago. Non è consigliabile per aspirare attivamente come qualsiasi ulteriore movimento dell'ago può provocare la sua cilindrata e/o lesioni della vena.</li>
	<li>Iniettare il volume totale in vena caudale entro 8-10 s.</li>
	<li>Rimuovere immediatamente il mouse dal dispositivo di ritenuta. Comprimere iniezione ferita per almeno 30 s o fino alla scomparsa del qualsiasi sanguinamento.</li>
	<li>Posizionare il mouse in una gabbia separata. Una volta che il mouse ha recuperato dalla procedura (circa 30 – 60 minuti), è possibile trasferire il mouse torna alla sua gabbia originale. Controllare il mouse regolarmente per il prossimo 24 h. Nota: Lieve sedazione del mouse ordinariamente è osservato per fino a 2 h dopo l'iniezione.</li>
	<li>Prima di procedere con ulteriori esperimenti (cioè, passaggio 7), attendere 10-15 giorni per la liquidazione dei vettori non integrati.</li>
</ol>7. induzione di CreER trasfettate con il tamoxifene
Attenzione: Il tamoxifene è nocivo, può essere cancerose o nuocere alla fertilità. Fare riferimento alla scheda di dati di sicurezza.
<ol><li>Pianificare le iniezioni intraperitoneali tamoxifen per tre giorni consecutivi.</li>
	<li>Il giorno 1, sciogliere 10 mg di tamoxifene in etanolo al 40 µ l. Incubare a 55 ° C per 10 min. vortice più volte fino a sciolta il tamoxifen.</li>
	<li>Aggiungere olio di mais 960 µ l. Incubare per 5 minuti a 55 ° C. Vortice diverse volte per ottenere una soluzione limpida.</li>
	<li>Preparare la soluzione in una siringa da insulina 1 mL con ago 27G.</li>
	<li>Collottola del mouse afferrando il collo del mouse attentamente con il pollice e il secondo dito, la coda tra la base della mano e il quarto e il quinto dito di fissaggio.</li>
	<li>Iniettare 0,1 mL (= 1 mg di tamoxifene) della soluzione per via intraperitoneale nel quadrante inferiore sinistro dell'addome.</li>
	<li>Ripetere le iniezioni in giorni due e tre.</li>
</ol>8. induzione del Gene tetraciclina-dipendente o shRNA espressione
Attenzione: Doxiciclina può essere dannosa. Fare riferimento alla scheda di dati di sicurezza.
Nota: A seconda del tipo e la durata dell'esperimento, doxiciclina possa essere fornita in acqua potabile (punto 8.1) o chow (punto 8.2)
<ol><li>
Per esperimenti di breve termine (< 10 giorni) amministrare doxiciclina via acqua potabile utilizzando il seguente protocollo.
	<ol>
<li>Sciogliere 5 g di saccarosio in 100 mL di acqua di rubinetto. Sterilizzare in autoclave.</li>
		<li>Sciogliere 100 mg di doxiciclina-hyclate in 5 mL di soluzione di saccarosio (punto 8.1.1) in una provetta conica da 15 mL.</li>
		<li>Utilizzando una siringa 10 mL, filtro sterile la soluzione attraverso un filtro di 0,2 µm. Aggiungere alla soluzione di saccarosio preparata al punto 8.1.1.</li>
		<li>Fornitura di doxiciclina-saccarosio soluzione come acqua potabile per il mouse. Controllare tutti i giorni e sostituirlo quando la soluzione diventa torbida che indica la crescita eccessiva batterica (sostituire la soluzione limpida dopo tre giorni al più tardi).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per gli esperimenti a lungo termine (> 10 giorni) o esperimenti sensibili a cambiamenti metabolici, utilizzare doxiciclina-chow commerciale (ad es., Doxycycline Hyclate Chow 0,625 g/kg) per evitare la disidratazione e/o cambiamenti indotti da saccarosio nei fegati degli animali trattati.</li>
</ol>9. preparazione del fegato del topo per analisi immunostaining
Attenzione: Paraformaldeide può essere dannoso. Fare riferimento alla scheda di dati di sicurezza.
Nota: Il timepoint quando saranno analizzati topi dipende l'esperimento. Si raccomanda di analizzare il tessuto del fegato dopo non meno di tre giorni di trattamento doxiciclina per garantire sufficiente induzione dell'espressione del transgene o shRNA.
<ol><li>Preparare una siringa da 1 mL con ago 27G con 1 mL di soluzione di paraformaldeide 4% (PFA).</li>
	<li>Eutanasia il mouse mediante un metodo appropriato secondo un protocollo approvato animale. Nota: Le linee guida per i metodi appropriati di eutanasia possono variare a seconda dell'istituzione.</li>
	<li>Con delle forbici per dissezione, pinze anatomiche, aprire con cautela la cavità addominale con una laparotomia mediana per esporre il fegato. Spostare il piccolo intestino a destra per esporre la vena porta e la vena cava inferiore (IVC).</li>
	<li>Inserire l'ago della siringa preparata (Vedi punto 9.1) nell'IVC e taglio della vena portale. Iniettare 1 mL di PFA lentamente nella VCI per irrorare il tessuto del fegato e rimuovere auto-fluorescente globuli rossi (auspicabile se macchiatura immunofluorescente verrà eseguita).</li>
	<li>Rimuovere il fegato. Risciacquare in acqua e trasferire al 5 – 10 mL di soluzione al 4% PFA.</li>
	<li>Per sezioni di paraffina, tessuto di correzione per 36 – 48 h. tessuto è pronto per disidratazione e inclusione in paraffina.</li>
	<li>
Per sezioni congelate, difficoltà del tessuto in 4% PFA per 1 h.
	<ol>
<li>Per crioprotezione, trasferire alla soluzione di saccarosio al 10%. Incubare per 60 minuti.</li>
		<li>Trasferimento a soluzione di saccarosio al 20%. Incubare per 60 minuti.</li>
		<li>Trasferimento a soluzione di saccarosio al 30%. Incubare per 12 – 16 h. Embed in incorporamento composto per sezioni congelate e congelare a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Byass, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+liver+disease%3A+a+challenge+for+methods+and+for+public+health%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">The global burden of liver disease: a challenge for methods and for public health.</a> BMC Med. 12, 159(2014).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+chronic+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Animal models of chronic liver diseases.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (5), G449-G468 (2013).</li>
<li>Frese, K. K., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+mouse+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Maximizing mouse cancer models.</a> Nat Rev Cancer. 7 (9), 645-658 (2007).</li>
<li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+reverse+tet-transactivator+mouse+strains+for+the+efficient+induction+of+TRE-regulated+transgenes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Conditional reverse tet-transactivator mouse strains for the efficient induction of TRE-regulated transgenes in mice.</a> PLoS One. 9 (4), e95236(2014).</li>
<li>Lundstrom, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latest+development+in+viral+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Latest development in viral vectors for gene therapy.</a> Trends Biotechnol. 21 (3), 117-122 (2003).</li>
<li>Liu, F., Song, Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamics-based+transfection+in+animals+by+systemic+administration+of+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA.</a> Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).</li>
<li>Kanefuji, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamics+of+a+hydrodynamic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Hemodynamics of a hydrodynamic injection.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14029(2014).</li>
<li>Ivics, Z., Izsvak, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+Beauty+Transposition%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Sleeping Beauty Transposition.</a> Microbiol Spectr. 3 (2), (2015).</li>
<li>Hausl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactive+sleeping+beauty+transposase+enables+persistent+phenotypic+correction+in+mice+and+a+canine+model+for+hemophilia+B%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Hyperactive sleeping beauty transposase enables persistent phenotypic correction in mice and a canine model for hemophilia B.</a> Mol Ther. 18 (11), 1896-1906 (2010).</li>
<li>Doyle, A., McGarry, M. P., Lee, N. A., Lee, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+construction+of+transgenic+and+gene+knockout%2Fknockin+mouse+models+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">The construction of transgenic and gene knockout/knockin mouse models of human disease.</a> Transgenic Res. 21 (2), 327-349 (2012).</li>
<li>Hubner, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+transfection+system+for+inducible+gene+expression+and+gene+silencing+in+murine+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes.</a> J Gene Med. 19 (1-2), (2017).</li>
<li>Katzen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway%28%28R%29%29+recombinational+cloning%3A+a+biological+operating+system%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Gateway((R)) recombinational cloning: a biological operating system.</a> Expert Opin Drug Discov. 2 (4), 571-589 (2007).</li>
<li>Chuang, L. Y., Cheng, Y. H., Yang, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+primer+design+for+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Lett%22%5BJournal%5D)">Specific primer design for the polymerase chain reaction.</a> Biotechnol Lett. 35 (10), 1541-1549 (2013).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Ehmer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+size+control+is+dominant+over+Rb+family+inactivation+to+restrict+proliferation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Organ size control is dominant over Rb family inactivation to restrict proliferation in vivo.</a> Cell Rep. 8 (2), 371-381 (2014).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J Vis Exp. (6), e253(2007).</li>
<li>Sanger, F., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+determining+sequences+in+DNA+by+primed+synthesis+with+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase.</a> J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).</li>
<li>Koontz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explanatory+chapter%3A+how+plasmid+preparation+kits+work%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Explanatory chapter: how plasmid preparation kits work.</a> Methods Enzymol. 529, 23-28 (2013).</li>
<li>Shin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+lentiviral+vector+platform+for+microRNA-based+conditional+RNA+interference+and+coordinated+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A single lentiviral vector platform for microRNA-based conditional RNA interference and coordinated transgene expression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13759-13764 (2006).</li>
<li>Hubner, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+transfection+system+for+inducible+gene+expression+and+gene+silencing+in+murine+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes.</a> J Gene Med. , (2016).</li>
<li>Yant, S. R., Huang, Y., Akache, B., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+transposon+integration+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Site-directed transposon integration in human cells.</a> Nucleic Acids Res. 35 (7), e50(2007).</li>
<li>Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+foreign+gene+expression+in+hepatocytes+after+tail+vein+injections+of+naked+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA.</a> Hum Gene Ther. 10 (10), 1735-1737 (1999).</li>
<li>Maruyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+expression+of+naked+DNA+delivered+to+rat+liver+via+tail+vein+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection.</a> J Gene Med. 4 (3), 333-341 (2002).</li>
<li>Bell, J. B., Aronovich, E. L., Schreifels, J. M., Beadnell, T. C., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duration+of+expression+and+activity+of+Sleeping+Beauty+transposase+in+mouse+liver+following+hydrodynamic+DNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Duration of expression and activity of Sleeping Beauty transposase in mouse liver following hydrodynamic DNA delivery.</a> Mol Ther. 18 (10), 1796-1802 (2010).</li>
<li>Brunetti-Pierri, N., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+inborn+errors+of+liver+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Metab%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for inborn errors of liver metabolism.</a> Mol Genet Metab. 86 (1-2), 13-24 (2005).</li>
<li>Atta, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+liver+regeneration%3A+experimental+studies+and+prospects+for+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for liver regeneration: experimental studies and prospects for clinical trials.</a> World J Gastroenterol. 16 (32), 4019-4030 (2010).</li>
<li>Malato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+tracing+of+mature+hepatocytes+in+mouse+liver+homeostasis+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration.</a> J Clin Invest. 121 (12), 4850-4860 (2011).</li>
<li>Weber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+somatic+multiplex-mutagenesis+for+high-throughput+functional+cancer+genomics+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), 13982-13987 (2015).</li>
<li>Viecelli, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+phenylketonuria+using+minicircle-based+naked-DNA+gene+transfer+to+murine+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Treatment of phenylketonuria using minicircle-based naked-DNA gene transfer to murine liver.</a> Hepatology. 60 (3), 1035-1043 (2014).</li>
<li>Delerue, F., White, M., Ittner, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible%2C+tightly+regulated+and+non-leaky+neuronal+gene+expression+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Inducible, tightly regulated and non-leaky neuronal gene expression in mice.</a> Transgenic Res. 23 (2), 225-233 (2014).</li>
<li>Izsvak, Z., Ivics, Z., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+Beauty%2C+a+wide+host-range+transposon+vector+for+genetic+transformation+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Sleeping Beauty, a wide host-range transposon vector for genetic transformation in vertebrates.</a> J Mol Biol. 302 (1), 93-102 (2000).</li>
<li>Koponen, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxycycline-regulated+lentiviral+vector+system+with+a+novel+reverse+transactivator+rtTA2S-M2+shows+a+tight+control+of+gene+expression+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Doxycycline-regulated lentiviral vector system with a novel reverse transactivator rtTA2S-M2 shows a tight control of gene expression in vitro and in vivo.</a> Gene Ther. 10 (6), 459-466 (2003).</li>
<li>Saitoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-dependent+doxycycline-mediated+adrenocorticotropic+hormone+secretion+from+encapsulated+Tet-on+proopiomelanocortin+Neuro2A+cells+in+the+subarachnoid+space%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Dose-dependent doxycycline-mediated adrenocorticotropic hormone secretion from encapsulated Tet-on proopiomelanocortin Neuro2A cells in the subarachnoid space.</a> Hum Gene Ther. 9 (7), 997-1002 (1998).</li>
<li>Yao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+Inducible+Triple-Transgenic+Mouse+Model+for+Rapid+Real-Time+Detection+of+HCV+NS3%2F4A+Protease+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Conditional Inducible Triple-Transgenic Mouse Model for Rapid Real-Time Detection of HCV NS3/4A Protease Activity.</a> PLoS One. 11 (3), e0150894(2016).</li>
<li>Santacatterina, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+oxidative+phosphorylation+in+the+liver+by+expression+of+the+ATPase+inhibitory+factor+1+induces+a+tumor-promoter+metabolic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of oxidative phosphorylation in the liver by expression of the ATPase inhibitory factor 1 induces a tumor-promoter metabolic state.</a> Oncotarget. 7 (1), 490-508 (2016).</li>
<li>Hojman, P., Eriksen, J., Gehl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet-On+induction+with+doxycycline+after+gene+transfer+in+mice%3A+sweetening+of+drinking+water+is+not+a+good+idea%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Tet-On induction with doxycycline after gene transfer in mice: sweetening of drinking water is not a good idea.</a> Anim Biotechnol. 18 (3), 183-188 (2007).</li>
<li>Cawthorne, C., Swindell, R., Stratford, I. J., Dive, C., Welman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+doxycycline+delivery+methods+for+Tet-inducible+gene+expression+in+a+subcutaneous+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Tech%22%5BJournal%5D)">Comparison of doxycycline delivery methods for Tet-inducible gene expression in a subcutaneous xenograft model.</a> J Biomol Tech. 18 (2), 120-123 (2007).</li>
<li>Yuan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+HBV-tolerant+immunocompetent+model+that+effectively+simulates+chronic+hepatitis+B+virus+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Anim%22%5BJournal%5D)">An HBV-tolerant immunocompetent model that effectively simulates chronic hepatitis B virus infection in mice.</a> Exp Anim. , (2016).</li>
<li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPB5-Mediating+Protein+Suppresses+Hepatitis+B+Virus+%28HBV%29+Transcription+and+Replication+by+Counteracting+the+Transcriptional+Activation+of+Hepatitis+B+virus+X+Protein+in+HBV+Replication+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Jundishapur+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">RPB5-Mediating Protein Suppresses Hepatitis B Virus (HBV) Transcription and Replication by Counteracting the Transcriptional Activation of Hepatitis B virus X Protein in HBV Replication Mouse Model.</a> Jundishapur J Microbiol. 8 (9), e21936(2015).</li>
<li>Yagai, T., Miyajima, A., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+3E+secreted+by+damaged+hepatocytes+regulates+the+sinusoidal+regeneration+and+liver+fibrosis+during+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Semaphorin 3E secreted by damaged hepatocytes regulates the sinusoidal regeneration and liver fibrosis during liver regeneration.</a> Am J Pathol. 184 (8), 2250-2259 (2014).</li>
<li>Tordella, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF+regulates+a+transcriptional+program+that+induces+senescence+to+prevent+liver+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF regulates a transcriptional program that induces senescence to prevent liver cancer.</a> Genes Dev. 30 (19), 2187-2198 (2016).</li>
<li>Ogata, K., Selvaraj, S. R., Miao, H. Z., Pipe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+factor+VIII+B+domain+missense+mutations+are+unlikely+to+be+causative+mutations+for+severe+hemophilia+A%3A+implications+for+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Most factor VIII B domain missense mutations are unlikely to be causative mutations for severe hemophilia A: implications for genotyping.</a> J Thromb Haemost. 9 (6), 1183-1190 (2011).</li>
<li>Vercellotti, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H-ferritin+ferroxidase+induces+cytoprotective+pathways+and+inhibits+microvascular+stasis+in+transgenic+sickle+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">H-ferritin ferroxidase induces cytoprotective pathways and inhibits microvascular stasis in transgenic sickle mice.</a> Front Pharmacol. 5, 79(2014).</li>
<li>Ando, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+adverse+events+of+interferon+gamma+gene+therapy+by+gene+delivery+of+interferon+gamma-heparin-binding+domain+fusion+protein+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Prevention of adverse events of interferon gamma gene therapy by gene delivery of interferon gamma-heparin-binding domain fusion protein in mice.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14023(2014).</li>
<li>Watcharanurak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+immunological+balance+by+sustained+interferon-gamma+gene+transfer+for+acute+phase+of+atopic+dermatitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Regulation of immunological balance by sustained interferon-gamma gene transfer for acute phase of atopic dermatitis in mice.</a> Gene Ther. 20 (5), 538-544 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare

Transfezione di epatociti con l'iniezione della vena della coda idrodinamica è diventato un metodo stabilito sin dalla sua introduzione più di 15 anni fa6. Il volume iniettato supera la gittata cardiaca e confluisce dalla vena cava inferiore i sinusoids del fegato7, che conduce alla trasfezione di circa 10-20%, in alcuni casi fino al 40% di epatociti25,26. Predittori di una riuscita transfezione sono il volume iniet...

L'affezione epatica cronica presenta un onere importante di salute nel mondo1. Modelli di ricerca sugli animali sono strumenti essenziali nello studio delle malattie epatiche e hanno contribuito a rispondere alle domande complesse nella rigenerazione del fegato, infiammazione epatica e steatosi, così come il cancro del fegato2. Un numero considerevole di questi modelli animali si basa sulla modificazione genetica delle cellule del fegato. Efficienti strumenti per manipolare l'espressione genica in epatociti sono pertanto utili3. Metodi consolidati come l'allevamento di ceppi di topi geneticamente o la generazione di vettori virali per l'infezione dell'epatocita sono entrambi harbor richiede tempo, problemi di sicurezza, o cedere l'espressione del transgene poveri in epatociti in vivo 4 , 5. iniezione della vena della coda idrodinamica (HTVI) è un metodo alternativo per la transfezione in vivo degli epatociti che consente per l'interrogatorio di facile, veloce e conveniente di funzione del gene nel fegato. Per HTVI, un vettore contenente la sequenza di DNA desiderata è dissolto in un volume di soluzione fisiologica corrispondente al 10% del peso corporeo dell'animale iniettato. La soluzione allora è iniettata nella vena della coda entro 5-10 s6. Superiore a gittata cardiaca, le saline scorre dalla vena cava inferiore nelle vene del fegato, che porta all'espansione del fegato e idrodinamica transfezione di epatociti7. Per realizzare l'integrazione genomica stabile, il metodo è stato combinato con vettori basati su trasposone, quali il sistema di trasposone dormire bellezza. Sistemi di questo media la ricombinazione dei vettori di destinazione con i siti di ricombinazione genomica catalizzate da un sonno bellezza -transposase8,9. Per i modelli di fibrosi del fegato o di carcinogenesi, è spesso desiderabile ai geni iperesprimere o silenzio determinati intervalli di tempo del modello di malattia. Per questo scopo, strumenti per l'espressione genica viscoelastica come Cre/LoxP-sistema o il sistema di espressione del gene tetraciclina-inducibile (Tet-On) può essere usato10.
Qui, descriviamo un protocollo per la transfezione in vivo di epatociti murini utilizzando HTVI di un sistema basato su trasposone addormentata . Oltre a un protocollo per l'espressione stabile, costitutiva di un transgene sotto il controllo di un promotore di fegato-specific, descriviamo un sistema più avanzato di vettore che unisce l'espressione costitutiva di tamoxifen-dipendente Cre ricombinasi (CreER) con la induzione dell'espressione genica di un transgene o shRNA adattato microRNA (miR-shRNA), chiamato il pTC TET-sistema11. In questo sistema vettoriale, transgeni inducibile o miR-shRNA per espressione tetraciclina-dipendente vengono clonati nel vettore backbone con un sistema di clonazione recombinational, permettendo la generazione facile e veloce di nuovi vettori12. Questa guida basate su video descrive la preparazione di opportuni vettori, iniezione e il trattamento dei topi per ottenere l'espressione del transgene/miR-shRNA viscoelastica ed infine la preparazione del tessuto del fegato per l'analisi. Il metodo descritto in questo protocollo è stato progettato per consentire la combinazione di qualsiasi sistema di topo Cre/loxP mediato con l'espressione o knock-down di qualsiasi gene di scelta, che lo rende un sistema ampiamente applicabile nella ricerca dell'affezione epatica.

<table><tbody><tr><td>General Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder</td><td>Thermo Fisher</td><td>#SM1331</td><td>Scala DNA per elettroforesi</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T.</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>inclusione di criosezioni</td></tr><tr><td>Biozym LE Agarose</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Saccharose</td><td>Carl Roth</td><td>4621.1</td><td>Per l'addolcimento della soluzione di doxiciclina</td></tr><tr><td>Ampicillina Sale sodico</td><td>AppliChem</td><td>A0839,0010</td><td>Per la selezione di cloni</td></tr> <tr>resistenti all'Amp<td>LB Agar (Luria/Miller)</td><td>Carl Roth</td><td>X969.1</td><td></td></tr><tr><td>LB Brodo (Luria/Miller)</td><td>Carl Roth</td><td>X968.1</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. Medium</td><td>Thermo Fischer</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina solfato</td><td>AppliChem</td><td>A1492,0001</td><td>Per la selezione di cloni resistenti alla gentamicina</td></tr><tr><td>Roti-Histofix 4 %</td><td>Fa. Roth</td><td>P087.6</td><td>soluzione para-formaldeide</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligasi</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>GatewayTM LR ClonaseTM II Mix enzimatico</td><td>invitrogen/ThermoFisher</td><td>11791-020</td><td>contiene LR-clonasi Mix enzimatico II e proteinasi K</td></tr><tr><td>DB3.1 Cellule competenti</td><td>Thermo Fisher</td><td>11782-018</td><td></td></tr><tr><td>Stbl3 E. coli chimicamente competente</td><td>Thermo Fisher</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Enzimi di restrizione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0547S</td><td></td></tr><tr><td>AscI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0558S</td><td></td></tr><tr><td>FseI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0588S</td><td></td></tr><tr><td>SacI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0156S</td><td></td></tr><tr><td>SpeI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>BfuAI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0701S</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Per l'estrazione del DNA dal gel</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel e PCR Clean Up</td><td>Macherey & Nagel</td><td>740609.10</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond PC20</td><td>Macherey & Nagel</td><td>740571</td><td>Estrazione di plasmidi (Mini prep)</td></tr><tr><td>NucleoBond PC500</td><td>Macherey & Nagel</td><td>740574</td><td>Estrazione plasmidico (Maxi preparazione)</td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà</td><td>Thermo Fisher</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Materiali per esperimenti sui topi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Injekt Siringa F 1 ml</td><td>Braun</td><td>9166017V</td><td>Per iniezione intraperitoneale</td></tr><tr><td>Omnifix Luer 3 ml</td><td>Braun</td><td>4616025V</td><td>Per iniezione endovenosa</td></tr><tr><td>Cannula Sterican 24G Cannula Sterican 24G</td><td>4657675</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cannula Sterican 27G</td><td>Braun</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td>Per attivazione CreER</td></tr><tr><td>Olio di mais</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8267-500ML</td><td>Vettore per iniezioni di tamoxifene</td></tr><tr><td>Doxiciclina iclilato</td><td>AppliChem</td><td>A2951,0025</td><td>Attivazione dell'espressione tetraciclina-dipendente</td></tr><tr><td>Injekt 10 ml Siringa</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S 0.2</td><td>Sarstedt</td><td>831,826,001</td><td>Per la filtrazione della doxiciclina</td></tr><tr><td>NaCl 0,9%</td><td>Braun</td><td>3200905</td><td>Carrier per iniezioni endovenose Falcon</td></tr><tr><td>Tubo conico 50ml</td><td>Corning Life Science</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Lampada a infrarossi</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Per il riscaldamento della coda di topo</td></tr><tr><td>IVIS</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>Sistema di imaging in vivo</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Plasmidi per la clonazione di vettori di trasposoni della bella addormentata per HTVI.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pTC</td><td></td><td>n/a</td><td>Vettore per l'espressione genica costitutiva, ref. 15</td></tr><tr><td>pEN_TTmcs</td><td></td><td>Addgene #25755</td><td>Vettore di ingresso per l'espressione genica inducibile, ref. 19</td></tr><tr><td>pEN_TTGmiRc2</td><td></td><td>Addgene #25753</td><td>Vettore di ingresso per l'espressione inducibile di miR-shRNA con co-espressione di GFP, rif. 19</td></tr><tr><td>pEN_TTmiRc2</td><td></td><td>Addgene #25752</td><td>Vettore di ingresso per l'espressione inducibile di miR-shRNA senza co-espressione di GFP, rif. 19</td></tr><tr><td>pTC ApoE-Tet</td><td></td><td>Addgene #85578</td><td>Vettore di espressione per l'espressione di un gene inducibile o di miR-shRNA con il promotore ApoE.HCR.hAAT, ref. 11</td></tr><tr><td>pTC-CMV-Tet</td><td></td><td>Addgene #85577</td><td>Vettore di espressione per l'espressione di un gene inducibile o di miR-shRNA con promotore di CMV, rif. 11</td></tr></tbody></table>

sistemi costitutive e inducibile per la modificazione genetica in vivo degli epatociti mouse usando l'iniezione della vena della coda idrodinamica

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Nei modelli di ricerca di cancro del fegato, di rigenerazione, di infiammazione e di fibrosi, sistemi flessibili per in vivo l'espressione genica e silenziamento sono molto utili. Iniezione della vena della coda idrodinamica dei costrutti basati su trasposone è un metodo efficiente per la manipolazione genetica degli epatociti in topi adulti. Oltre l'espressione costitutiva del transgene, questo sistema può essere utilizzato per applicazioni più avanzate, come implicazione di colpo, di shRNA-mediata del gene del sistema CRISPR/Cas9 per indurre mutazioni del gene, o sistemi di viscoelastici. Qui, la combinazione dell'espressione costitutiva CreER insieme espressione inducibile di un transgene o miR-shRNA di scelta si presenta come un esempio di questa tecnica. Copriamo la procedura multi-step a partire dalla preparazione della bella addormentata-trasposone costruisce, per l'iniezione e il trattamento dei topi e la preparazione del tessuto del fegato per analisi immunostaining. Il sistema presentato è un approccio affidabile ed efficiente per realizzare complesse manipolazioni genetiche negli epatociti. È particolarmente utile in combinazione con ceppi di topi Cre/loxP-based e può essere applicato ad una varietà di modelli nella ricerca dell'affezione epatica.

L'efficacia di transfezione di iniezione della vena della coda idrodinamica: La percentuale di epatociti murini che transfected idrodinamicamente tramite una singola iniezione è variabile e dipende da diversi parametri come il volume di iniezione, il tempo di iniezione, la quantità di DNA iniettato e dimensione del costrutto iniettato6, 22,23. Inoltre, l'efficienza di trasfezion...

Iniezione della vena della coda idrodinamica di vettori di integrazione basata su trasposone consente trasfezione stabile di epatociti murini in vivo. Qui, presentiamo un protocollo pratico per sistemi di transfezione che consente l'espressione costitutiva a lungo termine di un transgene singolo o combinato espressione costitutiva e doxiciclina-viscoelastico di un transgene o miR-shRNA nel fegato.

Sistemi costitutive e inducibile per la modificazione genetica In Vivo degli epatociti Mouse usando l'iniezione della vena della coda idrodinamica

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

L'obiettivo generale di questo metodo è la trasfezione stabile di epatociti in vivo, con costrutti vettoriali per l'espressione di geni inducibili o shRNA. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sul fegato. Ad esempio, può essere applicato per studiare i meccanismi del cancro al fegato e della rigenerazione.Il vantaggio principale di questa tecnica è l'espressione combinata di CreER insieme all'espressione inducibile del transgene R shRNA negli epatociti di topo in vivo, ottenuta mediante iniezione idrodinamica della vena caudale. A dimostrare la procedura sarà Eric Hübner, uno studente di medicina del nostro laboratorio. Inizia combinando 150 nanogrammi di vettore di ingresso contenente l'RNA a forcina corta per la proteina bersaglio con 150 nanogrammi di vettore pTC Tet e tampone TE per un volume totale di otto microlitri.Quindi trasferire la miscela di enzimi LR clonasi II nel ghiaccio e incubare per due minuti. Vortice due volte durante l'incubazione. Quindi aggiungere due microlitri di miscela di enzimi LR clonasi II alla reazione e incubare a 25 gradi Celsius per un'ora.Dopo l'incubazione, arrestare la reazione aggiungendo un microlitr

constitutive-inducible-systems-for-genetic-vivo-modification-mouse

Research

Ricerca

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Questo video descrive una procedura per il knockout del gene bersaglio utilizzando un sistema Cre-ricombinasi inducibile dal tamoxifene dopo l'iniezione intraperitoneale di tamoxifene in un modello murino.

Inattivazione del gene bersaglio basata sul sistema CreER-LoxP: un sistema di ricombinasi Cre inducibile dal tamoxifene per il knockout del gene bersaglio in un modello murino

Questo video dimostra il sistema di espressione genica della tetraciclina, o Tet-On, in un modello murino. In presenza di doxiciclina, un derivato della tetraciclina, il sistema Tet-On costituito da una proteina transattivatrice controllata da tetraciclina inversa si attiva ed esprime il gene di interesse.

Espressione genica basata su un sistema regolabile inducibile Tet-On in vivo: un sistema di espressione genica indotta da tetraciclina per l'attivazione della trascrizione genica bersaglio in un modello murino

Questo video descrive la tecnica di trasfezione genetica in vivo di epatociti murini mediante iniezione idrodinamica della vena caudale. Questo sistema di trasfezione genera un'espressione a lungo termine del transgene negli epatociti.

Consegna genica idrodinamica: una tecnica per la trasfezione in vivo di DNA esogeno in epatociti murini tramite iniezione della vena caudale

In trasfezione in vivo di DNA nudo dal gene delivery idrodinamico introduce geni nel tessuto di un animale con risposta infiammatoria minima. Quantità sufficiente di prodotto genico sono generate in modo tale che la funzione del gene e la regolazione così come la struttura e la funzione della proteina possono essere analizzati.

Espressione transiente di proteine ​​da parte idrodinamica Gene Consegna in topi

Qui, presentiamo un nuovo modello di fegato di topo umanizzato generato in topi knockout cellulare mediato dal recettore della tossina Alb (TRECK)/SCID a seguito del trapianto di cellule staminali epatiche umane immature ed espandibili.

Generazione di un umanizzato mouse Fegato Utilizzando epatici umani cellule staminali

Il cluster regolarmente intervallate proteine brevi ripetizioni/CRISPR palindromi associato 9 (CRISPR/Cas9) sistema fornisce uno strumento promettente per l'ingegneria genetica e apre la possibilità di integrazione mirata dei transgeni. Descriviamo un fine omologia-mediata entrare (HMEJ)-base di strategia per DNA efficiente mirata integrazione in vivo e mirate terapie geniche utilizzando CRISPR/Cas9.

Integrazione mirata CRISPR/Cas9-mediata In Vivo usando una strategia basata su unendo fine omologia-mediata

Qui presentiamo un protocollo per la manipolazione del gene specifico in topi. Nell'ambito dell'anestesia, i cuori di topo sono stati esternalizzati attraverso il quarto spazio intercostale. Successivamente, gli adenovirus codifica specifici geni sono stati iniettati con una siringa nel miocardio, seguito dalla misura di espressione della proteina in vivo imaging e Western blot analisi.

Un metodo semplice ed efficace per In Vivo manipolazione del Gene specifico tramite l'iniezione intramiocardica in topi

Qui, presentiamo un protocollo per generare un modello del mouse chimerici del fegato umano di hypercholesterolemia familiare facendo uso degli epatociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane. Si tratta di un modello valido per testare nuove terapie per ipercolesterolemia.

Un modello di Mouse chimerici del fegato umano di ipercolesterolemia familiare facendo uso degli epatociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte

La traduzione della purificazione dell'affinità dei ribosomi (TRAP) consente un isolamento rapido ed efficiente dell'mRNA di traslazione specifico del tipo di cellula. Qui, dimostriamo un metodo che combina l'iniezione idrodinamica della vena della coda in un modello murino di ripopolamento e del trap per esaminare il profilo di espressione degli epatociti ripopolamento.

Profiling dell'espressione genica specifica del tipo di cella nel fegato del mouse

Questo protocollo descrive le tecniche per isolare gli epatociti primari di topo dal fegato e l'elettroporazione di CRISPR-Cas9 come ribonucleoproteine e mRNA per interrompere un gene bersaglio terapeutico associato a una malattia metabolica ereditaria del fegato. I metodi descritti determinano un'elevata vitalità e alti livelli di modificazione genica dopo l'elettroporazione.

Somministrazione mediata da elettroporazione di ribonucleoproteine Cas9 e mRNA in epatociti primari di topo appena isolati

Questo protocollo descrive la microiniezione e l'elettroporazione in vivo per l'editing del genoma mediato da CRISPR limitato a livello regionale nell'ovidotto del topo.

Modelli murini di ingegneria genomica somatica mediante microiniezione ed elettroporazione in vivo

Scopri la trasfezione stabile degli epatociti murini in vivo mediante iniezione idrodinamica della vena della coda. Questo metodo consente l'espressione inducibile di transgeni e shRNA per studiare il cancro epatico e la rigenerazione.

Sistemi costitutive e inducibile per la modificazione genetica In Vivo degli epatociti Mouse usando liniezione della vena della coda idrodinamica (Video) | JoVE Journal

Sistemi costitutive e inducibile per la modificazione genetica In Vivo degli epatociti Mouse usando l'iniezione della vena della coda idrodinamica

Esplora altri video