Name: Microscopia di immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1 per analizzare la formazione e la riparazione di rotture a doppio filamento del DNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Impara la microscopia di immunofluorescenza per γH2AX e 53BP1 per analizzare la formazione e la riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA nelle cellule tumorali. Questo metodo consente la visualizzazione di singole lesioni.

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Il progetto è stato sostenuto dalla Fondazione tedesca José Carreras leucemia (14 DJCLS R/2017).

tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal Comitato etica II della Mannheim facoltà medica dell'Università di Heidelberg. Scritto il consenso informato è stato ottenuto da tutti gli individui.
 1. preparazione dei materiali <ol><li>di soluzione anticoagulante: preparare una soluzione di riserva dell'anticoagulante dell'eparina a 200 UI / mL in sodio cloruro 0,9%. Riempire ciascuna delle provette di raccolta (disegnare il volume 9 mL) con 2 mL di soluzione di riserva dell'anticoagulante prima del prelievo dei campioni di sangue o midollo osseo.</li>
	<li>Soluzione di lisi di cellule rosse: preparare il 10 x soluzione di lisi per cellule rosse con 82,91 g di cloruro di ammonio, bicarbonato di ammonio 7,91 g e 2 mL di soluzione di acido etilendiamminotetracetico 0,5 M ad un pH di 8,0 sciogliendo gli agenti in acqua bidistillata per un volume totale di 1 L.</li>
	<li>Soluzione di fissazione: 8.3 aggiungere µ l di una soluzione di idrossido di potassio di 1 M di paraformaldeide 360 mg (PFA) in un tubo di microtitolo. Riempire il tubo con tamponato fosfato salino (PBS) fino alla tacca 1 mL del tubo e di calore del tubo in un blocco di riscaldamento a 95 ° C per ottenere 1 mL di una soluzione PFA del 36%. Trasferire la soluzione PFA 36% 1 mL in una provetta con una capacità di 15 mL. Aggiungere 8 mL di PBS alla soluzione 1 mL 36% PFA, per ottenere 9 mL di una soluzione madre di PFA 4%. Aliquota del 4% soluzione di riserva di PFA e conservare a-18 ° C fino a utilizzare per la fissazione delle cellule. 
	Attenzione: la soluzione di idrossido di potassio 1) è corrosivo. Essere consapevoli di protezione degli occhi e della pelle. 2) PFA è cancerogeno. Evitare il contatto con la pelle e l'inalazione. Preparare la soluzione di fissaggio sotto un cofano.</li>
	<li>Soluzione di permeabilizzazione: aggiungere 50 µ l octoxinolo 9 a 50 mL di PBS per ottenere una soluzione di circa 0.1% octoxinolo 9.</li>
	<li>Soluzione bloccante: preparare 5% e 2% soluzioni di blocco di miscelazione l'agente bloccante della proteina con PBS e store a 6 &#8211; 8 ° C.</li>
</ol> 2. Preparazione dei campioni <ol><li>fibroblasti in coltura delle cellule: coltivare fibroblasti umani della linea cellulare NHDF in un umidificata 5% CO 2 atmosfera a 37 ° C in RPMI 1640 supplementato con 10% siero fetale di vitello, 4 mM Glutammina e 1% di penicillina/streptomicina.
	<ol><li>Preparazione di un vetrino da microscopio con aderente fibroblasti <ol><li>rimuovere il supporto dal pallone (area di crescita di 75 cm 2) con fibroblasti NHDF in crescita esponenziale. Aggiungere 10 mL di PBS al pallone. Lavare delicatamente i fibroblasti aderenti agitando manualmente la beuta per 1 min.</li>
			<li>Rimuovere il PBS e aggiungere tripsina 1 mL nel pallone. Agitare il matraccio delicatamente per garantire che tutte le cellule aderenti sono coperti dalla tripsina. Rimuovere la tripsina dal pallone. Mettere il pallone in incubatrice per 5 min a 37 ° C.</li>
			<li>Prendere il pallone fuori l'incubatrice e aggiungere 10 mL RPMI 1640 liquido nel pallone. Pipettare il mezzo su e giù più volte per disperdere i fibroblasti.</li>
			<li>Pipetta 0,3 mL dei fibroblasti dispersi su ciascuno dei due campi del vetrino da microscopio e inserire la diapositiva nell'incubatrice per 24 h in modo che i fibroblasti aderiscono alla diapositiva. Per immunostaining di γH2AX e 53BP1 nei nuclei dei fibroblasti, passare alla fase 3.1.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Campioni di pazienti <ol><li>campioni di sangue: utilizzare i tubi di raccolta che sono stati riempiti con 2 mL di soluzione di riserva dell'anticoagulante e aggiungere 7 mL di sangue nelle provette. Conservare i campioni durante la notte a temperatura ambiente (cioè, 18-20 ° C). Il giorno successivo, isolare la fase G0/G1 cellule mononucleari di riposo di centrifugazione in gradiente di densità (punto 2.2.3).</li>
		<li>Campioni del midollo osseo: utilizzare i tubi di raccolta che sono stati riempiti con 2 mL di soluzione di riserva dell'anticoagulante (punto 1.1) e aggiungere midollo osseo 7 mL nelle provette. Conservare i campioni durante la notte a temperatura ambiente (cioè, 18-20 ° C). Il giorno successivo, isolare la fase G0/G1 cellule mononucleari di riposo di centrifugazione in gradiente di densità (punto 2.2.3). Utilizzare microsfere di CD34 e colonne di separazione per l'isolamento delle cellule CD34 + di cell.</li>
		<li>Isolamento delle cellule mononucleari di centrifugazione in gradiente di densità 
		Nota: Cellule mononucleari sono isolate da campioni di sangue e midollo osseo di centrifugazione su gradiente di densità 17 , 18 , 19.
		<ol><li>Diluire il campione di sangue eparinizzato in un rapporto di 1:1 con PBS e il campione di midollo osseo eparinizzata in un rapporto di 1:3 con PBS. Sospendere le cellule delicatamente trascinandoli dentro e fuori la pipetta due volte.</li>
			<li>Aggiungere un volume di mezzo di gradienti di densità in una nuova provetta. Delicatamente strato il sangue diluito o midollo osseo sopra il mezzo del gradiente di densità. Fare attenzione a non per mescolare i due strati.</li>
			<li>Centrifugare la provetta per 30 min a temperatura ambiente e 400 g. x lo strato superiore del plasma prelevare con la pipetta. Poi accuratamente raccolto le cellule mononucleari nello strato di sopra il mezzo del gradiente di densità. Le cellule mononucleari di trasferimento in una nuova provetta.</li>
			<li>Aggiungere almeno tre volumi di PBS a cellule mononucleari nel tubo. Sospendere le cellule delicatamente trascinandoli dentro e fuori la pipetta due volte. Centrifugare la provetta per 10 min a temperatura ambiente e 400 x g.</li>
			<li>Dopo la rotazione, rimuovere il supernatante e aggiungere 10 mL di 4 ° C, 1 x soluzione di lisi di cellule rosse. Risospendere delicatamente le cellule trascinandoli dentro e fuori la pipetta due volte e posizionare il tubo sul ghiaccio per 5 min. Aggiungere 30 mL di PBS a 4 ° C, quindi centrifugare la provetta per 10 min a temperatura ambiente e 400 x g.</li>
		</ol></li> <li>Preparazione dei cytospins <ol><li>preparare due cytospins con cellule mononucleari dei campioni dei pazienti (cioè, un cytospin per γH2AX colorazione di immunofluorescenza e un cytospin per γH2AX e 53BP1 combinato di immunofluorescenza) mediante centrifugazione (300 x g, 10 min) di 1.0 x 10 5 celle per ogni preparazione ( Figura 3 e 4).</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 3. γH2AX e colorazione di immunofluorescenza 53BP1 <ol><li>fissazione e permeabilizzazione: fissare le cellule con 200 µ l di 4% PFA per 10 min. Dopo la fissazione, lavare delicatamente le cellule tre volte con 30 mL di PBS per 5 minuti ciascuno su un agitatore di laboratorio. Quindi permeabilize le cellule con 200 µ l di 0,1% octoxinolo 9 per 10 min. lavare le cellule delicatamente tre volte con 30 mL di soluzione bloccante 5% per 5 minuti ciascuno su un agitatore di laboratorio. Bloccare le cellule in 30 mL di fresco 5% soluzione per 1 h. di blocco</li>
	<li>Incubazione con gli anticorpi <ol><li>Incubare una preparazione delle cellule con un anticorpo monoclonale anti-γH2AX di topo (1: 500) e l'altra preparazione delle cellule con un anticorpo monoclonale anti-γH2AX di topo (1: 500) e una anticorpo policlonale del coniglio di anti-53BP1 (1: 500) durante la notte a 4 ° C.</li>
		<li>Dopo incubazione lavare le cellule delicatamente 3 volte con 30 mL di soluzione bloccante 2% per ogni 5 minuti su un agitatore di lab.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di blocco e incubare la prima preparazione delle cellule con un anticorpo secondario anti-topo di capra Alexa488-coniugati (1: 500) e la seconda preparazione delle cellule con un (anticorpo secondario anti-topo di capra Alexa488-coniugato 1: 500) e un asino Alexa555-coniugato anticorpo secondario anti-coniglio (1: 500) per 1 h a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li> <li>Mezzo di montaggio: mettere il vetrino con le cellule in una ciotola e lavare le cellule delicatamente tre volte con 30 mL di PBS per ogni 5 minuti su un agitatore di laboratorio. Rimuovere il PBS e montare le cellule con mezzo di montaggio contenente 4,6-diamidino-2-phenylindole. Prudentemente messo un vetrino coprioggetto sopra il mezzo di montaggio in modo che bolle d'aria non sono incorporato. Attendere almeno 3 ore per l'indurimento di mezzo di montaggio prima di analizzare le cellule mediante microscopia a fluorescenza.</li>
</ol> 4. Analisi di γH2AX e 53BP1 i fuochi <ol><li>microscopia di fluorescenza: analizzare i fuochi γH2AX e 53BP1 nei nuclei delle cellule con un microscopio a fluorescenza dotato di filtri per DAPI, Alexa 488 e Cy3 durante la formazione immagine a un obiettivo 100x ingrandimento. Registrare immagini con una macchina fotografica ed elaborare le immagini con software di imaging appropriato.</li>
</ol>

<ol><li>Hoeijmakers, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+maintenance+mechanisms+for+preventing+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome maintenance mechanisms for preventing cancer.</a> Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).</li>
<li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+and+decay+of+the+primary+structure+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Instability and decay of the primary structure of DNA.</a> Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).</li>
<li>Zeman, M. K., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+replication+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of replication stress.</a> Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).</li>
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<li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+DNA+double-strand+breaks%3A+production%2C+fidelity+of+repair%2C+and+induction+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).</li>
<li>Simsek, D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+end-joining+is+suppressed+by+the+canonical+NHEJ+component+Xrcc4-ligase+IV+during+chromosomal+translocation+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).</li>
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<li>Panier, S., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+break+repair%3A+53BP1+comes+into+focus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (1), 7-18 (2014).</li>
<li>Escribano-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+cycle-dependent+regulatory+circuit+composed+of+53BP1-RIF1+and+BRCA1-CtIP+controls+DNA+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice.</a> Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+White+Blood+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Separation of White Blood Cells.</a> Nature. 204, 793-794 (1964).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood.+Isolation+of+monuclear+cells+by+one+centrifugation%2C+and+of+granulocytes+by+combining+centrifugation+and+sedimentation+at+1+g%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Clin+Lab+Invest+Suppl%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g.</a> Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).</li>
<li>Bain, B., Pshyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+reactivity+in+mixed+leukocyte+cultures+after+separation+of+mononuclear+cells+on+Ficoll-Hypaque%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque.</a> Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).</li>
<li>Popp, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+DNA+damage+after+reduced+and+conventional+absorbed+radiation+doses+using+3rd+generation+dual-source+CT+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Radiol+Open%22%5BJournal%5D)">Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology.</a> Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).</li>
<li>Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+DNA+damage+after+multi-detector+row+CT%3A+a+quantitative+biomarker+of+low-level+radiation+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure.</a> Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).</li>
<li>Lobrich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+formation+and+repair+of+DNA+double-strand+breaks+after+computed+tomography+examinations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fixatives+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods Mol Biol. 588, 55-61 (2010).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of cell membranes.</a> Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).</li>
<li>Rothkamm, K., Lobrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+lack+of+DNA+double-strand+break+repair+in+human+cells+exposed+to+very+low+x-ray+doses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Microscopia di immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1 è un metodo utile per analizzare la formazione e la riparazione di DSB in un ampio spettro di settori di ricerca. I parametri critici che influenzano il risultato degli esperimenti sono la fase del ciclo cellulare, gli agenti utilizzati per la fissazione e la permeabilizzazione delle cellule, la scelta di anticorpi e l'hardware e il software di microscopio di fluorescenza.
L'influenza del ciclo cellulare sui modelli i fuochi di γH2AX è stata d...

DNA è continuamente danneggiato da endogeno (ad es., stress replica, specie reattive dell'ossigeno, intrinseca instabilità del DNA) ed esogene (ad esempio, radicali chimici, irradiazione) fonti (Figura 1)1,2 ,3,4. Tra il danno del DNA, rotture del DNA a doppio filamento (DSB) sono lesioni particolarmente gravi e possono indurre la morte delle cellule o carcinogenesi. Circa 50 DSB possono sorgere al cellulare e ciclo cellulare5. In cellule di mammifero, ricombinazione omologa (HR) e fine-unirsi nonhomologous (NHEJ) sviluppato come vie principali per la riparazione di DSB (Figura 2). HR si verifica nella fase tarda S/G2 e utilizza un'intatta sorella cromatidio come modello per la riparazione potenzialmente privo di errori. In confronto, NHEJ è attivo durante tutto il ciclo cellulare e potenzialmente mutageni come coppie di basi può essere aggiunto o resecate prima legatura dell'estremità rotte. Inoltre, fine-entrare in alternativa possono essere assunti come un meccanismo di lento mutagene backup ripristino in caso di carenza NHEJ6,7.
DSB inducono la fosforilazione dell'istone H2AX a serina 139 in una regione di diverse coppie di megabase intorno ogni DSB. I fuochi che formanti nucleari sono denominati γH2AX i fuochi e rilevabili da microscopia di immunofluorescenza8. ΓH2AX promuove l'assunzione di ulteriori proteine DSB-sensible a reagire ed è coinvolto nel rimodellamento della cromatina, riparazione del DNA e di trasduzione di segnale9. Come ogni focus γH2AX è considerato per rappresentare un singolo DSB, la quantificazione del DSB da microscopia di immunofluorescenza è possibile, che è stata dimostrata in linee cellulari del cancro e i campioni dei pazienti10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (proteina p53 1) è un'altra proteina chiave nel mediare la riparazione DSB. È coinvolto nel reclutamento di DSB-sensible a reagire proteine, segnalazione di checkpoint e le sinapsi di DSB estremità15. Inoltre, 53BP1 svolge un ruolo critico nella scelta di percorso di riparazione DSB. Si innesca la riparazione del DSB verso NHEJ mentre HR è impedito16. Considerando le funzioni originali di γH2AX e 53BP1 in riparazione DSB, l'analisi simultanea di γH2AX e 53BP1 da microscopia di immunofluorescenza può essere un metodo utile per l'analisi precisa della formazione e della riparazione del DSB.
Questo manoscritto fornisce un protocollo dettagliato per l'esecuzione di microscopia di immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1 nei nuclei delle cellule. In particolare, la tecnica è applicata in fibroblasti normali della linea cellulare NHDF, nei linfociti irradiati raggi x di un individuo sano e in cellule CD34 + di un paziente con la leucemia mieloide acuta. I dettagli del metodo sono indicati nel contesto dei risultati presentati.

<table><tbody><tr><td>Terreno RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883</td><td>Terreno per colture cellulari</td></tr><tr><td>Eparina sodio</td><td>ratiopharm</td><td>PZN 3029843</td><td>&nbsp; Eparina 5.000 U.I. / mL</td></tr><tr><td>Soluzione di cloruro di sodio 0,9%</td><td>B. Braun</td><td>PZN 1957154</td><td>Componente della soluzione madre anticoagulante</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-02</td><td>Terreno per l'isolamento di cellule mononucleate</td></tr><tr><td>Soluzione di tripsina 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59427C</td><td>Enzima per la dissociazione dei fibroblasti in coltura cellulare</td></tr><tr><td>CD34 MicroBead Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-046-702</td><td>Isolamento di cellule progenitrici mieloidi CD34+</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio diagnostico</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER-203B-CE24</td><td>Vetrini per microscopio</td></tr><tr><td>Megafuge 1.0 R</td><td>Heraeus</td><td>75003060</td><td>&nbsp; Centrifuga da tavolo&nbsp;</td></tr><tr><td>Dispositivo</td><td></td><td></td><td></td>Cytospin</tr><tr><td>Coperchio</td><td>Heraeus</td><td>76003422</td><td>Coperchio per lavorare senza microprovette</td></tr><tr><td>Contenitore Cyto</td><td>Heraeus</td><td>75003416</td><td>Contenitore Cyto con 2 fori conici</td></tr><tr><td>Clip Carrier</td><td>Heraeus</td><td>75003414</td><td>Carrier per contenere un contenitore cyto e un vetrino</td></tr><tr><td>Inserto di supporto</td><td>Heraeus</td><td>75003417</td><td>Inserto di supporto per tenendo un supporto a clip</td></tr><tr><td>Triton X-100 (Octoxinol 9)</td><td>Thermo Scientific</td><td>85112</td><td>Detergente per la permeabilizzazione delle membrane cellulari</td></tr><tr><td>Soluzione di idrossido di potassio 1M</td><td>Merck Millipore</td><td>109107</td><td>Necessario per preparare la soluzione di paraformaldeide</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Agente di fissazione</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Soluzione salina</td></tr><tr><td>bilanciata Chemiblocker</td><td>Merck Millipore</td><td>2170</td><td>Agente bloccante</td></tr><tr><td>Monoclonale di topo anti-&gamma; Anticorpo H2AX (JBW301)</td><td>Merck Millipore</td><td>05-636</td><td>Anticorpo primario per la rilevazione di &gamma; H2AX</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonale anti-53BP1 di coniglio (NB100-304)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-304</td><td>Anticorpo primario per il rilevamento di 53BP1</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>Anticorpo secondario</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-coniugato asino anti-coniglio</td><td>Invitrogen</td><td>A-31572</td><td>Anticorpo secondario</td></tr><tr><td>Vectashield mount medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Contiene DAPI per la colorazione del DNA</td></tr><tr><td>Axio Scope.A1</td><td>Zeiss</td><td>490035</td><td>Microscopio a fluorescenza</td></tr><tr><td>Cool Cube 1 Telecamera CCD</td><td>Metasystems</td><td>H-0310-010-MS</td><td>Sistema di telecamere per la registrazione digitale</td></tr><tr><td>Software Isis</td><td>Metasystems</td><td>Non applicabile</td><td>Software per microscopio</td></tr></tbody></table>

microscopia di immunofluorescenza di γh2ax e 53bp1 per analizzare la formazione e la riparazione di rotture a doppio filamento del dna

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

Rotture del DNA a doppio filamento (DSB) sono gravi lesioni al DNA. Analisi della formazione e della riparazione del DSB sono rilevante in un ampio spettro di settori di ricerca tra cui integrità del genoma, genotossicità, radiobiologia, invecchiamento, cancro e lo sviluppo di farmaci. In risposta a DSB, istone H2AX è fosforilata a serina 139 in una regione di diverse coppie di megabase formando fuochi nucleari discreti rilevabili da microscopia di immunofluorescenza. In aggiunta, 53BP1 (proteina p53 1) è un'altra importante proteina DSB-sensible a reagire promuovendo la riparazione del DSB unendo nonhomologous fine-evitando la ricombinazione omologa. Secondo le specifiche funzioni di γH2AX e 53BP1, l'analisi combinata di γH2AX e 53BP1 da microscopia di immunofluorescenza può essere un approccio ragionevole per un'analisi dettagliata del DSB. Questo manoscritto fornisce un protocollo dettagliato completato con metodiche note per l'esecuzione della tecnica. In particolare, l'influenza del ciclo cellulare sui modelli di fuochi γH2AX è dimostrata in fibroblasti normali della linea cellulare NHDF. Inoltre, il valore dei fuochi γH2AX come biomarcatore è raffigurato nei linfociti irradiati raggi x di un individuo sano. Infine, l'instabilità genetica è studiata in cellule CD34 + di un paziente con la leucemia mieloide acuta da microscopia di immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1.

Analisi dei fuochi di γH2AX in cellule è più accurata in fase G0/G1 e la fase G2 quando i fuochi di γH2AX vengono visualizzati come punti fluorescenti distinti (Figura 5A). Al contrario, analisi dei fuochi di γH2AX nelle cellule durante la fase S sono complicata da macchioline dispersi γH2AX pan-nucleare causate dal processo di replica (figura 5B).
Fissazione delle cell...

Questo manoscritto fornisce un protocollo per l'analisi delle rotture del doppio filamento di DNA da microscopia di immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1.

Microscopia di immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1 per analizzare la formazione e la riparazione di rotture a doppio filamento del DNA

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

L'obiettivo generale della microscopia a immunofluorescenza gamma-H2AX e 53BP1 è analizzare la formazione e la riparazione di rotture del doppio filamento di DNA in vari tessuti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella ricerca sul cancro, come ad esempio il modo in cui si manifesta l'instabilità genetica nelle cellule tumorali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile visualizzare le rotture di una singola stringa di DNA e analizzare i processi di riparazione.A dimostrare la procedura sarà Susanne Brendel, un tecnico del nostro laboratorio. Iniziare l'esperimento preparando soluzioni, iniziando con la soluzione madre anticoagulante con 200 unità internazionali di eparina per millilitro in cloruro di sodio allo 0,9%. Riempire ciascuna delle provette di raccolta con due millilitri di soluzione madre anticoagulante prima di prelevare i campioni di sangue o di midollo osseo.Successivamente, preparare la soluzione di lisi 10X per globuli rossi con 82,91 grammi di cloruro di ammonio, 7,91 grammi di bicarbonato di ammonio e due millilitri di soluzione di acido etilendiamenetetracedico 0,5 molari a un pH di 8,0 sciogliendo gli agenti in acqua distillata doppia per un volume totale di un litro. Quindi, preparare la soluzione di fissazione aggiungendo 8,3 microlitri di una soluzione di idrossido di potassio a un molare a 360 milligrammi di paraformaldeide, o PFA, in una provetta per microtitolazione. Riempire la provetta con soluzione salina tamponata con fosfato, o PBS, fino al segno di un millilitro della provetta e riscaldare la provetta in un blocco riscaldante a 95 gradi Celsius per ottenere un millilitro di una soluzione di PFA al 36%.Trasferire un millilitro di soluzione di PFA al 36 per cento in una provetta da 15 millilitri. E aggiungere otto millilitri di PBS per ottenere una soluzione madre di PFA al quattro per cento da nove millilitri. Aliquotare la soluzione madre di PFA al quattro per cento e conservarla a una temperatura negativa di 18 gradi Celsius fino all'uso per la fissazione cellulare.Successivamente, preparare la soluzione di permeabilizzazione aggiungendo 50 microlitri di Octoxynol 9 a 50 millilitri di PBS per ottenere una soluzione di circa lo 0,1% di Octoxynol 9. Infine, preparare soluzioni bloccanti al cinque e al due per cento mescolando l'agente bloccante delle proteine con il PBS. Per preparare i campioni di sangue o di midollo osseo, recuperare le provette riempite con due millilitri della soluzione madre di anticoagulante.Prelevare sette millilitri di sangue o midollo osseo per provetta in condizioni sterili mediante puntura venosa o puntura del midollo osseo rispettivamente. Conservare i campioni per una notte a temperatura ambiente. Dopo la conservazione durante la notte, diluire il campione di sangue eparinizzato uno a uno con PBS e il campione di midollo osseo eparinizzato in un rapporto di uno a tre con PBS.Sospendi delicatamente le cellule aspirandole dentro e fuori dalla pipetta due volte. Quindi, aggiungere un volume di terreno di gradiente di densità a un tubo nuovo. Sovrapporre delicatamente il sangue diluito o il midollo osseo sopra il mezzo di gradiente di densità e fare attenzione a non mescolare i due strati.Centrifugare la provetta per 30 minuti a temperatura ambiente e 400 G.Prelevare lo strato superiore di plasma con una pipetta. Quindi, raccogliere con cura le cellule mononucleate nello strato sopra il mezzo del gradiente di densità. Trasferire le cellule mononucleate in una nuova provetta e aggiungere almeno tre volumi di PBS.Sospendi delicatamente le cellule aspirandole dentro e fuori dalla pipetta due volte. Centrifugare la provetta. Dopo la centrifuga, rimuovere il surnatante.Aggiungere 10 millilitri di quattro gradi Celsius 1x soluzione di lisi per globuli rossi. Risospendere delicatamente le cellule aspirandole dentro e fuori dalla pipetta due volte e posizionare la provetta sul ghiaccio per cinque minuti. Quindi, aggiungere 30 millilitri di PBS a quattro gradi Celsius e centrifugare la provetta.Utilizzare microsfere CD34 e colonne di separazione cellulare per l'isolamento delle cellule CD34 positive. Preparare due cyto-spin con cellule mononucleate dei campioni del paziente mediante centrifugazione di una volta per 10 le cinque cellule per ogni preparazione. Fissare le cellule con 200 microlitri di PFA al quattro per cento per 10 minuti.Dopo la fissazione, lavare delicatamente le cellule tre volte con 30 millilitri di PBS per cinque minuti ciascuna su uno shaker. Quindi, permealizzare le cellule con 200 microlitri di Octoxynol 9 allo 0,1% per 10 minuti. Lavare delicatamente le cellule tre volte con 30 millilitri di soluzione bloccante al cinque per cento per cinque minuti ciascuna su un agitatore da laboratorio.Bloccare le cellule in 30 millilitri di soluzione bloccante fresca al cinque per cento per un'ora. La fissazione e la permeabilizzazione delle cellule con il 4% di paraformaldeide in Octoxynol 9 allo 0,1% preserva distintamente i focolai gamma-H2AX e 53BP1. Incubare una preparazione delle cellule con un anticorpo monoclonale di topo anti-gamma-H2AX e l'altra preparazione delle cellule con un anticorpo monoclonale di topo anti-gamma-H2AX e un anticorpo policlonale di coniglio anti-53BP1 durante la notte a quattro gradi Celsius.Si raccomanda vivamente l'uso di comprovati anticorpi anti-gamma-H2AX e anti-53BP1. Dopo l'incubazione, lavare delicatamente le cellule tre volte con 30 millilitri di soluzione bloccante al due per cento per ogni cinque minuti su un agitatore da laboratorio. Successivamente, incubare la prima preparazione delle cellule con un anticorpo secondario anti-topo di capra coniugato Alexa 488 diluito uno su 500 in una soluzione bloccante al due per cento.Incubare la seconda preparazione delle cellule con un anticorpo secondario anti-topo di capra coniugato Alexa 488 e un anticorpo secondario anti-coniglio coniugato con asina Alexa 555 diluiti uno su 500 in una soluzione bloccante al due per cento. Lavare delicatamente le cellule tre volte con 30 millilitri di PBS su un agitatore da laboratorio. Rimuovere il PBS e montare le celle con il mezzo di montaggio.Applicare con cautela un vetrino coprioggetto sopra il supporto di montaggio in modo che non si incorporino bolle d'aria. Attendere almeno tre ore affinché il mezzo di montaggio si indurisca prima di analizzare le cellule mediante microscopia a fluorescenza. Infine, analizzare i focolai gamma-H2AX e 53BP1 nei nuclei cellulari con un microscopio a fluorescenza dotato di filtri per DAPI, Alexa 488 e Cy3 durante l'imaging a un ingrandimento di 100x.L'analisi dei focolai gamma-H2AX nelle cellule è più accurata nella fase G0, G1 e nella fase G2, quando i focolai gamma-H2AX appaiono come punti fluorescenti distinti, come mostrato in questa immagine rappresentativa dei fibroblasti. Al contrario, l'analisi dei focolai di gamma-H2AX nelle cellule durante la fase S è complicata da macchie di gamma-H2AX pan-nucleari disperse causate dal processo di replicazione. La colorazione in immunofluorescenza di gamma-H2AX è stata utilizzata per la quantificazione delle rotture del doppio filamento di DNA nei tessuti irradiati e ha chiarito che i livelli di focolai di gamma-H2AX nei linfociti irradiati sono proporzionali alla dose di irradiazione.La co-localizzazione dei focolai gamma-H2AX e 53BP1 in cellule CD34 positive di un paziente con leucemia mieloide acuta indica la promozione di meccanismi di riparazione dell'unione delle estremità non omologhe mediati da 53BP1 nei siti di rottura del doppio filamento del DNA. Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la microscopia a immunofluorescenza gamma-H2AX e 53BP1 per l'analisi delle rotture del doppio filamento del DNA. A seguito di questa procedura, altre metodiche come l'immunoblotting di ATM fosfori-correlato, ATR, checkpoint chinasi uno, checkpoint chinasi due e TP53 possono essere eseguite nelle cellule tumorali al fine di analizzare le alterazioni della risposta al danno del DNA.

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Microscopia di immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1 per analizzare la formazione e la riparazione di rotture a doppio filamento del DNA

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