Name: Fabbricazione di pozzi di agarosio personalizzato per la semina delle cellule e tessuto anello auto-assemblaggio utilizzando stampi 3D-stampato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Scopri come fabbricare pozzi di agarosio personalizzati per la semina cellulare e la formazione di anelli tessutali auto-assemblati utilizzando stampi 3D. Questo metodo semplice consente di creare tessuti ingegnerizzati con dimensioni personalizzate per studiare struttura e funzione.

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Noi riconosciamo con gratitudine Dr. Erica Stults (ricerca accademica & applicazione scienziato, WPI Information Technology Services) per la sua assistenza con stampa 3D, Amanda Zoë Reidinger, pH.d., Chris Nycz e Karen Levi, M.E., per il loro contributo su disegno di muffa, Kathy Suqui e Jennifer Mann per la loro assistenza collaudo stampi designs e Michael O'Keefe per la sua assistenza con le riprese.  Questo lavoro è stato supportato da NSF IGERT DGE 1144804 (MWR, HAS), NIH R15 HL097332 (MWR, TAH), NSF REU EEC0754996 (BA), NIH 1R01 EB023907 (MWR, HAS) e NIH R15 HL137197 (MWR, HAS).
<div></div>

1. preparazione dello stampo 3D-stampato
<ol><li>Preparare un CAD disegno dello stampo nelle dimensioni desiderate.</li>
	<li>Invia il file CAD per una stampante 3D ad alta risoluzione. Selezionare il materiale di stampa plastica appropriato, con finitura lucida.</li>
	<li>Dopo la stampa, è necessario lavare accuratamente lo stampo con acqua e detergente.</li>
</ol>2. fusione PDMS negativi
<ol><li>Misurare la quantità desiderata di PDMS base su un equilibrio. Per uno stampo con un 60 mm di diametro e 2 mm post bene, usare 25 g.</li>
	<li>Aggiungere un agente polimerizzante a un 01:10 (w/w) rapporto alla base del PDMS.</li>
	<li>Mescolare energicamente fino a quando i due componenti sono accuratamente combinati. Miscelazione insufficiente può causare polimerizzazione incompleta del PDMS, risultante in una superficie di "cattivo gusto".</li>
	<li>Posizionare un pezzo di nastro di laboratorio intorno al bordo di stampa 3D stampi, per consentire la formazione di uno strato di base di PDMS sopra i pozzetti stampati.</li>
	<li>Versare il composto PDMS nello stampo e posizionare lo stampo in una camera a vuoto a-gas fino a quando tutte le bolle vengono rilasciate.</li>
	<li>Curare il PDMS a 50 ° C per 2 – 4 h, o fino a quando non si è solidificata abbastanza per rimuovere.</li>
	<li>Rimuovere il nastro di laboratorio ed estrarre delicatamente il negativo PDMS.</li>
	<li>Incubare il PDMS a 60 ° C per un ulteriore 1 h (dopo la rimozione dallo stampo 3D-stampato) per garantire che la muffa è completamente guarita.</li>
	<li>Lavare il PDMS accuratamente con acqua e detergente per rimuovere eventuali residui. Lavaggio insufficiente può causare formazione di anello poveri per il primo impiego del negativo PDMS.</li>
</ol>3. fabbricazione dell'agarosi Wells
<ol><li>Preparare dell'agarosi pozzetti 1 giorno prima della semina di cellule.</li>
	<li>Fai una soluzione di agarosio 2% (p/v) in DMEM e autoclave.</li>
	<li>Dispensare 4 mL agarosio fuso in un'autoclave PDMS negativo. Quindi dispensare agarosio direttamente nei perni di PDMS negativi. Rimuovere eventuali bolle d'aria con un puntale, come bolle possono causare disomogeneità nelle dimensioni bene.</li>
	<li>Nota: Non riempire eccessivamente stampi; la superficie superiore dell'agarosio deve essere piatta, affinché agarosio pozzi sarà livello su rimozione da PDMS e posizionamento in piastre di coltura 6 pozzetti. Avanzi dell'agarosi possono essere re-autoclavato e usati ancora una volta, anche se non più di una volta.</li>
	<li>Dopo che si raffredda l'agarosio (circa 10 min per agarosio 4 mL; stampi più grandi potrebbero essere necessario più raffreddamento volte), attentamente separare i pozzi dell'agarosi dai negativi PDMS utilizzando forcipe smussato e trasferire in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.</li>
	<li>Immergere i pozzi di agarosio in terreno di coltura completa ed equilibrare una notte in un incubatore 37 ° C prima dell'uso.</li>
</ol>4. anelli di tessuto di semina
<ol><li>Cellule di muscolo liscio aortiche del ratto di cultura21 (RaSMCs) su in DMEM contenente 10% siero bovino fetale (FBS), 1% L-Glutammina, gli aminoacidi non essenziali di 1%, piruvato di sodio 1% e 1% di penicillina-streptomicina fino alla confluenza del 70%. Nota: Le cellule dovrebbero essere coltivate a 5% CO2 e 37 ° C nelle piastre di coltura del tessuto di 15 cm.</li>
	<li>Dopo stampi sono equilibrati (sezione 3), preparare RaSMCs per il seeding.</li>
	<li>Sciacquare piatti due volte con 5 mL per piastra di tampone fosfato salino (PBS).</li>
	<li>Aggiungere tripsina 0,25% 3 mL per 15 cm di Petri. Spostare le piastre in un incubatore a 37 ° C per 2 – 3 minuti, o fino a quando le cellule hanno tolto la piastra.</li>
	<li>Neutralizzare la tripsina con un volume uguale (3 mL per piastra) completo del terreno di coltura. Risospendere le cellule accuratamente per rompere i grumi.</li>
	<li>Diluire una parte aliquota di sospensione cellulare 1:1 con colorante blu di trypan e contare le celle con un emocitometro.</li>
	<li>Centrifugare il volume totale della sospensione cellulare per 5 min a 200 x g per agglomerare le cellule.</li>
	<li>Risospendere le cellule ad una concentrazione di 10 milioni di cellule per mL; Questo si tradurrà in 500.000 cellule per 50 µ l. Nota: Diversi tipi di cellule possono richiedere le concentrazioni cellulari differenti.</li>
	<li>Aspirare tutto il mezzo dallo stampo dell'agarosi. Fare attenzione a rimuovere tutte le medie da singoli pozzetti, ma a non forare il fondo dei pozzetti.</li>
	<li>Pipettare 50 µ l di sospensione in ciascun pozzetto.</li>
	<li>Attentamente e aggiungere 2 mL di terreno nuovo intorno alla parte esterna dello stampo dell'agarosi. Fare attenzione a non lasciare mai sfuggire medie nei pozzetti di agarosio. Posizionare le piastre nell'incubatore durante la notte (circa 16 h).</li>
	<li>Dopo l'incubazione overnight, aspirare il mezzo da fuori gli stampi e aggiungere 4,5 mL di terreno fresco in ciascun pozzetto della piastra 6 pozzetti in modo che stampi e anelli sono completamente sommerse. Medio di cambiare ogni giorno.</li>
</ol>

<ol><li>L'Heureux, N., Paquet, S., Labbe, R., Germain, L., Auger, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+completely+biological+tissue-engineered+human+blood+vessel%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A completely biological tissue-engineered human blood vessel.</a> FASEB J. 12 (1), 47-56 (1998).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui abbiamo presentato un metodo versatile per la rapida realizzazione di anelli di tessuto auto-assemblati con dimensioni facilmente su misura utilizzando la stampa 3D. Il nostro metodo è simile a quella riportata in Svoronos et al. 6 , dove a nido d'ape 3D-stampato e stampi di cera a forma di osso di cane sono stati utilizzati per eseguire il cast PDMS negativi. Tuttavia, gli stampi sono stati modificati per contenere diverse caratteristiche uniche. Una tacca (fig. 4A(1)) fornisce orientamento dello stampo per consentire ogni anello essere etichettato e monitorato separatamente. Il foro centrale (Figura 4A(2)) consente di migliorare la diffusione del mezzo nei pozzetti. Numeri di file CAD vengono stampati direttamente sullo stampo; di conseguenza, PDMS negativi sono ognuna etichettati con numero di versione e diametro (Figura 4A3) post. I muri esterni conici (Figura 3(1), 5 °), nella parte superiore del pozzo trogoli (Figura 3(2), 45 °) e foro centrale (Figura 3(3), 5 °) rendono più facile per rimuovere negativi PDMS dagli stampi 3D-stampato , e pozzi di agarosio sono più facili da rimuovere dai negativi PDMS (Figura 4A(2), a (4)).
Abbiamo dimostrato la versatilità di questo sistema di fabbricare tessuti auto-assemblati a forma di anello di una varietà di diametri e tipi di cellule, tra cui primario umano del muscolo liscio cellule (SMCs)18,22, ratto aortico SMCs7 , 23, cellule staminali mesenchimali umane (hMSCs)13e SMCs derivato da pluripotenti indotte (iPSCs) le cellule staminali11 (tabella 1). Lavori in corso, stiamo valutando la formazione di anelli da tipi di cellule supplementari quali le cellule endoteliali e anelli di cartilagine di varie dimensioni per potenziali applicazioni in sostituzione tracheale di fusione. Oltre ai costrutti completamente cellula-derivati, abbiamo anche utilizzato questo sistema per fabbricare anelli con gelatina reticolato incorporato microsfere13,22. Microsfere possono essere incorporate all'interno di anelli di tessuto durante l'auto-assemblaggio per fornire ulteriore resistenza meccanica, o localizzata consegna di fattori di crescita13,22.
Realizzazione di anelli di tessuto, ottimizzazione del numero delle cellule può essere richiesto per diversi tipi di cellule. Minimo cella numeri possono variare a seconda della dimensione e il tipo delle cellule. Ad esempio, schede HSMC derivato da iPSCs sono seminati a 600.000 cellule/anello11, hMSCs e schede HSMC primario sono seminati a 400.000 cellule/anello13,22e ratto che SMCs aortico sono seminati a 500.000 cellule/anello18. Dimensioni di depressione possono anche influenzare la formazione dell'anello e il numero minimo di cellule necessarie per anello formazione24. Per gli studi con le cellule umane e stampi 3D-stampato, è stata utilizzata una larghezza di trogolo di 2 mm. Gli stampi in policarbonato originale avevano una larghezza di trogolo di 3,75 mm, che ha richiesto 750.000 schede HSMC per formare un anello di cella 2 mm18. Con la larghezza ridotta trogolo, siamo stati in grado di ridurre il numero di cellule necessarie per la formazione dell'anello del 46%, a 400.000 cellule per anello25. Quantità di cellule seminate per anello sono riassunti nella tabella 1.
Quando si sceglie un materiale di stampa 3D, molti fattori devono essere considerati. Perché il PDMS è curato in genere a 60 ° C, il materiale di stampa 3D deve avere un alto abbastanza fusione la temperatura per evitare danni durante la polimerizzazione PDMS. La temperatura di fusione del materiale utilizzato in questo studio (un materiale proprietario, Vedi Tabella materiali) non è disponibile. Tuttavia, quando al forno a 60 ° C per 1 h, abbiamo osservato che il materiale ha cominciato a produrre un odore. Così, abbiamo deciso di abbassare la temperatura di polimerizzazione a 50 ° C e aumentare il tempo di polimerizzazione per cuocere il PDMS senza danneggiare il materiale di stampa 3D. Regolazioni in tempo di polimerizzazione possono essere necessarie se stampi vengono modificati ai negativi di forma più grandi PDMS. Un ulteriore periodo di indurimento a 60 ° C dopo la rimozione di PDMS dagli stampi 3D-stampato impedisce che il PDMS finale negativo restanti pacchiana, limitando la temperatura a che dello stampo 3D-stampato è esposto. Si noti che alcuni materiali inibiscono la polimerizzazione di PDMS, pertanto assicurarsi che il materiale selezionato è compatibile con PDMS. Infine, la tossicità del materiale di stampo anche deve essere considerata. Mentre lo stampo 3D-stampato non sarà in contatto diretto con le cellule, è possibile che qualche residuo dallo stampo può essere trasferito per il PDMS negativi durante la procedura di polimerizzazione. Abbiamo trovato che molto accurato lavaggio con detersivo era sufficiente per rimuovere eventuali residui dal PDMS negativo. Tuttavia, abbiamo osservato precedentemente che lavaggio inadeguato condusse alla formazione di povero anello in pozzi di agarosio per la prima alcuni usi del PDMS negativo. L'utilizzo del cast PDMS da altri materiali di stampa 3D può richiedere ulteriori indagini per verificare che il detergente è sufficiente per rimuovere residui di muffa, compreso qualsiasi potenziali percolati. Test periodici può anche essere necessario, come è possibile che ripete riscaldamento cicli (fino a 50 ° C) può danneggiare lo stampo nel tempo e determinare un aumento dei residui dopo un uso ripetuto. Fin qui, abbiamo usato un unico stampo 3D-stampato per realizzare oltre 30 PDMS negativi che sono stati utilizzati per generare correttamente gli anelli del tessuto.
Nel complessiva, 3D stampa permette una maggiore versatilità per la fabbricazione di stampi di agarosio di lavorazione di policarbonato. Esso fornisce una risoluzione maggiore rispetto a quanto possibile con fregi, e progettazione di stampi non è limitata dalle dimensioni degli strumenti disponibili. Questo permette una maggiore personalizzazione e l'aggiunta di funzionalità quali affusolate che potrebbe non essere possibile con lavorazione. Questo sistema può essere applicato a fabbricare tessuti auto-assemblati in altre forme pure, oltre a anelli6,17. Utilizzando il metodo di fabbricazione di anello, abbiamo sviluppato anelli di tessuto da una varietà di tipi cellulari e dimensioni per potenziali applicazioni in tessuto tracheale ingegneria13, vasi sanguigni derivati dal7e modellazione malattie vascolari11.

Cellulare auto-assemblaggio approcci a fabbricare vasi sanguigni tessutale sono un'alternativa ad approcci basati sul patibolo. Auto-assemblati, senza impalcatura tessuti possono avere una maggiore densità delle cellule, la deposizione di matrice avanzata e forza e una migliore funzione biologica rispetto a tessuti basati su impalcatura1,2,3,4 . Tuttavia, formando tessuti 3D senza l'utilizzo del supporto di impalcatura esogeno con forme e dimensioni specifiche rimane una sfida. Alcuni metodi di fondono insieme strati di strati delle cellule per formare costrutti più spessi, anche se questo processo può richiedere molto tempo e lavoro intensivo5. In alternativa, le cellule possono essere seminate in stampi non adesivo e ammessi ad aggregare in sferoidi, anelli e altri tessuti forme6,7,8.
Anelli di tessuto auto-assemblati richiedono un minor numero di cellule, tempi più brevi di cultura, e meno reattivi rispetto più grande tubolare progettato tessuti, ma possono ancora essere meccanicamente testati, esaminati istologicamente o usati per la contrattilità e altri test funzionali7 , 9 , 10 , 11. perché possono essere fabbricati rapidamente e facilmente testati, tessuto anelli sono ideali per lo screening di un numero elevato di parametri di cultura e hanno il potenziale per uso come malattia modelli11 o strumenti per lo screening di12. Inoltre, gli anelli possono essere fuse in strutture di tessuto più complesse come i vasi sanguigni o trachea7,13, e anelli possono fondere più completamente che altre forme quali le sferoidi14,15.
Dell'agarosi sono ampiamente usato come un materiale di stampo per fabbricare tessuti auto-assemblati grazie alla sua biocompatibilità, la permeabilità e la proprietà adesive non-cellula. Ad esempio, Norotte et al fabbricato dell'agarosi stampi da barre estruse, che ha permesso un controllo limitato su stampo forma e attrezzature specializzate necessarie15. Tan et al depositato goccioline di alginato come costruzione di unità per fabbricare stampi personalizzati idrogel in varie forme (piramide, quadrato)16. Tuttavia, il grande diametro di sferoidi alginato (300 µm) ha provocato caratteristiche con bassa risoluzione. Superfici irregolari muffa che possono influenzare negativamente la consistenza di aggregazione delle cellule può provocare una bassa risoluzione. In alternativa, dell'agarosi possono essere gettati negativi di polimero per creare stampi non adesivo con caratteristiche regolari e dimensioni specifiche6,7,17.
Precedentemente abbiamo segnalato un sistema per la realizzazione personalizzata dell'agarosi anulare cella-semina pozzi da un cast PDMS negativo in una fresata in policarbonato muffa7,18. Agarosio era versato in negativo PDMS e ha permesso di impostare7,18. Cellule sono state seminate in agarosio pozzetti, dove essi aggregati a forma di auto-assemblato, anelli di tessuto senza impalcatura in meno di 24h7,18. PDMS negativi sono autoclavabili, possono essere riutilizzati molte volte e sono morbidi e flessibili, che lo rende facile da rimuovere i pozzi di agarosio solidificato. Quando questo sistema è stato inizialmente segnalato in Gwyther et al. 7, PDMS negativi sono stati espressi da fresato stampi in policarbonato (Figura 1A). Dopo agarosio casting, i pozzi di semina delle cellule erano individualmente tagliati e collocati nei pozzetti di una piastra 127,18. Il disegno è stato modificato più di recente tale che uno stampo singolo agarosio produce 5 anelli e si inserisce in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, eliminando la necessità di tagliare singoli pozzetti e riducendo la quantità di PDMS e agarosio necessaria per produrre ogni anello (Figura 1B). Una cellula più piccola depressione larghezza di semina è stata utilizzata per ridurre il numero delle teste di serie cellule necessarie per raggiungere la formazione dell'anello. Nonostante questi cambiamenti, la risoluzione e la personalizzazione di stampi sono stati limitati alle dimensioni standard disponibili endmill e micromilling può essere proibitivo. Inoltre, lavorazioni a controllo numerico (CNC) computer può richiedere molto tempo e ingombrante a causa della necessità di riservare tempo su pesantemente utilizzate attrezzature personalizzate, ulteriori computer-aided manufacturing (CAM) software per convertire la progettazione assistita da elaboratore ( File CAD) per un percorso utensile programmabile e affidabili sistemi di fissaggio della parte in policarbonato durante la lavorazione.
Nello studio presente, abbiamo esaminato l'uso della stampa 3D come alternativa alla lavorazione CNC. Stampa 3D è ampiamente usata per ingegneria impianti personalizzati, fabbricare materiali impalcatura e per la stampa diretta di cellule e tessuti sferoidi15,19,20. Abbiamo usato una stampante 3D ad alta risoluzione, e specialized 3D stampa materiale che ci ha permesso di stampare uno stampo rigido con un liscio, superficie lucida finitura (Vedi Tabella materiali). La nostra tecnica permette per la fabbricazione di stampi in plastica altamente personalizzabile, ad alta risoluzione che può essere utilizzato per eseguire il cast PDMS negativi e pozzi di agarosio. Iterazioni di progetto sono riassunti nella Figura 1. La progettazione dello stampo è stato ulteriormente modificata nella versione stampo 3D-stampato da includere conici muri esterni e un foro centrale per facilitare la rimozione di entrambi i negativi PDMS da stampi 3D-stampato e i pozzi di agarosio da PDMS negativi. Queste caratteristiche coniche non possono essere realizzate con processi di lavorazione standard. La distanza dal fondo dei pozzetti per il fondo dello stampo è stata aumentata in questa iterazione, risultante in una più spessa dell'agarosi base sotto il post per ridurre il rischio di post rottura durante la rimozione del bene dell'agarosi. La procedura di fabbricazione della muffa e anello è rappresentata schematicamente nella Figura 2.

<table><tbody><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza</td><td>50040</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>VeroWhite</td><td>StrataSys</td><td>RGD835</td><td></td></tr><tr><td>Stampante 3D</td><td>StrataSys</td><td>Objet 260 Connex</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>16000069</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-015-CI</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>Pen-streptococco</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>WKY 3M-22 cellule muscolari lisce aortiche di ratto</td><td>Fornito da T. Wight [ref 21]</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

fabbricazione di pozzi di agarosio personalizzato per la semina delle cellule e tessuto anello auto-assemblaggio utilizzando stampi 3d-stampato

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Tessuti ingegnerizzati vengono utilizzati clinicamente per la sostituzione e la riparazione dei tessuti e sono in fase di sviluppo come strumenti per lo screening di stupefacenti e la modellazione di malattia umana. Auto-assemblati tessuti offrono vantaggi rispetto basato su impalcatura tissutale, quali la deposizione di matrice avanzata, la forza e la funzione. Tuttavia, esistono alcuni metodi disponibili per fabbricare tessuti 3D senza semina di cellule su o all'interno di un'impalcatura di sostegno. In precedenza, abbiamo sviluppato un sistema per la realizzazione di anelli tessuto auto-assemblati di semina di cellule nei pozzetti non adesivo agarosio. Un polidimetilsilossano (PDMS) negativo in primo luogo è stato lanciato in uno stampo in policarbonato lavorati, e quindi dell'agarosi è stato gelificato nel PDMS negativo per creare semina pozzi di cellulare a forma di anello. Tuttavia, la versatilità di questo approccio è stata limitata dalla risoluzione degli strumenti disponibili per la lavorazione dello stampo in policarbonato. Qui, dimostriamo che 3D-stampato plastica utilizzabile come un'alternativa al policarbonato lavorato per fabbricare PDMS negativi. La stampa 3D muffa e muffa di rivista il design è più semplice da usare, poco costoso da produrre e richiede significativamente meno agarosio e PDMS per cella semina bene. Abbiamo dimostrato che i pozzi di agarosio risultante sono utilizzabili per creare anelli di tessuto auto-assemblati con diametri personalizzati da una varietà di tipi cellulari diversi. Anelli quindi possono essere utilizzati per l'analisi meccanica, funzionale ed istologica, o per fabbricare tessuti tubolari più grandi e complessi.

Questo sistema consente il semplice, realizzazione personalizzata di semina pozzi cellulare di agarosio che consente delle cellule auto-assemblaggio di 3D a forma di anello progettato tessuti. Stampa 3D consente la risoluzione migliore e una maggiore flessibilità nella progettazione di stampi di policarbonato, dove dimensioni sono vincolate dai formati disponibile strumento di lavorazione. Con una stampante 3D ad alta risoluzione, pareti sottili come 0,254 mm possono essere stampate e trogolo dimensioni sono limitate solo dalla risoluzione della stampante (15,2 µm risoluzione per questi studi). In genere, frese a CNC a meno di 0.3 mm non sono commercialmente disponibili, quindi non è possibile creare depressioni delle larghezze più piccole. Micro-macinazione può produrre caratteristiche minori, anche se l'attrezzatura necessaria può essere proibitivamente costosi o inaccessibile per molti laboratori di ricerca biomedica. Curvatura e trogolo dimensioni sono anche limitati dalla forma della punta fresa a candela. Inoltre, caratteristiche come angolato o pareti conici non sono possibili, e piccole caratteristiche possono rompersi durante il processo di lavorazione.
Disegni CAD possono essere facilmente modificati per produrre stampi 3D-stampato e PDMS negativi di dimensioni personalizzabili. La figura 3 descrive le dimensioni della nostra attuale 2 mm post stampa 3D stampi, rispetto alle precedenti iterazioni di progetto. Il processo è poco costoso; 2 mm, 5-anello 3D-stampato muffa costata 44,67 USD per stampa 3D e ogni parte può essere utilizzati per creare più negativi PDMS. Ad oggi, abbiamo creato più di 30 negativi PDMS da un unico stampo 3D-stampato. Ogni negativo richiede 25 g di PDMS USD 0,11 g (2,75 USD a PDMS negativo). Ogni negativo PDMS possa essere pulito con un detergente, in autoclave e ri-utilizzato per fino a parecchi anni, a seconda della frequenza d'uso. Rispetto al disegno originale18, lo stampo 3D-stampato compatto utilizza considerevolmente meno PDMS e dell'agarosi per anello di tessuto di 2 mm (Figura 1E).
Cellule seminate nei pozzi dell'agarosi equilibrato aggregati a formare anelli di tessuto in meno di 24 h. anello dimensioni dipendono dalle dimensioni dei pozzi dell'agarosi. Qui, abbiamo dimostrato che gli anelli autoassemblati ratto del muscolo liscio delle cellule possono essere fabbricati in pozzi con 2, 4 o pali di diametro 12 mm (Figura 4). Mentre gli anelli in questo studio sono stati coltivati solo per 3 giorni, noi abbiamo precedentemente coltivate hSMC anelli per fino a 2 settimane22e hMSC-cartilagine anelli per fino a 3 settimane13. Come riportato in precedenza, anelli possono funzionare come modelli 3D in vitro di tessuti umani per la valutazione quantitativa del tessuto funzionano11 e resistenza meccanica13,22e possono anche servire come unità di costruzione modulare per generare costrutti di tessuto a forma di tubo7,13. Condizioni di semina di cella e attributi funzionali degli anelli di tessuto ingegnerizzati da questi tipi di cellule sono riassunti nella tabella 1.
<img alt="Fabbricazione di stampi in polimero, diagrammi A-D, formati a 15/5 pozzetti, tabella di utilizzo PDMS/agarosio." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: disegni di stampo policarbonato. Inizialmente, ben 15 stampi sono stati lavorati in policarbonato (A). Versioni successive, un design più compatto (B), dotata di 5 pozzi progettati per adattarsi in uno stampo unico in policarbonato e all'interno di un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Qui, abbiamo modificato questo disegno per utilizzare plastica 3D-stampato come un'alternativa più personalizzabile di lavorati in policarbonato (C). Sono mostrati in (D) pozzi dell'agarosi fabbricati dall'iniziale progettazione18 (a sinistra) rispetto al design compatto attuale (a destra), che richiede significativamente meno agarosio e non richiede la separazione manuale dei pozzi. Quantità di PDMS e agarosio richiesto per ogni iterazione di progettazione sono riportati nella (E). Post Center sono 2 mm di diametro. Muffa nel()è di 6 cm x 12 cm, (B) ha un diametro di 5 cm, e (C) ha un diametro di 6 cm. Barra di scala (D) = 3 cm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig1large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Schema di fabbricazione del pozzo di agarosio e del processo dell'anello autoassemblato; Stampo 3D per la formazione di anelli di tessuto." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: fabbricazione di anelli di tessuto autoassemblati. Uno stampo 3D-stampato viene utilizzato per eseguire il cast un negativo PDMS, che viene quindi utilizzato per eseguire il cast i pozzi di agarosio (A). Le cellule sono seminate direttamente nei pozzetti agarosio, dove si raccolgono in meno di 24h a formare anelli di tessuto (B). Le linee tratteggiate in (B) mostrano il contorno ben. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Schema di progettazione dello stampo in policarbonato; dimensioni etichettate A-F con tabella delle specifiche per diversi formati." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: vista di sezione trasversale del disegno di muffa 3D-stampato CAD. Dimensioni per larghezza di depressione (A), trogolo altezza (B), foro centrale (C), diametro totale (D), labbro esterno (E) e l'altezza del muro esterno (F) sono indicate. Le pareti esterne (1), la porzione superiore dei pozzi (2) e un foro centrale (3) sono affusolati (ad un angolo di 5 ° per 1 e 3, 45 ° per 2) per migliorare la facilità di rimozione negativa PDMS. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Modelli CAD di stampi stampati in 3D, colata negativa PDMS, diagramma di processo del pozzo di agarosio per microfluidica." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: disegni CAD con corrispondente PDMS negativi e gli anelli con 2 (A), 4 (B) e (C) 12mm auto-assemblati-SMC post diametri. Nel(),(1) indica una tacca per fornire un orientamento, (2) indica un foro centrale per migliorare la perfusione, (3) è un numero di file, che imprime direttamente i negativi PDMS, e (4) Mostra l'esterno della parete, che è conica per facilitare la rimozione negativa PDMS. Bar in agarosio pozzi in scala = 1 cm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig4large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tipo di cella</td>
			<td>Cellule seminate per anello</td>
			<td>Diametro dell'anello</td>
			<td>Durata di cultura</td>
			<td>Analisi funzionale eseguita</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ratto SMC</td>
			<td>0,5, 1 o 3 x 106
</td>
			<td>2, 4 o 12 mm</td>
			<td>3 giorni</td>
			<td>Studio corrente; N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>
iPSC derivate SMC 11
</td>
			<td>0,6 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>17 giorni</td>
			<td>Test di contrattilità, prova di trazione monoassiale, analisi istologica</td>
		</tr>
<tr>
<td>
SMC umano 22
</td>
			<td>0,4 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>2, 7 o 14 giorni</td>
			<td>Prova di trazione monoassiale, analisi istologica</td>
		</tr>
<tr>
<td>
MSC umane 14
</td>
			<td>0,4 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>21 giorni</td>
			<td>Prova di trazione monoassiale, l'analisi istologica, anello fusione e compressione tubo test, differenziazione in tessuto cartilagineo</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Numeri di cellulare necessari per la fabbricazione di anello da diversi tipi di cellule.

Questo protocollo descrive una piattaforma per la realizzazione di anelli di tessuto auto-assemblati usando una muffa di plastica su misura 3D-stampato di dimensioni variabili. PDMS negativi sono curati nello stampo 3D-stampato; quindi dell'agarosi sono nel cast i negativi PDMS polimerizzati. Le cellule sono seminate nei pozzetti risultante dell'agarosi dove si aggregano in anelli di tessuto.

Fabbricazione di pozzi di agarosio personalizzato per la semina delle cellule e tessuto anello auto-assemblaggio utilizzando stampi 3D-stampato

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare stampi per la semina cellulare personalizzati che vengono utilizzati per realizzare anelli di tessuto autoassemblati di varie dimensioni. Questo metodo ci consente di creare anelli di tessuto tridimensionali da cellule umane che possono essere utilizzati per valutare la struttura, la forza e la funzione dei tessuti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di un metodo semplice per fabbricare stampi per tessuti autoassemblati con dimensioni personalizzate.Per iniziare la procedura, utilizzare un software di progettazione assistita da computer per creare un disegno di uno stampo nelle dimensioni desiderate. Invia il file CAD a una stampante 3D ad alta risoluzione. Stampa lo stampo in una plastica con una finitura lucida stabile a 50 gradi Celsius.Lavare accuratamente lo stampo stampato con un pennello, detersivo e acqua. Sciacquare lo stampo con acqua distillata e lasciarlo asciugare all'aria in una griglia. È importante scegliere una plastica stampata in 3D che sia stabile alla temperatura di polimerizzazione PDMS.I residui che si trasferiscono sul PDMS durante il riscaldamento possono influenzare la formazione degli anelli. Quindi, misurare 25 grammi di base PDMS in una navicella di pesa usa e getta. Aggiungere l'agente indurente in un rapporto di 1:10 in peso e mescolare energicamente fino a quando la base e l'agente indurente non sono completamente miscelati.Quindi, fissare del nastro adesivo da laboratorio attorno ai lati dello stampo per formare una parete alta circa un centimetro attorno alla faccia con i pozzetti stampati. Assicurarsi che non vi siano spazi vuoti nella parete del nastro. Versare la miscela PDMS nello stampo stampato in 3D.Degassare il PDMS in una camera a vuoto per 30-60 minuti o fino a quando non rimangono bolle. Polimerizzare il PDMS a 50 gradi Celsius per due o quattro ore o fino a quando il PDMS non è sufficientemente solido da essere rimosso dallo stampo. Quindi, rimuovere il nastro e separare con cura il negativo PDMS dallo stampo.Incubare il PDMS negativo in un forno a 60 gradi Celsius per un'ora per assicurarsi che sia completamente indurito. Quindi, lavare accuratamente il negativo con detersivo e acqua. Sciacquare lo stampo con acqua distillata e lasciarlo asciugare all'aria.Prima di fabbricare lo stampo di agarosio, sterilizzare in autoclave il negativo PDMS, un paio di pinze smussate e qualsiasi altro strumento desiderato. Per iniziare la fabbricazione, preparare e sterilizzare in autoclave almeno 50 millilitri di agarosio al due percento in DMEM. Preparare i pozzetti di agarosio un giorno prima della semina ad anello.Pipettare quattro millilitri di agarosio fuso nel negativo PDMS autoclavato, facendo attenzione a non riempire eccessivamente lo stampo. Quindi, pipettare l'agarosio fuso nelle cavità per i perni del pozzetto di agarosio. Utilizzare la punta della pipetta per rimuovere tutte le bolle d'aria.La superficie finale dell'agarosio deve essere piana. Lasciare raffreddare l'agarosio per circa 10 minuti. Quindi, utilizzare una pinza smussata per separare accuratamente lo stampo di agarosio raffreddato dal negativo PDMS.Posizionare lo stampo a faccia in su in un pozzetto di un piatto a sei pozzetti. Aggiungere il terreno di coltura completo appropriato al pozzetto della piastra in modo che i pozzetti dell'agarosio siano completamente sommersi. Equilibrare i pozzetti di agarosio a 37 gradi Celsius durante la notte prima dell'uso.In primo luogo, in un piatto di coltura di 15 centimetri, coltivare cellule muscolari lisce aortiche di ratto a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica al 5% fino a raggiungere la confluenza del 70%. Una volta che lo stampo di agarosio desiderato è stato preparato ed equilibrato per una notte, sciacquare due volte la piastra di coltura con cinque millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato. Dopo aver rimosso la PBS, aggiungere tre millilitri di tripzina allo 0,25% al piatto.Incubare a 37 gradi Celsius per due o tre minuti o fino a quando le cellule non si sono sollevate dal piatto. Neutralizzare la tripzina con tre millilitri del terreno di coltura completo. Trasferire le cellule in una provetta conica e pipettare delicatamente le cellule fino a quando non saranno completamente risospese.Diluire un aliquat della sospensione cellulare con un volume uguale di colorante blu di tripano e contare le cellule con un emocitometro. Quindi, centrifugare la sospensione a 200 volte G per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in un terreno di coltura completo per ottenere una concentrazione di 10 milioni di cellule per millilitro.I passaggi più importanti per garantire una formazione coerente degli anelli sono l'ottimizzazione del numero di cellule e del terreno di coltura per la linea cellulare che si sta utilizzando. Successivamente, ottenere i pozzetti di agarosio equilibrati. Aspirare con cura tutto il terreno sia intorno all'esterno dell'agarosio che all'interno dei pozzetti di agarosio, facendo attenzione a non forare il fondo dei pozzetti.Pipettare 50 microlitri della sospensione cellulare in ciascun pozzetto. Aggiungere due millilitri di terreno fresco intorno all'esterno dei pozzetti di agarosio senza lasciare che il terreno si riversi nei pozzetti. Incubare la piastra per una notte a 37 gradi Celsius in un'atmosfera al cinque percento di CO2 per consentire alle cellule di aggregarsi.Quindi, aspirare il terreno dall'esterno dell'agarosio. Aggiungere 4,5 millilitri di terreno fresco al pozzetto della piastra in modo che i pozzetti di agarosio siano riempiti e l'intero stampo di agarosio sia completamente sommerso. Continuare a incubare la piastra fino a quando gli anelli di tessuto non sono sufficientemente sviluppati, sostituendo il terreno ogni giorno.Quindi, fai scorrere delicatamente ogni anello di tessuto dal suo perno usando una pinza. Immediatamente, fissare gli anelli per l'istologia o utilizzare gli anelli per valutazioni funzionali o meccaniche. La stampa 3D ha consentito una progettazione dello stampo più flessibile.I diametri dei perni erano facilmente variabili, come mostrato dai miei anelli di cellule muscolari lisce di ratto fabbricati attorno a perni con diametri di due, quattro e dodici millimetri. Gli anelli di tessuto sono stati preparati anche da SMC umane primarie, cellule staminali mesenchimali umane e SMC derivate da cellule staminali pluripotenti indotte. Gli anelli sono stati utilizzati come modelli di tessuto in vitro per la valutazione della funzione tissutale e della resistenza meccanica.Sebbene questo metodo sia stato originariamente progettato per fabbricare e modellare il tessuto vascolare, può essere utilizzato anche per fabbricare segmenti di altri tipi di tessuto, come la cartilagine, il muscolo scheletrico e il tessuto cardiaco. Questo metodo fornisce ai ricercatori un modo semplice per creare stampi personalizzati per fabbricare anelli di tessuto 3D con dimensioni diverse. Questi anelli possono essere utilizzati per valutare la struttura, le proprietà meccaniche e la funzione di tessuti ingegnerizzati costituiti da diversi tipi di cellule.

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Fabbricazione di pozzi di agarosio personalizzato per la semina delle cellule e tessuto anello auto-assemblaggio utilizzando stampi 3D-stampato (Video) | JoVE Journal

Fabbricazione di pozzi di agarosio personalizzato per la semina delle cellule e tessuto anello auto-assemblaggio utilizzando stampi 3D-stampato

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