Name: In Vivo EPR valutazione di pH, pO2, lo stato Redox e le concentrazioni di fosfato e glutatione nel microambiente tumorale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Scopri la tecnologia EPR in vivo per valutare pH, ossigeno e stato redox nel microambiente tumorale utilizzando sonde paramagnetiche funzionali. Questo metodo non invasivo fornisce dati quantitativi per la ricerca preclinica sul cancro.

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Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto da NIH concede CA194013, CA192064 e U54GM104942. Il WVCTSI è riconosciuto per start-up a VVK, AB e TDE. Gli autori ringraziano il Dr. M. Gencheva e K. Steinberger per l'assistenza con gli esperimenti illustrativi. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del NIH.

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

I metodi presentati consentono per la valutazione non invasiva in vivo dei parametri critici della TME chimica, vale a dire pO2, pH, stato redox e le concentrazioni di GSH intracellulare e interstiziale Pi. Tecniche di risonanza magnetica, quali MRI e basso campo EPR, sono i metodi di scelta per non invasiva in vivo profilatura di questi parametri TME. MRI Visualizza le strutture anatomiche, ma manca di sensibilità funzionale. In contrasto con MRI, EPR tecniche forniscono sensibilità...

Un ruolo chiave della TME nella progressione del cancro e nella terapia è sempre più apprezzato1. Tra le importanti parametri fisiologici della TME in tumori solidi, di ipossia del tessuto2, acidosi3,4, alta riduzione capacità5, elevate concentrazioni di GSH intracellulare6,7, e interstiziale Pi8 sono ben documentati. Valutazioni di2, pH, Pi, GSH e redox non invasiva in vivo pO forniscono intuizioni uniche i processi biologici nella TME e aiutano anticipo strumenti per lo screening pre-clinico di farmaci anti-cancro e strategie terapeutiche mirate TME. Una radiofrequenza ragionevole profondità di penetrazione nei tessuti da formazione immagine a risonanza magnetica (MRI) e tecniche basate su EPR a basso campo li rende gli approcci più appropriati per la valutazione non invasiva di questi parametri TME. MRI si basa in gran parte su imaging protoni di acqua ed è ampiamente usato nelle regolazioni cliniche fornire risoluzione anatomica ma manca funzionale ad alta risoluzione. Le misure di risonanza magnetica nucleare di fosforo-31 (31P-NMR) di extracellulare Pi concentrazione e pH basato su un segnale da fosfato endogeno sono potenzialmente interessanti per la caratterizzazione di TME, ma normalmente sono mascherate da diverse volte superiore intracellulare Pi concentrazioni9,10. Al contrario, misure EPR si basano sulla spettroscopia e imaging del appositamente progettato sonde paramagnetiche per fornire la risoluzione funzionale. Nota che esogeno EPR sonde hanno un vantaggio su esogeno NMR sonde dovuto la sensibilità intrinseca molto più elevata di EPR e assenza di segnali EPR sfondo endogeno. Il recente sviluppo di una duplice funzione pH e redox nitrossidi sonda11 e multifunzionale trityl sonda12 fornisce opportunità insuperabile per in vivo misure simultanee di diversi parametri di TME e loro analisi di correlazione indipendente sulla sonda distribuzione e tempo di misura. A nostra conoscenza, non ci sono nessun altri metodi disponibili per valutare simultaneamente in vivo fisiologicamente importanti parametri TME chimici in soggetti viventi, come pO2, pHe, Pi, redox e GSH.
Sonde per In Vivo Misure funzionali:
La figura 1 Mostra strutture chimiche delle sonde paramagnetiche utilizzate per accedere ai parametri TME, che comprendono le sonde del particolato e solubile. Alta sensibilità funzionale, stabilità nel tessuto vivente e tossicità minima sono alcuni vantaggi che fanno del particolato sonde preferiti sopra solubile sonde per in vivo ossimetria EPR. Ad esempio, sonde di particolato sono aumentati tempi di ritenzione al sito di impianto del tessuto rispetto alle sonde solubile che permette di misurare longitudinale del tessuto pO2 sopra parecchie settimane. D'altra parte, sonde solubile sovraperformare particolati sonde fornendo misurazioni spaziali risolto utilizzando basati su EPR tecniche di imaging nonché consentendo analisi concomitante da molteplici funzionalità (pO2, pH, Pi, redox, e GSH).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56624/56624fig1.jpg"> Figura 1. Strutture chimiche delle sonde paramagnetiche che assemblare analisi valutazione TME. Questo include il particolato pO2 sonda, LiNc-BuO (R = - O (CH2)3CH3) e sonde solubile: sonda di pH e redox di funzione dual, NR; Sonda di GSH-sensibili, Simonerasetti; e multifunzionale pO2, pH e sonda di Pi del microambiente extracellulare, la sonda di speranza. La sintesi di queste sonde è stato descritto nei riferimenti forniti 11,12. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56624/56624fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Spettrometro EPR in banda L</td><td>Magnettech, Germania</td><td></td><td>Spettrometro a risonanza paramagnetica elettronica (EPR) in banda L (1,2 GHz) per la raccolta di spettri in vitro e in vivo di molecole paramagnetiche</td></tr><tr><td>. Temperatura & Regolatore del gas&nbsp;</td><td>Noxygen, Germania</td><td></td><td>Temperatura & Regolatore di gas progettato per controllare e regolare la temperatura e la composizione del gas. &nbsp;</td></tr><tr><td>Sonicatore</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSH (L-Glutatione ridotto)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>MMTV-PyMT&nbsp; topi</td><td>DMEM</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Met-1 cellule di carcinoma mammario murino</td><td>In casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6 topi wild type&nbsp;</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Exclusion Dye&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Ohmeda Fluotec 3&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano (IsoFlo)</td><td>Abbott Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato monobasico</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S07051</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di Sodio</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucosio ossidasi</td><td>sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lauda Circolatore E100</td><td>Lauda-Brikmann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pHmetro Orion</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonda LiNc-BuO</td><td>Interna</td><td></td><td>La sonda Octa-n-Butossi-Naftalocianina è stata sintetizzata secondo la sonda NR ref 13</td></tr><tr><td>Interna</td><td></td><td></td><td>La sonda Nitrossido è stata sintetizzata secondo la</td></tr><tr><td>sonda RSSR</td> rif. 11 Sonda <td>Interna</td><td></td><td>La sonda di-Nitrossido è stata sintetizzata secondo la sonda</td></tr><tr><td>HOPE probe</td><td>Internamente</td><td></td><td>La sonda triarilmetilica monofoshonata è stata sintetizzata secondo ref 12</td></tr></tbody></table>

in vivo epr valutazione di ph, po2, lo stato redox e le concentrazioni di fosfato e glutatione nel microambiente tumorale

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Questo protocollo dimostra le capacità di risonanza paramagnetica elettronica di basso campo (EPR)-basato su tecniche in combinazione con sonde paramagnetiche funzionale a fornire informazioni quantitative sul microambiente tumorale chimica (TME), tra cui p O2, lo stato redox, pH, concentrazioni di fosfato inorganico interstiziale (Pi) e intracellulare del glutatione (GSH). In particolare, un'applicazione di una sonda sviluppata di recente solubile trityl multifunzionale offre opportunità insuperabile per in vivo misure simultanee di pHe pO2 Pi a E spazio inases (sonda di speranza). Le misure dei tre parametri utilizzando una singola sonda permettono per le loro analisi di correlazione indipendente di distribuzione sonda e ora delle misurazioni.

Tessuto p O 2 Sonde di valutazione utilizzando il LiNc-BuO:
Utilizzando la procedura descritta nella sezione passaggio 1.1, abbiamo effettuato la taratura della sospensione di microcristalli LiNc-BuO preparati al momento. Figura 2 Mostra la dipendenza di ossigeno tipico di linewidth della sonda L...

Risonanza paramagnetica elettronica di basso campo (banda L, 1.2 GHz) usando le sonde nitrossidi e trityl solubile è dimostrata per la valutazione dei parametri fisiologicamente importanti nel microambiente tumorale in modelli murini di cancro al seno.

In Vivo EPR valutazione di pH, pO2, lo stato Redox e le concentrazioni di fosfato e glutatione nel microambiente tumorale

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

L'obiettivo generale di questa tecnologia di risonanza paramagnetica elettronica in vivo è quello di valutare quantitativamente e non invasivamente i parametri fisiologicamente rilevanti del microambiente tissutale locale in contesti preclinici in modelli animali di cancro. Questa tecnica si basa sulla combinazione di APR di campo di fluoro con sonde paramagnetiche funzionali di speciale design per fornire informazioni quantitative sull'ossigenazione dei tessuti come CDT nello stato di dock, nonché fosfato organico interstiziale e concentrazioni intercellulari. Questa tecnica non invasiva fornisce una visione unica del mondo del microambiente tumorale e della regenesi tumorale e può contribuire alla futura progettazione razionale di terapie antitumorali mirate al microambiente tumorale.L'applicazione di questa tecnica si estende alla correlazione cerebrale tra i parametri di applicazione delle sonde APR multifunzionali. Fornendo così ulteriori informazioni sui meccanismi biologici sottostanti. Oltre a me e Andrey, a dimostrare la procedura saranno Marieta Gencheva e il Dr.Benoit Driesschaert e una studentessa laureata, Kayla Steinberger dell'IMMR Center.Per preparare la sonda sensibile all'ossigeno particolato, pesare prima 60 milligrammi di microcristalli. Per la calibrazione della sensibilità all'ossigeno, sospendere i microcristalli in tre millilitri di terreno d'aquila modificato dolbeckas. Sonica per cinque minuti, sul ghiaccio, con un sonicatore a sonda a 20 kilohertz utilizzando sette watt di potenza in un tubo inferiore rotondo di vetro da cinque millilitri.Quindi, posizionare un millilitro di microcristalli sonicati in un tubo di vetro nel dispositivo di avvolgimento superficiale dello spettrometro EPR in banda L. Acquisisci spettri EPR a onde continue alla temperatura fisiologica di 37 gradi Celsius e concentrazioni di ossigeno di zero, uno, due, quattro, otto e 20,9%. Per preparare la sonda di pH e redox a doppia funzione, sciogliere 6,34 milligrammi di sonda in un millilitro di soluzione salina.Regolare il pH a 7,2 con piccole allocazioni di acido cloridrico o idrossido di sodio utilizzando un pHmetro. Per eseguire la calibrazione del pH della sonda di nitrossido, aggiungere prima 0,1 millilitri della soluzione madre della sonda a 0,9 millilitri di tampone fosfato di sodio a due millimolari, 150 millimolari di cloruro di sodio. Quindi titolare la soluzione di sonda millimolare ottenuta con allocati di acido cloridrico o idrossido di sodio al pH richiesto utilizzando un pHmetro.Registrare gli spettri EPR dei campioni in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri utilizzando lo spettrometro EPR in banda L. Per preparare la sonda RSSR sensibile al GSH, sciogliere 4,05 milligrammi della sonda in un millilitro di soluzione di DMSO. Successivamente, determinare il valore della costante di velocità della reazione di RSSR con GSH.Per fare ciò, aggiungere prima 20 microlitri della soluzione madre RSSR a 0,98 millilitri di un tampone fosfato millimolare pH 7,2, 150 millimolare di cloruro di sodio per ottenere una soluzione sonda RSSR 0,2 millimolare. Quindi mescolare volumi uguali di soluzione RSSR 0,2 millimolare in una delle soluzioni GSH per una concentrazione finale della sonda a 0,1 millimolare e di GSH a 0,5, uno o 2,5 millimolare. Immediatamente dopo la miscelazione delle soluzioni RSSR e GSH, posizionare il campione nel dimissionario EPR e registrare gli spettri EPR ogni 12 secondi per 10 minuti.Quindi calcolare la cinetica dell'aumento dell'ampiezza spettrale del monoradicale per la sonda multifunzionale HOPE per la valutazione del pH e del Pi greco dell'ossigeno. Sciogliere 10,7 milligrammi di sonda in un millilitro di soluzione salina e regolare il pH a 7,4. Quindi aggiungere 20 microlitri della soluzione madre preparata a 0,98 millilitri della soluzione salina per ottenere una soluzione sonda da 0,2 millimolari.Per la calibrazione del pH con sonda, titolare 0,2 millimolari della soluzione della sonda mediante l'aggiunta di un piccolo volume di idrossido di sodio o acido cloridrico in modo che la diluizione finale del campione inferiore all'1% acquisisca gli spettri EPR a pH intermedio come descritto nel protocollo di testo. Per la calibrazione della sonda di sensibilità all'ossigeno, acquisire gli spettri EPR della sonda a varie concentrazioni di ossigeno come descritto nel protocollo di testo. Per la calibrazione della sonda di Pi, acquisire gli spettri EPR della sonda a varie concentrazioni di fosfato.Utilizzare la soluzione radicalica con un valore di pH vicino al PKA e titolarla con varie concentrazioni di fosfato. Mantenere la temperatura e la composizione del gas come prima. Nel caso del modello tumorale MET1 per l'internalizzazione della sonda particellare in cellule MET1, aggiungere 100 microlitri di sospensione sonicata a un pallone T75 con 10 millilitri di terreno di coltura contenente cellule MET1.Tutte le procedure si svolgono in una cabina di biosicurezza e il terreno contiene penicillina e streptomicina per ridurre al minimo la potenziale infezione. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 72 ore o fino a raggiungere circa l'80% di confluenza. Aspirare il terreno e lavare le cellule cinque volte con 10 millilitri di PBS.Staccare le cellule con cinque millilitri di tripson EDTA. Dopo aver raccolto le cellule e centrifugato come prima, colorare il campione di cellule del colorante di esclusione per determinare la vitalità e la quantità cellulare. Sospendere le cellule a una concentrazione di un milione di cellule per 100 microlitri in DMEM minimo.Utilizzando una siringa da insulina, iniettare lentamente 100 microlitri della sospensione cellulare contenente i microcristalli internalizzati nel numero quattro di cuscinetti adiposi mammari di un topo femmina di otto settimane, di tipo selvatico, come descritto nel protocollo di testo. Monitorare l'inizio e la crescita del tumore. Per le misurazioni spettroscopiche EPR, anestetizzare i topi mediante inalazione di una miscela di aria isoflorane utilizzando una macchina per anestesia come descritto nel protocollo di testo.Eseguire misurazioni funzionali utilizzando uno spettrometro EPR in banda L posizionando il rassegnatore della bobina superficiale su una ghiandola mammaria normale o su un tumore mammario. Procedere con la messa a punto dello spettrometro. Nel caso di sonde solubili, acquisire gli spettri EPR immediatamente dopo l'iniezione della sonda per cinque-10 minuti.Acquisire gli spettri EPR dalla sonda antiparticolato impiantata per 5-10 minuti nell'arco di diverse settimane dopo l'impianto. Infine, analizzare gli spettri EPR e le sonde come descritto nel protocollo di testo. Qui è mostrata la sensibilità spettrale EPR della sonda LiNc-BuO particellare all'ossigeno.Lo spettro EPR è stato misurato allo 0% di pO2 e a 37 gradi Celsius. Sono mostrati i dipendenti rappresentativi della larghezza della linea dello spettro EPR della sospensione della sonda alla pressione parziale dell'ossigeno. La larghezza della linea aumenta linearmente con la pO2.Uno spettro misurato nel tessuto tumorale mammario di un topo femmina anestetizzato corrisponde a un ossigeno parziale tissutale di 7,5 millimetri di mercurio. Gli spettri EPR in banda L della soluzione della sonda NR sono stati acquisiti a 37 gradi Celsius a vari livelli di pH. Le dipendenti della costante di scissione iperfine osservata sul pH vengono tracciate e adattate con la curva di titolazione standard.Di seguito è illustrata la valutazione multifunzionale del microambiente tumorale che combina la sonda LiNc-BuO sensibile all'ossigeno nella sonda NR redox a doppia funzione per pH. Lo spettro del tripletto osservato del NR è sovrapposto alla singola linea EPR della sonda LiNc-BuO incorporata all'interno del tumore. Qui viene mostrata la valutazione EPR in vivo delle concentrazioni di glutatione nei tessuti intracellulari.Viene mostrata la cinetica della variazione spettrale dell'intensità del peek monoradicale misurata mediante EPR in banda L nel tumore mammario nella ghiandola mammaria normale di topi FVBN immediatamente dopo l'iniezione intratissutale della sonda RSSR. La cinetica più veloce riflette la maggiore concentrazione di GSH nel tessuto tumorale. La tecnica assiste i ricercatori nel campo della ricerca sul cancro con un'opportunità superata per l'esecuzione in vivo di importanti parametri fisiologici cellulari del microambiente tumorale e del transpotenziale per la traduzione.La sensibilità delle sonde secondo le procedure precedenti richiede competenze in chimica sintetica ed è fondamentale per la presentazione. Il nostro centro ha segnalato le difficoltà di questa tecnologia e ai siti su base collaborativa.

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L'imaging bioluminescenza di ipossia-inducibile fattore 1α attività è applicata a monitorare lo sviluppo del tumore ipossia cerebrale in un modello di cancro al seno del mouse metastasi al cervello.

In Imaging bioluminescenza in vivo di Dinamica Tumore ipossia di metastasi cerebrali cancro al seno in un modello murino

Qui, il monitoraggio in tempo reale del metabolismo delle cellule tumorali, combinato con un modello di metastasi in vivo di membrana corio-allantoica (CAM) di embrione di pollo, viene utilizzato per valutare nuovi bersagli/agenti antitumorali per la loro capacità di sensibilizzare le cellule tumorali ai chemioterapici dannosi per il DNA.

Valutare l&#39;efficacia delle Cancer Drug Sensibilizzazione<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Un metodo rapido di scansione EPR (RS-EPR) nuovo paramagnetica elettronica di risonanza (EPR), è dimostrata per l'imaging 2D spaziale spettrale che è superiore alla tecnica tradizionale onda continua (CW) e apre nuove sedi per l'imaging in vivo. I risultati sono dimostrati a 250 MHz, ma la tecnica è applicabile a qualsiasi frequenza.

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Questo manoscritto descrive lo sviluppo di un modello animale che permette di testare direttamente gli effetti dell'ipossia tumorale sulle metastasi e di decifrare i meccanismi della sua azione. Sebbene gli esperimenti qui descritti si concentrino sul sarcoma di Ewing, un approccio simile può essere applicato ad altri tipi di tumore.

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Descriviamo un non-invasiva in vivo imaging protocol che è semplice e conveniente, utilizzando L-012, un a chemiluminescenza luminol-analogico, per visualizzare e quantificare le specie reattive dell'ossigeno (ROS) generate in un modello murino di excisional ferita.

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Scopri la tecnologia EPR in vivo per valutare pH, ossigeno e stato redox nel microambiente tumorale utilizzando sonde paramagnetiche funzionali. Questo metodo non invasivo fornisce dati quantitativi per la ricerca preclinica sul cancro.

In Vivo EPR valutazione di pH, pO₂, lo stato Redox e le concentrazioni di fosfato e glutatione nel microambiente tumorale

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