Name: In Vivo EPR valutazione di pH, pO2, lo stato Redox e le concentrazioni di fosfato e glutatione nel microambiente tumorale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Scopri la tecnologia EPR in vivo per valutare pH, ossigeno e stato redox nel microambiente tumorale utilizzando sonde paramagnetiche funzionali. Questo metodo non invasivo fornisce dati quantitativi per la ricerca preclinica sul cancro.

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Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto da NIH concede CA194013, CA192064 e U54GM104942. Il WVCTSI è riconosciuto per start-up a VVK, AB e TDE. Gli autori ringraziano il Dr. M. Gencheva e K. Steinberger per l'assistenza con gli esperimenti illustrativi. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del NIH.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

I metodi presentati consentono per la valutazione non invasiva in vivo dei parametri critici della TME chimica, vale a dire pO2, pH, stato redox e le concentrazioni di GSH intracellulare e interstiziale Pi. Tecniche di risonanza magnetica, quali MRI e basso campo EPR, sono i metodi di scelta per non invasiva in vivo profilatura di questi parametri TME. MRI Visualizza le strutture anatomiche, ma manca di sensibilità funzionale. In contrasto con MRI, EPR tecniche forniscono sensibilità...

Un ruolo chiave della TME nella progressione del cancro e nella terapia è sempre più apprezzato1. Tra le importanti parametri fisiologici della TME in tumori solidi, di ipossia del tessuto2, acidosi3,4, alta riduzione capacità5, elevate concentrazioni di GSH intracellulare6,7, e interstiziale Pi8 sono ben documentati. Valutazioni di2, pH, Pi, GSH e redox non invasiva in vivo pO forniscono intuizioni uniche i processi biologici nella TME e aiutano anticipo strumenti per lo screening pre-clinico di farmaci anti-cancro e strategie terapeutiche mirate TME. Una radiofrequenza ragionevole profondità di penetrazione nei tessuti da formazione immagine a risonanza magnetica (MRI) e tecniche basate su EPR a basso campo li rende gli approcci più appropriati per la valutazione non invasiva di questi parametri TME. MRI si basa in gran parte su imaging protoni di acqua ed è ampiamente usato nelle regolazioni cliniche fornire risoluzione anatomica ma manca funzionale ad alta risoluzione. Le misure di risonanza magnetica nucleare di fosforo-31 (31P-NMR) di extracellulare Pi concentrazione e pH basato su un segnale da fosfato endogeno sono potenzialmente interessanti per la caratterizzazione di TME, ma normalmente sono mascherate da diverse volte superiore intracellulare Pi concentrazioni9,10. Al contrario, misure EPR si basano sulla spettroscopia e imaging del appositamente progettato sonde paramagnetiche per fornire la risoluzione funzionale. Nota che esogeno EPR sonde hanno un vantaggio su esogeno NMR sonde dovuto la sensibilità intrinseca molto più elevata di EPR e assenza di segnali EPR sfondo endogeno. Il recente sviluppo di una duplice funzione pH e redox nitrossidi sonda11 e multifunzionale trityl sonda12 fornisce opportunità insuperabile per in vivo misure simultanee di diversi parametri di TME e loro analisi di correlazione indipendente sulla sonda distribuzione e tempo di misura. A nostra conoscenza, non ci sono nessun altri metodi disponibili per valutare simultaneamente in vivo fisiologicamente importanti parametri TME chimici in soggetti viventi, come pO2, pHe, Pi, redox e GSH.
Sonde per In Vivo Misure funzionali:
La figura 1 Mostra strutture chimiche delle sonde paramagnetiche utilizzate per accedere ai parametri TME, che comprendono le sonde del particolato e solubile. Alta sensibilità funzionale, stabilità nel tessuto vivente e tossicità minima sono alcuni vantaggi che fanno del particolato sonde preferiti sopra solubile sonde per in vivo ossimetria EPR. Ad esempio, sonde di particolato sono aumentati tempi di ritenzione al sito di impianto del tessuto rispetto alle sonde solubile che permette di misurare longitudinale del tessuto pO2 sopra parecchie settimane. D'altra parte, sonde solubile sovraperformare particolati sonde fornendo misurazioni spaziali risolto utilizzando basati su EPR tecniche di imaging nonché consentendo analisi concomitante da molteplici funzionalità (pO2, pH, Pi, redox, e GSH).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56624/56624fig1.jpg"> Figura 1. Strutture chimiche delle sonde paramagnetiche che assemblare analisi valutazione TME. Questo include il particolato pO2 sonda, LiNc-BuO (R = - O (CH2)3CH3) e sonde solubile: sonda di pH e redox di funzione dual, NR; Sonda di GSH-sensibili, Simonerasetti; e multifunzionale pO2, pH e sonda di Pi del microambiente extracellulare, la sonda di speranza. La sintesi di queste sonde è stato descritto nei riferimenti forniti 11,12. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56624/56624fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Spettrometro EPR in banda L</td><td>Magnettech, Germania</td><td></td><td>Spettrometro a risonanza paramagnetica elettronica (EPR) in banda L (1,2 GHz) per la raccolta di spettri in vitro e in vivo di molecole paramagnetiche</td></tr><tr><td>. Temperatura & Regolatore del gas&nbsp;</td><td>Noxygen, Germania</td><td></td><td>Temperatura & Regolatore di gas progettato per controllare e regolare la temperatura e la composizione del gas. &nbsp;</td></tr><tr><td>Sonicatore</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSH (L-Glutatione ridotto)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>MMTV-PyMT&nbsp; topi</td><td>DMEM</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Met-1 cellule di carcinoma mammario murino</td><td>In casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6 topi wild type&nbsp;</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Exclusion Dye&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Ohmeda Fluotec 3&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano (IsoFlo)</td><td>Abbott Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato monobasico</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S07051</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di Sodio</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucosio ossidasi</td><td>sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lauda Circolatore E100</td><td>Lauda-Brikmann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pHmetro Orion</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonda LiNc-BuO</td><td>Interna</td><td></td><td>La sonda Octa-n-Butossi-Naftalocianina è stata sintetizzata secondo la sonda NR ref 13</td></tr><tr><td>Interna</td><td></td><td></td><td>La sonda Nitrossido è stata sintetizzata secondo la</td></tr><tr><td>sonda RSSR</td> rif. 11 Sonda <td>Interna</td><td></td><td>La sonda di-Nitrossido è stata sintetizzata secondo la sonda</td></tr><tr><td>HOPE probe</td><td>Internamente</td><td></td><td>La sonda triarilmetilica monofoshonata è stata sintetizzata secondo ref 12</td></tr></tbody></table>

in vivo epr valutazione di ph, po2, lo stato redox e le concentrazioni di fosfato e glutatione nel microambiente tumorale

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Questo protocollo dimostra le capacità di risonanza paramagnetica elettronica di basso campo (EPR)-basato su tecniche in combinazione con sonde paramagnetiche funzionale a fornire informazioni quantitative sul microambiente tumorale chimica (TME), tra cui p O2, lo stato redox, pH, concentrazioni di fosfato inorganico interstiziale (Pi) e intracellulare del glutatione (GSH). In particolare, un'applicazione di una sonda sviluppata di recente solubile trityl multifunzionale offre opportunità insuperabile per in vivo misure simultanee di pHe pO2 Pi a E spazio inases (sonda di speranza). Le misure dei tre parametri utilizzando una singola sonda permettono per le loro analisi di correlazione indipendente di distribuzione sonda e ora delle misurazioni.

Tessuto p O 2 Sonde di valutazione utilizzando il LiNc-BuO:
Utilizzando la procedura descritta nella sezione passaggio 1.1, abbiamo effettuato la taratura della sospensione di microcristalli LiNc-BuO preparati al momento. Figura 2 Mostra la dipendenza di ossigeno tipico di linewidth della sonda L...

Risonanza paramagnetica elettronica di basso campo (banda L, 1.2 GHz) usando le sonde nitrossidi e trityl solubile è dimostrata per la valutazione dei parametri fisiologicamente importanti nel microambiente tumorale in modelli murini di cancro al seno.

In Vivo EPR valutazione di pH, pO2, lo stato Redox e le concentrazioni di fosfato e glutatione nel microambiente tumorale

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

L'obiettivo generale di questa tecnologia di risonanza paramagnetica elettronica in vivo è quello di valutare quantitativamente e non invasivamente i parametri fisiologicamente rilevanti del microambiente tissutale locale in contesti preclinici in modelli animali di cancro. Questa tecnica si basa sulla combinazione di APR di campo di fluoro con sonde paramagnetiche funzionali di speciale design per fornire informazioni quantitative sull'ossigenazione dei tessuti come CDT nello stato di dock, nonché fosfato organico interstiziale e concentrazioni intercellulari. Questa tecnica non invasiva fornisce una visione unica del mondo del microambiente tumorale e della regenesi tumorale e può contribuire alla futura progettazione razionale di terapie antitumorali mirate al microambiente tumorale.L'applicazione di questa tecnica si estende alla correlazione cerebrale tra i parametri di applicazione delle sonde APR multifunzionali. Fornendo così ulteriori informazioni sui meccanismi biologici sottostanti. Oltre a me e Andrey, a dimostrare la procedura saranno Marieta Gencheva e il Dr.Benoit Driesschaert e una studentessa laureata, Kayla Steinberger dell'IMMR Center.Per preparare la sonda sensi

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Qui, il monitoraggio in tempo reale del metabolismo delle cellule tumorali, combinato con un modello di metastasi in vivo di membrana corio-allantoica (CAM) di embrione di pollo, viene utilizzato per valutare nuovi bersagli/agenti antitumorali per la loro capacità di sensibilizzare le cellule tumorali ai chemioterapici dannosi per il DNA.

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Un metodo rapido di scansione EPR (RS-EPR) nuovo paramagnetica elettronica di risonanza (EPR), è dimostrata per l'imaging 2D spaziale spettrale che è superiore alla tecnica tradizionale onda continua (CW) e apre nuove sedi per l'imaging in vivo. I risultati sono dimostrati a 250 MHz, ma la tecnica è applicabile a qualsiasi frequenza.

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Orthotopic iniezione intracranico delle cellule del tumore è stato utilizzato nella ricerca sul cancro per studiare la biologia del tumore di cervello, la progressione, evoluzione e risposta terapeutica. Qui presentiamo la tomografia molecolare fluorescenza degli xenotrapianti del tumore, che fornisce in tempo reale videomicroscopia imaging e quantificazione di un tumore di massa in modelli preclinici di glioblastoma.

Fluorescenza tomografia molecolare per l'Imaging In Vivo di Glioblastoma xenotrapianti

Spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica (EPR) è un metodo univoco per misurare i radicali liberi. L'utilizzo di sonde di spin selettiva permette per la rilevazione dei radicali liberi in diversi compartimenti cellulari. Presentiamo un metodo pratico, efficiente per raccogliere campioni biologici che facilitano il trattamento, l'archiviazione e trasferire campioni per misure di EPR.

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Descriviamo due metodi per valutare la permeabilità vascolare transitoria associata al microambiente tumorale della funzione di metastasi (TMEM) e all'intravasazione delle cellule tumorali utilizzando l'iniezione endovenosa di peso molecolare elevato (155 kDa) dextran nei topi. I metodi includono l'imaging intravitale in animali vivi e l'analisi dei tessuti fissi utilizzando l'immunofluorescenza.

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Abbiamo sviluppato un metodo riproducibile per visualizzare l'internalizzazione dell'adenosina trifosfato fluorescente non idrolizzabile (ATP), un surrogato di ATP, ad alta risoluzione cellulare. Abbiamo convalidato il nostro metodo utilizzando saggi indipendenti in vitro e in vivo: linee cellulari tumorali umane e topi immunodeficienti xenografati con tessuto tumorale umano.

Microscopia a fluorescenza per l'internalizzazione dell'ATP mediata dalla macropinocitosi in cellule tumorali umane e topi xenotrapiantati da tumore

Descriviamo un protocollo per la produzione, la coltura e la visualizzazione dei tumori umani, che hanno metastatizzato alle superfici peritoneali. I campioni tumorali resecati vengono tagliati utilizzando un vibratomo e coltivati su inserti permeabili per una maggiore ossigenazione e vitalità, seguiti da imaging e analisi a valle utilizzando microscopia confocale e citometria a flusso.

Coltura e imaging di fette tumorali ex vivo di pseudomixoma peritonei organotipico da campioni tumorali umani resecati

Le mappe quantitative 3D dell'ossigeno dei tumori murini sono state visualizzate in modo non invasivo utilizzando la risonanza paramagnetica dell'elettrone a impulsi. L'ecografia B-mode e il Power Doppler sono stati utilizzati per l'anatomia e la struttura vascolare. Le immagini di entrambe le modalità sono state sovrapposte consentendo l'analisi multiparametrica del tumore.

Valutazione dell'ipossia tumorale: imaging 3D dell'ossigeno in vivo attraverso la risonanza paramagnetica elettronica 

Scopri la tecnologia EPR in vivo per valutare pH, ossigeno e stato redox nel microambiente tumorale utilizzando sonde paramagnetiche funzionali. Questo metodo non invasivo fornisce dati quantitativi per la ricerca preclinica sul cancro.

In Vivo EPR valutazione di pH, pO₂, lo stato Redox e le concentrazioni di fosfato e glutatione nel microambiente tumorale

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