L'ingestione di fluorescente, nanoparticelle magnetiche per determinare la capacità di assorbimento di liquido negli insetti

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di valutare i parametri fisiologici dell'alimentazione negli insetti che si nutrono di fluidi utilizzando una soluzione di saccarosio miscelata con nanoparticelle magnetiche fluorescenti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'entomologia, come la struttura, la funzione, le relazioni delle parti della bocca degli insetti e i meccanismi di alimentazione degli insetti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ci permette di determinare se gli insetti sono in grado di ingerire fluidi presenti sia come piscine che come film liquidi.

Questa dimostrazione utilizza mosche bottiglia blu perché le loro capacità di assorbimento dei liquidi e la morfologia della parte orale sono ben documentate. Potrebbero essere utilizzate mosche domestiche, farfalle cavoli e altri insetti che si nutrono di liquidi. Procuratevi delle pupe di mosca e mettetele in una camera ambientale con 18 ore di luce al giorno e a 23 gradi Celsius.

Dopo che gli adulti emergono dalle loro pupe, non dar loro da mangiare prima dell'esperimento. Per l'alimento sperimentale, preparare una soluzione di saccarosio al 20% con nanoparticelle da 0,5 milligrammi per millilitro. Quindi, preparare una stazione di alimentazione composta da un manipolatore, una pinza e uno stadio di alimentazione.

Nella fase di alimentazione, tenere il cibo con uno scivolo concavo. Inoltre, preparare vari filtri a rete in nylon e filtri a membrana di diverse dimensioni dei pori per coprire il vetrino concavo. Inizia avvolgendo il corpo, le zampe e le ali dell'insetto in una carta velina piegata.

Lasciare scoperte solo le parti della testa e della bocca. Mentre lo fai, mantieni l'insetto al sicuro pizzicando le sue ali insieme. Ora, fissare le ali avvolte in carta velina tra due vetrini da microscopio.

Quindi bloccare le due slitte e fissare il morsetto a un manipolatore. Quindi, fissare l'insetto sopra la fase di alimentazione utilizzando il manipolatore. Quindi, depositare 30 microlitri di soluzione di alimentazione al centro del vetrino concavo e coprire la soluzione con un pezzo di carta da filtro porosa.

La gocciolina si diffonderà lungo la carta da filtro riempiendo i pori. Quindi, posizionare l'insetto in modo che le regioni distali delle parti della bocca possano entrare in contatto con la carta da filtro bagnata in modo tale che solo la parte piatta del vetrino possa essere raggiunta e l'insetto non possa nutrirsi dalla regione concava. Ora, usa uno spillo per insetti per estendere le parti della bocca sulla carta da filtro e lascia che l'insetto si nutra per 45 secondi.

Se l'insetto non esprime interesse a nutrirsi, tenere l'apparato boccale sulla carta da filtro per il riempimento di 45 secondi utilizzando lo spillo. Questo completa il protocollo di alimentazione. Per la dissezione, caricare un vetro da 50 millilitri con abbastanza PBS da coprire il corpo dell'insetto.

Installalo insieme a tutti gli strumenti di dissezione al microscopio. A questo punto, togliete l'insetto dalla carta velina tenendo le ali chiuse. Quindi, rimuovere la testa, le zampe e le ali utilizzando le forbici da microdissezione a molla e posizionare il torace e l'addome nel PBS.

Per sezionare l'intestino, prima afferrare la cuticola dell'addome distale e tagliare la cuticola in direzione anteriore lungo il lato laterale dall'estremità posteriore al torace. Prestare particolare attenzione per garantire che venga tagliata solo la cuticola e che il canale alimentare non venga danneggiato. Quindi, rimuovere la cuticola addominale, il corpo grasso e altre strutture con l'aiuto di spilli per insetti fino a quando solo il torace e il canale alimentare rimangono nel vetro dell'orologio.

Ora, identifica il raccolto. È una struttura simile a un sacco, situata vicino alla giunzione del torace e dell'addome. Se necessario, praticare ulteriori incisioni nel torace per rivelare il raccolto.

Quindi, tagliare via il torace rimanente lasciando solo il canale alimentare e il gozzo. Per verificare la presenza di nanoparticelle ingerite, iniziare utilizzando una pinza da dissezione a punta fine per trasferire la coltura su un vetrino coprioggetti per l'imaging. Prestare attenzione per evitare la rottura del raccolto.

Visualizzate immediatamente il ritaglio su un microscopio confocale invertito con un ingrandimento di 20 volte utilizzando il canale CY3 o il contrasto di fase. Per identificare le nanoparticelle ingerite, agitare una barra di agitazione magnetica a circa 10 millimetri dalla coltura. Fai in modo che ogni movimento avanti e indietro richieda circa un secondo.

Mentre si agita il magnete, spostare lentamente lo stadio operativo per cercare il movimento delle nanoparticelle all'interno del raccolto quasi trasparente. Se le nanoparticelle sono presenti nella coltura, ondeggeranno all'unisono con l'ancoretta magnetica. Un insetto che si nutre di soluzione da una superficie porosa deve creare un ponte liquido stabile attraverso l'instabilità del plateau per superare la pressione capillare che mantiene il liquido nei pori.

Si prevede che la dimensione del condotto di alimentazione di un insetto determinerà la dimensione dei pori più piccola da cui possono nutrirsi. Dopo che gli insetti sono stati sezionati per valutare se le nanoparticelle sono state ingerite, le loro parti della bocca sono state visualizzate per misurare le dimensioni del condotto del canale alimentare. Per le mosche, sono stati misurati il diametro della pseudotrachea e l'apertura orale.

L'analisi delle nanoparticelle ingerite suggerisce una stretta relazione tra la dimensione del condotto della parte della bocca distale e la dimensione dei pori più piccola da cui un insetto può nutrirsi. Questa relazione non si vede con le parti prossimali della bocca. Di conseguenza, l'assorbimento di liquidi per i ditteri avverrebbe prima nella pseudotrachea piuttosto che nell'apertura orale e l'azione capillare deve avere un ruolo importante nell'alimentazione.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come nutrire gli insetti con una soluzione di nanoparticelle, sezionarli per isolare il loro raccolto e quindi ispezionare il raccolto per le nanoparticelle. Durante il tentativo di questa procedura, è importante prestare attenzione durante le dissezioni. Se il raccolto si rompe, può fuoriuscire il contenuto liquido e le nanoparticelle, rovinando così il campione.