Microscopia di immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1 per analizzare la formazione e la riparazione di rotture a doppio filamento del DNA

L'obiettivo generale della microscopia a immunofluorescenza gamma-H2AX e 53BP1 è analizzare la formazione e la riparazione di rotture del doppio filamento di DNA in vari tessuti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella ricerca sul cancro, come ad esempio il modo in cui si manifesta l'instabilità genetica nelle cellule tumorali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile visualizzare le rotture di una singola stringa di DNA e analizzare i processi di riparazione.

A dimostrare la procedura sarà Susanne Brendel, un tecnico del nostro laboratorio. Iniziare l'esperimento preparando soluzioni, iniziando con la soluzione madre anticoagulante con 200 unità internazionali di eparina per millilitro in cloruro di sodio allo 0,9%. Riempire ciascuna delle provette di raccolta con due millilitri di soluzione madre anticoagulante prima di prelevare i campioni di sangue o di midollo osseo.

Successivamente, preparare la soluzione di lisi 10X per globuli rossi con 82,91 grammi di cloruro di ammonio, 7,91 grammi di bicarbonato di ammonio e due millilitri di soluzione di acido etilendiamenetetracedico 0,5 molari a un pH di 8,0 sciogliendo gli agenti in acqua distillata doppia per un volume totale di un litro. Quindi, preparare la soluzione di fissazione aggiungendo 8,3 microlitri di una soluzione di idrossido di potassio a un molare a 360 milligrammi di paraformaldeide, o PFA, in una provetta per microtitolazione. Riempire la provetta con soluzione salina tamponata con fosfato, o PBS, fino al segno di un millilitro della provetta e riscaldare la provetta in un blocco riscaldante a 95 gradi Celsius per ottenere un millilitro di una soluzione di PFA al 36%.

Trasferire un millilitro di soluzione di PFA al 36 per cento in una provetta da 15 millilitri. E aggiungere otto millilitri di PBS per ottenere una soluzione madre di PFA al quattro per cento da nove millilitri. Aliquotare la soluzione madre di PFA al quattro per cento e conservarla a una temperatura negativa di 18 gradi Celsius fino all'uso per la fissazione cellulare.

Successivamente, preparare la soluzione di permeabilizzazione aggiungendo 50 microlitri di Octoxynol 9 a 50 millilitri di PBS per ottenere una soluzione di circa lo 0,1% di Octoxynol 9. Infine, preparare soluzioni bloccanti al cinque e al due per cento mescolando l'agente bloccante delle proteine con il PBS. Per preparare i campioni di sangue o di midollo osseo, recuperare le provette riempite con due millilitri della soluzione madre di anticoagulante.

Prelevare sette millilitri di sangue o midollo osseo per provetta in condizioni sterili mediante puntura venosa o puntura del midollo osseo rispettivamente. Conservare i campioni per una notte a temperatura ambiente. Dopo la conservazione durante la notte, diluire il campione di sangue eparinizzato uno a uno con PBS e il campione di midollo osseo eparinizzato in un rapporto di uno a tre con PBS.

Sospendi delicatamente le cellule aspirandole dentro e fuori dalla pipetta due volte. Quindi, aggiungere un volume di terreno di gradiente di densità a un tubo nuovo. Sovrapporre delicatamente il sangue diluito o il midollo osseo sopra il mezzo di gradiente di densità e fare attenzione a non mescolare i due strati.

Centrifugare la provetta per 30 minuti a temperatura ambiente e 400 G.Prelevare lo strato superiore di plasma con una pipetta. Quindi, raccogliere con cura le cellule mononucleate nello strato sopra il mezzo del gradiente di densità. Trasferire le cellule mononucleate in una nuova provetta e aggiungere almeno tre volumi di PBS.

Sospendi delicatamente le cellule aspirandole dentro e fuori dalla pipetta due volte. Centrifugare la provetta. Dopo la centrifuga, rimuovere il surnatante.

Aggiungere 10 millilitri di quattro gradi Celsius 1x soluzione di lisi per globuli rossi. Risospendere delicatamente le cellule aspirandole dentro e fuori dalla pipetta due volte e posizionare la provetta sul ghiaccio per cinque minuti. Quindi, aggiungere 30 millilitri di PBS a quattro gradi Celsius e centrifugare la provetta.

Utilizzare microsfere CD34 e colonne di separazione cellulare per l'isolamento delle cellule CD34 positive. Preparare due cyto-spin con cellule mononucleate dei campioni del paziente mediante centrifugazione di una volta per 10 le cinque cellule per ogni preparazione. Fissare le cellule con 200 microlitri di PFA al quattro per cento per 10 minuti.

Dopo la fissazione, lavare delicatamente le cellule tre volte con 30 millilitri di PBS per cinque minuti ciascuna su uno shaker. Quindi, permealizzare le cellule con 200 microlitri di Octoxynol 9 allo 0,1% per 10 minuti. Lavare delicatamente le cellule tre volte con 30 millilitri di soluzione bloccante al cinque per cento per cinque minuti ciascuna su un agitatore da laboratorio.

Bloccare le cellule in 30 millilitri di soluzione bloccante fresca al cinque per cento per un'ora. La fissazione e la permeabilizzazione delle cellule con il 4% di paraformaldeide in Octoxynol 9 allo 0,1% preserva distintamente i focolai gamma-H2AX e 53BP1. Incubare una preparazione delle cellule con un anticorpo monoclonale di topo anti-gamma-H2AX e l'altra preparazione delle cellule con un anticorpo monoclonale di topo anti-gamma-H2AX e un anticorpo policlonale di coniglio anti-53BP1 durante la notte a quattro gradi Celsius.

Si raccomanda vivamente l'uso di comprovati anticorpi anti-gamma-H2AX e anti-53BP1. Dopo l'incubazione, lavare delicatamente le cellule tre volte con 30 millilitri di soluzione bloccante al due per cento per ogni cinque minuti su un agitatore da laboratorio. Successivamente, incubare la prima preparazione delle cellule con un anticorpo secondario anti-topo di capra coniugato Alexa 488 diluito uno su 500 in una soluzione bloccante al due per cento.

Incubare la seconda preparazione delle cellule con un anticorpo secondario anti-topo di capra coniugato Alexa 488 e un anticorpo secondario anti-coniglio coniugato con asina Alexa 555 diluiti uno su 500 in una soluzione bloccante al due per cento. Lavare delicatamente le cellule tre volte con 30 millilitri di PBS su un agitatore da laboratorio. Rimuovere il PBS e montare le celle con il mezzo di montaggio.

Applicare con cautela un vetrino coprioggetto sopra il supporto di montaggio in modo che non si incorporino bolle d'aria. Attendere almeno tre ore affinché il mezzo di montaggio si indurisca prima di analizzare le cellule mediante microscopia a fluorescenza. Infine, analizzare i focolai gamma-H2AX e 53BP1 nei nuclei cellulari con un microscopio a fluorescenza dotato di filtri per DAPI, Alexa 488 e Cy3 durante l'imaging a un ingrandimento di 100x.

L'analisi dei focolai gamma-H2AX nelle cellule è più accurata nella fase G0, G1 e nella fase G2, quando i focolai gamma-H2AX appaiono come punti fluorescenti distinti, come mostrato in questa immagine rappresentativa dei fibroblasti. Al contrario, l'analisi dei focolai di gamma-H2AX nelle cellule durante la fase S è complicata da macchie di gamma-H2AX pan-nucleari disperse causate dal processo di replicazione. La colorazione in immunofluorescenza di gamma-H2AX è stata utilizzata per la quantificazione delle rotture del doppio filamento di DNA nei tessuti irradiati e ha chiarito che i livelli di focolai di gamma-H2AX nei linfociti irradiati sono proporzionali alla dose di irradiazione.

La co-localizzazione dei focolai gamma-H2AX e 53BP1 in cellule CD34 positive di un paziente con leucemia mieloide acuta indica la promozione di meccanismi di riparazione dell'unione delle estremità non omologhe mediati da 53BP1 nei siti di rottura del doppio filamento del DNA. Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la microscopia a immunofluorescenza gamma-H2AX e 53BP1 per l'analisi delle rotture del doppio filamento del DNA. A seguito di questa procedura, altre metodiche come l'immunoblotting di ATM fosfori-correlato, ATR, checkpoint chinasi uno, checkpoint chinasi due e TP53 possono essere eseguite nelle cellule tumorali al fine di analizzare le alterazioni della risposta al danno del DNA.