Fabbricazione di pozzi di agarosio personalizzato per la semina delle cellule e tessuto anello auto-assemblaggio utilizzando stampi 3D-stampato
April 2nd, 2018
Questo protocollo descrive una piattaforma per la realizzazione di anelli di tessuto auto-assemblati usando una muffa di plastica su misura 3D-stampato di dimensioni variabili. PDMS negativi sono curati nello stampo 3D-stampato; quindi dell'agarosi sono nel cast i negativi PDMS polimerizzati. Le cellule sono seminate nei pozzetti risultante dell'agarosi dove si aggregano in anelli di tessuto.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare stampi per la semina cellulare personalizzati che vengono utilizzati per realizzare anelli di tessuto autoassemblati di varie dimensioni. Questo metodo ci consente di creare anelli di tessuto tridimensionali da cellule umane che possono essere utilizzati per valutare la struttura, la forza e la funzione dei tessuti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di un metodo semplice per fabbricare stampi per tessuti autoassemblati con dimensioni personalizzate.
Per iniziare la procedura, utilizzare un software di progettazione assistita da computer per creare un disegno di uno stampo nelle dimensioni desiderate. Invia il file CAD a una stampante 3D ad alta risoluzione. Stampa lo stampo in una plastica con una finitura lucida stabile a 50 gradi Celsius.
Lavare accuratamente lo stampo stampato con un pennello, detersivo e acqua. Sciacquare lo stampo con acqua distillata e lasciarlo asciugare all'aria in una griglia. È importante scegliere una plastica stampata in 3D che sia stabile alla temperatura di polimerizzazione PDMS.
I residui che si trasferiscono sul PDMS durante il riscaldamento possono influenzare la formazione degli anelli. Quindi, misurare 25 grammi di base PDMS in una navicella di pesa usa e getta. Aggiungere l'agente indurente in un rapporto di 1:10 in peso e mescolare energicamente fino a quando la base e l'agente indurente non sono completamente miscelati.
Quindi, fissare del nastro adesivo da laboratorio attorno ai lati dello stampo per formare una parete alta circa un centimetro attorno alla faccia con i pozzetti stampati. Assicurarsi che non vi siano spazi vuoti nella parete del nastro. Versare la miscela PDMS nello stampo stampato in 3D.
Degassare il PDMS in una camera a vuoto per 30-60 minuti o fino a quando non rimangono bolle. Polimerizzare il PDMS a 50 gradi Celsius per due o quattro ore o fino a quando il PDMS non è sufficientemente solido da essere rimosso dallo stampo. Quindi, rimuovere il nastro e separare con cura il negativo PDMS dallo stampo.
Incubare il PDMS negativo in un forno a 60 gradi Celsius per un'ora per assicurarsi che sia completamente indurito. Quindi, lavare accuratamente il negativo con detersivo e acqua. Sciacquare lo stampo con acqua distillata e lasciarlo asciugare all'aria.
Prima di fabbricare lo stampo di agarosio, sterilizzare in autoclave il negativo PDMS, un paio di pinze smussate e qualsiasi altro strumento desiderato. Per iniziare la fabbricazione, preparare e sterilizzare in autoclave almeno 50 millilitri di agarosio al due percento in DMEM. Preparare i pozzetti di agarosio un giorno prima della semina ad anello.
Pipettare quattro millilitri di agarosio fuso nel negativo PDMS autoclavato, facendo attenzione a non riempire eccessivamente lo stampo. Quindi, pipettare l'agarosio fuso nelle cavità per i perni del pozzetto di agarosio. Utilizzare la punta della pipetta per rimuovere tutte le bolle d'aria.
La superficie finale dell'agarosio deve essere piana. Lasciare raffreddare l'agarosio per circa 10 minuti. Quindi, utilizzare una pinza smussata per separare accuratamente lo stampo di agarosio raffreddato dal negativo PDMS.
Posizionare lo stampo a faccia in su in un pozzetto di un piatto a sei pozzetti. Aggiungere il terreno di coltura completo appropriato al pozzetto della piastra in modo che i pozzetti dell'agarosio siano completamente sommersi. Equilibrare i pozzetti di agarosio a 37 gradi Celsius durante la notte prima dell'uso.
In primo luogo, in un piatto di coltura di 15 centimetri, coltivare cellule muscolari lisce aortiche di ratto a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica al 5% fino a raggiungere la confluenza del 70%. Una volta che lo stampo di agarosio desiderato è stato preparato ed equilibrato per una notte, sciacquare due volte la piastra di coltura con cinque millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato. Dopo aver rimosso la PBS, aggiungere tre millilitri di tripzina allo 0,25% al piatto.
Incubare a 37 gradi Celsius per due o tre minuti o fino a quando le cellule non si sono sollevate dal piatto. Neutralizzare la tripzina con tre millilitri del terreno di coltura completo. Trasferire le cellule in una provetta conica e pipettare delicatamente le cellule fino a quando non saranno completamente risospese.
Diluire un aliquat della sospensione cellulare con un volume uguale di colorante blu di tripano e contare le cellule con un emocitometro. Quindi, centrifugare la sospensione a 200 volte G per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in un terreno di coltura completo per ottenere una concentrazione di 10 milioni di cellule per millilitro.
I passaggi più importanti per garantire una formazione coerente degli anelli sono l'ottimizzazione del numero di cellule e del terreno di coltura per la linea cellulare che si sta utilizzando. Successivamente, ottenere i pozzetti di agarosio equilibrati. Aspirare con cura tutto il terreno sia intorno all'esterno dell'agarosio che all'interno dei pozzetti di agarosio, facendo attenzione a non forare il fondo dei pozzetti.
Pipettare 50 microlitri della sospensione cellulare in ciascun pozzetto. Aggiungere due millilitri di terreno fresco intorno all'esterno dei pozzetti di agarosio senza lasciare che il terreno si riversi nei pozzetti. Incubare la piastra per una notte a 37 gradi Celsius in un'atmosfera al cinque percento di CO2 per consentire alle cellule di aggregarsi.
Quindi, aspirare il terreno dall'esterno dell'agarosio. Aggiungere 4,5 millilitri di terreno fresco al pozzetto della piastra in modo che i pozzetti di agarosio siano riempiti e l'intero stampo di agarosio sia completamente sommerso. Continuare a incubare la piastra fino a quando gli anelli di tessuto non sono sufficientemente sviluppati, sostituendo il terreno ogni giorno.
Quindi, fai scorrere delicatamente ogni anello di tessuto dal suo perno usando una pinza. Immediatamente, fissare gli anelli per l'istologia o utilizzare gli anelli per valutazioni funzionali o meccaniche. La stampa 3D ha consentito una progettazione dello stampo più flessibile.
I diametri dei perni erano facilmente variabili, come mostrato dai miei anelli di cellule muscolari lisce di ratto fabbricati attorno a perni con diametri di due, quattro e dodici millimetri. Gli anelli di tessuto sono stati preparati anche da SMC umane primarie, cellule staminali mesenchimali umane e SMC derivate da cellule staminali pluripotenti indotte. Gli anelli sono stati utilizzati come modelli di tessuto in vitro per la valutazione della funzione tissutale e della resistenza meccanica.
Sebbene questo metodo sia stato originariamente progettato per fabbricare e modellare il tessuto vascolare, può essere utilizzato anche per fabbricare segmenti di altri tipi di tessuto, come la cartilagine, il muscolo scheletrico e il tessuto cardiaco. Questo metodo fornisce ai ricercatori un modo semplice per creare stampi personalizzati per fabbricare anelli di tessuto 3D con dimensioni diverse. Questi anelli possono essere utilizzati per valutare la struttura, le proprietà meccaniche e la funzione di tessuti ingegnerizzati costituiti da diversi tipi di cellule.
Panoramica
Questo protocollo delinea un metodo per creare anelli di tessuto autoassemblati di varie dimensioni utilizzando uno stampo personalizzato stampato in 3D. Il processo prevede la fabbricazione di negativi in PDMS e il colaggio di agarose per creare pozzetti per l'aggregazione cellulare.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Ingegneria tissutale
- Coltura cellulare
- Stampa 3D
Sfondo
- Gli anelli di tessuto autoassemblati possono essere utilizzati per studiare la struttura e la funzione dei tessuti.
- La stampa 3D consente design di stampi personalizzabili.
- Questa tecnica può essere applicata a vari tipi di tessuto, inclusi i tessuti vascolari e cardiaci.
- L'ottimizzazione del numero di cellule e delle condizioni di coltura è cruciale per una formazione riuscita degli anelli di tessuto.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo semplice per fabbricare anelli di tessuto con dimensioni specifiche.
- Valutare le proprietà meccaniche e la funzionalità dei tessuti ingegnerizzati.
- Fornire una piattaforma per studiare diversi tipi di cellule nell'ingegneria tissutale.
Metodi utilizzati
- Progettazione di stampi utilizzando software CAD e stampa 3D in plastica stabile.
- Creazione di negativi in PDMS e pozzetti in agarose per l'innesto cellulare.
- Innesto di cellule nei pozzetti in agarose e permettere loro di aggregarsi in anelli di tessuto.
- Valutazione degli anelli di tessuto formati per proprietà strutturali e funzionali.
Risultati principali
- Gli anelli di tessuto sono stati formati con successo da vari tipi di cellule, incluse le cellule muscolari lisce umane.
- Il metodo ha dimostrato flessibilità nel design dello stampo e nella fabbricazione del tessuto.
- Gli anelli sono stati utilizzati per valutazioni in vitro della funzione e della resistenza meccanica del tessuto.
- Sono state raggiunte diverse dimensioni di anelli di tessuto variando i diametri dei post negli stampi.
Conclusioni
- Questo protocollo fornisce un modo semplice ed efficace per creare anelli di tessuto personalizzati.
- Può essere adattato per varie applicazioni nell'ingegneria tissutale.
- La tecnica migliora lo studio dei tessuti ingegnerizzati e delle loro proprietà.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D teams to generate customizable, scaffold-free tissue rings for preclinical modeling, supporting mechanistic de-risking of therapeutic candidates. By allowing precise control over tissue dimensions and composition, it enhances predictive confidence in early-stage target validation and assay development workflows. The approach reduces reliance on scaffold-based systems, improving translational relevance for drug screening and disease modeling applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through self-assembled tissue rings that clarify pathway functionality and target engagement.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing a reproducible system to evaluate target modulation in 3D tissue contexts.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by generating functional readouts that correlate with tissue-level responses to compounds.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, scaffold-free tissue rings suitable for quantitative assessment of compound effects on tissue mechanics and function.
- Operational Value: Enables assay readiness through reproducible agarose well fabrication, reducing variability in downstream screening campaigns.
- Scalability: Facilitates platform reuse across multiple cell types and tissue models, supporting efficient compound evaluation cascades.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by generating tissue rings that mimic native tissue structure and mechanical properties.
- Disease-Relevant System: Supports modeling of vascular, cardiac, skeletal muscle, and cartilage tissues using primary or stem cell-derived sources.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides functional and histological endpoints to inform go/no-go decisions before in vivo studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven tissue fabrication, which informs lead identification through functional and mechanical phenotyping.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by allowing teams to assess target-dependent tissue formation, strength, and function in a controlled 3D environment.
- Screening: Delivers assay-ready tissue rings with consistent dimensions, enabling reliable compound screening for tissue-level phenotypes.
- Analytics: Provides quantitative outputs including tissue diameter, contractile force, and histological markers for comparative condition analysis.
- Translational Research: Ensures continuity from discovery to preclinical use by generating tissue models applicable to mechanical, functional, and histological evaluation.
- Enterprise Reuse: Positions the 3D-printed mold workflow as a reusable platform for generating diverse tissue rings across projects and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in tissue-target interactions.
- Operational Value: Improves standardization and reproducibility through customizable, low-variance mold fabrication.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by enabling rapid iteration of tissue models without scaffold-related artifacts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering early functional data on tissue-engineered models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CAD design, 3D printing, and sterile tissue culture techniques.
- Needs access to a 3D printer capable of producing glossy, heat-stable plastic parts and standard PDMS/agarose preparation equipment.
- Demands cross-team standardization of mold design parameters, cell seeding densities, and culture conditions for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different cell types or tissue targets, particularly regarding agarose concentration and post diameter.
- Includes practical limitations such as the need for precise agarose molding to avoid well deformation and the importance of optimizing cell number per well for consistent ring formation.
