Fabbricazione di pozzi di agarosio personalizzato per la semina delle cellule e tessuto anello auto-assemblaggio utilizzando stampi 3D-stampato
2 aprile 2018
Questo protocollo descrive una piattaforma per la realizzazione di anelli di tessuto auto-assemblati usando una muffa di plastica su misura 3D-stampato di dimensioni variabili. PDMS negativi sono curati nello stampo 3D-stampato; quindi dell'agarosi sono nel cast i negativi PDMS polimerizzati. Le cellule sono seminate nei pozzetti risultante dell'agarosi dove si aggregano in anelli di tessuto.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare stampi per la semina cellulare personalizzati che vengono utilizzati per realizzare anelli di tessuto autoassemblati di varie dimensioni. Questo metodo ci consente di creare anelli di tessuto tridimensionali da cellule umane che possono essere utilizzati per valutare la struttura, la forza e la funzione dei tessuti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di un metodo semplice per fabbricare stampi per tessuti autoassemblati con dimensioni personalizzate.
Per iniziare la procedura, utilizzare un software di progettazione assistita da computer per creare un disegno di uno stampo nelle dimensioni desiderate. Invia il file CAD a una stampante 3D ad alta risoluzione. Stampa lo stampo in una plastica con una finitura lucida stabile a 50 gradi Celsius.
Lavare accuratamente lo stampo stampato con un pennello, detersivo e acqua. Sciacquare lo stampo con acqua distillata e lasciarlo asciugare all'aria in una griglia. È importante scegliere una plastica stampata in 3D che sia stabile alla temperatura di polimerizzazione PDMS.
I residui che si trasferiscono sul PDMS durante il riscaldamento possono influenzare la formazione degli anelli. Quindi, misurare 25 grammi di base PDMS in una navicella di pesa usa e getta. Aggiungere l'agente indurente in un rapporto di 1:10 in peso e mescolare energicamente fino a quando la base e l'agente indurente non sono completamente miscelati.
Quindi, fissare del nastro adesivo da laboratorio attorno ai lati dello stampo per formare una parete alta circa un centimetro attorno alla faccia con i pozzetti stampati. Assicurarsi che non vi siano spazi vuoti nella parete del nastro. Versare la miscela PDMS nello stampo stampato in 3D.
Degassare il PDMS in una camera a vuoto per 30-60 minuti o fino a quando non rimangono bolle. Polimerizzare il PDMS a 50 gradi Celsius per due o quattro ore o fino a quando il PDMS non è sufficientemente solido da essere rimosso dallo stampo. Quindi, rimuovere il nastro e separare con cura il negativo PDMS dallo stampo.
Incubare il PDMS negativo in un forno a 60 gradi Celsius per un'ora per assicurarsi che sia completamente indurito. Quindi, lavare accuratamente il negativo con detersivo e acqua. Sciacquare lo stampo con acqua distillata e lasciarlo asciugare all'aria.
Prima di fabbricare lo stampo di agarosio, sterilizzare in autoclave il negativo PDMS, un paio di pinze smussate e qualsiasi altro strumento desiderato. Per iniziare la fabbricazione, preparare e sterilizzare in autoclave almeno 50 millilitri di agarosio al due percento in DMEM. Preparare i pozzetti di agarosio un giorno prima della semina ad anello.
Pipettare quattro millilitri di agarosio fuso nel negativo PDMS autoclavato, facendo attenzione a non riempire eccessivamente lo stampo. Quindi, pipettare l'agarosio fuso nelle cavità per i perni del pozzetto di agarosio. Utilizzare la punta della pipetta per rimuovere tutte le bolle d'aria.
La superficie finale dell'agarosio deve essere piana. Lasciare raffreddare l'agarosio per circa 10 minuti. Quindi, utilizzare una pinza smussata per separare accuratamente lo stampo di agarosio raffreddato dal negativo PDMS.
Posizionare lo stampo a faccia in su in un pozzetto di un piatto a sei pozzetti. Aggiungere il terreno di coltura completo appropriato al pozzetto della piastra in modo che i pozzetti dell'agarosio siano completamente sommersi. Equilibrare i pozzetti di agarosio a 37 gradi Celsius durante la notte prima dell'uso.
In primo luogo, in un piatto di coltura di 15 centimetri, coltivare cellule muscolari lisce aortiche di ratto a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica al 5% fino a raggiungere la confluenza del 70%. Una volta che lo stampo di agarosio desiderato è stato preparato ed equilibrato per una notte, sciacquare due volte la piastra di coltura con cinque millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato. Dopo aver rimosso la PBS, aggiungere tre millilitri di tripzina allo 0,25% al piatto.
Incubare a 37 gradi Celsius per due o tre minuti o fino a quando le cellule non si sono sollevate dal piatto. Neutralizzare la tripzina con tre millilitri del terreno di coltura completo. Trasferire le cellule in una provetta conica e pipettare delicatamente le cellule fino a quando non saranno completamente risospese.
Diluire un aliquat della sospensione cellulare con un volume uguale di colorante blu di tripano e contare le cellule con un emocitometro. Quindi, centrifugare la sospensione a 200 volte G per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in un terreno di coltura completo per ottenere una concentrazione di 10 milioni di cellule per millilitro.
I passaggi più importanti per garantire una formazione coerente degli anelli sono l'ottimizzazione del numero di cellule e del terreno di coltura per la linea cellulare che si sta utilizzando. Successivamente, ottenere i pozzetti di agarosio equilibrati. Aspirare con cura tutto il terreno sia intorno all'esterno dell'agarosio che all'interno dei pozzetti di agarosio, facendo attenzione a non forare il fondo dei pozzetti.
Pipettare 50 microlitri della sospensione cellulare in ciascun pozzetto. Aggiungere due millilitri di terreno fresco intorno all'esterno dei pozzetti di agarosio senza lasciare che il terreno si riversi nei pozzetti. Incubare la piastra per una notte a 37 gradi Celsius in un'atmosfera al cinque percento di CO2 per consentire alle cellule di aggregarsi.
Quindi, aspirare il terreno dall'esterno dell'agarosio. Aggiungere 4,5 millilitri di terreno fresco al pozzetto della piastra in modo che i pozzetti di agarosio siano riempiti e l'intero stampo di agarosio sia completamente sommerso. Continuare a incubare la piastra fino a quando gli anelli di tessuto non sono sufficientemente sviluppati, sostituendo il terreno ogni giorno.
Quindi, fai scorrere delicatamente ogni anello di tessuto dal suo perno usando una pinza. Immediatamente, fissare gli anelli per l'istologia o utilizzare gli anelli per valutazioni funzionali o meccaniche. La stampa 3D ha consentito una progettazione dello stampo più flessibile.
I diametri dei perni erano facilmente variabili, come mostrato dai miei anelli di cellule muscolari lisce di ratto fabbricati attorno a perni con diametri di due, quattro e dodici millimetri. Gli anelli di tessuto sono stati preparati anche da SMC umane primarie, cellule staminali mesenchimali umane e SMC derivate da cellule staminali pluripotenti indotte. Gli anelli sono stati utilizzati come modelli di tessuto in vitro per la valutazione della funzione tissutale e della resistenza meccanica.
Sebbene questo metodo sia stato originariamente progettato per fabbricare e modellare il tessuto vascolare, può essere utilizzato anche per fabbricare segmenti di altri tipi di tessuto, come la cartilagine, il muscolo scheletrico e il tessuto cardiaco. Questo metodo fornisce ai ricercatori un modo semplice per creare stampi personalizzati per fabbricare anelli di tessuto 3D con dimensioni diverse. Questi anelli possono essere utilizzati per valutare la struttura, le proprietà meccaniche e la funzione di tessuti ingegnerizzati costituiti da diversi tipi di cellule.
Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per creare anelli di tessuto autoassemblati di dimensioni variabili utilizzando uno stampo personalizzato stampato in 3D. Il processo prevede la fabbricazione di negativi in PDMS e la colatura di agarosio per creare pozzetti destinati all'aggregazione cellulare.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Ingegneria tissutale
- Coltura cellulare
- Stampa 3D
Sfondo
- Gli anelli di tessuto autoassemblati possono essere utilizzati per studiare la struttura e la funzione dei tessuti.
- La stampa 3D consente la progettazione personalizzata degli stampi.
- Questa tecnica può essere applicata a diversi tipi di tessuti, inclusi tessuti vascolari e cardiaci.
- È fondamentale ottimizzare il numero di cellule e le condizioni di coltura per una corretta formazione degli anelli di tessuto.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo semplice per la fabbricazione di anelli di tessuto con dimensioni specifiche.
- Valutare le proprietà meccaniche e la funzionalità dei tessuti ingegnerizzati.
- Fornire una piattaforma per lo studio di diversi tipi cellulari nell'ingegneria dei tessuti.
Metodi Utilizzati
- Progettazione di stampi mediante software CAD e stampa 3D in plastica stabile.
- Creazione di negativi in PDMS e pozzetti in agarosio per la semina cellulare.
- Semina delle cellule nei pozzetti in agarosio e induzione dell'aggregazione in anelli di tessuto.
- Valutazione degli anelli di tessuto formati per le loro proprietà strutturali e funzionali.
Risultati principali
- Anelli di tessuto sono stati formati con successo a partire da diversi tipi cellulari, inclusi cellule muscolari lisce umane.
- Il metodo ha dimostrato flessibilità nella progettazione degli stampi e nella fabbricazione del tessuto.
- Gli anelli sono stati utilizzati per valutazioni in vitro della funzionalità del tessuto e della resistenza meccanica.
- Sono stati ottenuti anelli di tessuto di diverse dimensioni variando il diametro dei perni negli stampi.
Conclusioni
- Questo protocollo fornisce un modo semplice ed efficace per creare anelli di tessuto personalizzati.
- Può essere adattato per diverse applicazioni nell'ingegneria tissutale.
- La tecnica migliora lo studio dei tessuti ingegnerizzati e delle loro proprietà.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente ai team di ricerca e sviluppo biofarmaceutici di generare anelli di tessuto personalizzabili e privi di scaffold per modelli preclinici, supportando la riduzione del rischio meccanicistica dei candidati terapeutici. Permettendo un controllo preciso sulle dimensioni e sulla composizione del tessuto, aumenta l'affidabilità predittiva nelle fasi iniziali di validazione del bersaglio e nei flussi di lavoro di sviluppo dei saggi. L'approccio riduce la dipendenza da sistemi basati su scaffold, migliorando la rilevanza traslazionale per applicazioni di screening farmacologico e modellizzazione delle malattie.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante anelli di tessuto autoassemblati che chiariscono la funzionalità delle vie e l'interazione con il bersaglio.
- Valore operativo: Favorisce la riduzione del rischio biologico fornendo un sistema riproducibile per valutare la modulazione del bersaglio in contesti tessutali tridimensionali.
- Valore predittivo: Migliora la selezione del portafoglio generando letture funzionali che si correlano con le risposte tessutali ai composti.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce anelli di tessuto standardizzati e privi di scaffold adatti alla valutazione quantitativa degli effetti dei composti sulla meccanica e sulla funzione del tessuto.
- Valore operativo: Consente la pronta esecuzione del saggio attraverso la fabbricazione riproducibile di pozzetti in agarosio, riducendo la variabilità nelle campagne di screening successive.
- Scalabilità: Favorisce il riutilizzo della piattaforma su diversi tipi cellulari e modelli di tessuto, supportando cascami efficienti di valutazione dei composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica generando anelli di tessuto che imitano la struttura nativa del tessuto e le proprietà meccaniche.
- Sistema rilevante per le malattie: Consente la modellizzazione di tessuti vascolari, cardiaci, muscolari scheletrici e cartilaginei utilizzando fonti primarie o derivate da cellule staminali.
- Avanzamento basato sul rischio: Fornisce endpoint funzionali e istologici per informare decisioni di avanzamento o interruzione prima degli studi in vivo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta consentendo la fabbricazione di tessuti guidata da ipotesi, che informa l'identificazione dei composti promettenti mediante fenotipizzazione funzionale e meccanica.
- Biologia della scoperta: Supporta la riduzione del rischio meccanicistica consentendo ai team di valutare la formazione, la resistenza e la funzionalità del tessuto dipendenti dal target in un ambiente 3D controllato.
- Screening: Fornisce anelli di tessuto pronti per i saggi con dimensioni costanti, permettendo uno screening affidabile di composti per fenotipi a livello tessutale.
- Analisi: Offre output quantitativi, inclusi diametro del tessuto, forza contrattile e marcatori istologici, per l'analisi comparativa tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Garantisce continuità dalla scoperta all'uso preclinico generando modelli di tessuto applicabili alla valutazione meccanica, funzionale e istologica.
- Riutilizzo aziendale: Posiziona il flusso di lavoro con stampo 3D come piattaforma riutilizzabile per la generazione di diversi anelli di tessuto attraverso progetti e tipi cellulari.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica nelle interazioni con i tessuti bersaglio.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la riproducibilità grazie alla fabbricazione personalizzabile di stampi a bassa varianza.
- Valore strategico: Potenzia l'efficienza del capitale consentendo un'iterazione rapida dei modelli tessutali senza artefatti legati agli scaffold.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione aggiustata per il rischio fornendo precocemente dati funzionali sui modelli ingegnerizzati di tessuto.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella progettazione CAD, nella stampa 3D e nelle tecniche di coltura cellulare sterili.
- Necessita dell'accesso a una stampante 3D in grado di produrre parti in plastica lucida e termostabile, nonché a un'attrezzatura standard per la preparazione di PDMS e agarosio.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i parametri di progettazione degli stampi, le densità di semina cellulare e le condizioni di coltura, al fine di ottenere risultati riproducibili.
- Comporta la necessità di adattamenti quando si applica il metodo a diversi tipi cellulari o tessuti bersaglio, in particolare per quanto riguarda la concentrazione di agarosio e il diametro dei perni.
- Comprende limitazioni pratiche, come la necessità di una modellatura precisa dell'agarosio per evitare deformazioni delle camere e l'importanza di ottimizzare il numero di cellule per pozzetto al fine di garantire una formazione costante degli anelli.
