Name: Sintesi del monocito-targeting Peptide Amphiphile micelle per lImaging di aterosclerosi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Impara la sintesi di micelle peptidiche anfifile per il targeting dei monociti nell'imaging dell'aterosclerosi. Questo metodo migliora la specificità diagnostica per distinguere le lesioni precoci dalle avanzate.

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Gli autori si desidera ringraziare il sostegno finanziario alla University of Southern California, il National Heart, Lung e Blood Institute (NHLBI), R00HL124279, Eli ed Edythe Broad Innovation Award e il L.K. Whittier Foundation Non-cancro Premio di ricerca traslazionale concesso a EJC. Gli autori ringraziano il centro per la microscopia elettronica e microanalisi, centro di eccellenza in NanoBiophysics, centro di eccellenza per la caratterizzazione molecolare e traduzione Imaging Center presso la University of Southern California per assistenza in configurazioni di strumentale.

Nota: Leggere la scheda di sicurezza per i reagenti e seguire tutte le misure di sicurezza chimica come richiesto dall'istituzione locale.
1. preparazione di MCP-1 PAMs
<ol><li>
Preparazione del peptide di MCP-1
	<ol>
<li>Pesare 0,25 mmol di Fmoc-L-Lys (Boc)-Wang in un recipiente di reazione (RV). Sciacquare il lato del camper con 5ml dimethylforamide (DMF) in una cappa chimica.</li>
		<li>Caricare il camper su un sintetizzatore di peptidi di benchtop automatizzato. Carico pre-confezionato aminoacido fiale, N '- CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C', dal C a N-terminale. Includere un flaconcino vuoto alla fine per il passo finale deprotezione. Nota: Può anche essere sintetizzato un peptide strapazzato con la sequenza, N '- CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK - C', usando lo stesso protocollo.</li>
		<li>Una volta terminata la sintesi, trasferire i peptidi su resina da RV nella fiala di scintillazione con 2-3 mL di metanolo fino a quando tutti le resine vengono trasferiti. Dopo la resina ha affondato verso il basso, rimuovere il surnatante di metanolo e far evaporare il rimanente fino a secco. Vuoto a secco per ulteriori 2 ore o una notte a temperatura ambiente.</li>
		<li>Fare 12 mL di soluzione di clivaggio contenente trifluoracetic acido (TFA):ethanedithiol:water:triisopropylsilane al 94:2.5:2.5:1 vol % in una cappa chimica. Agitare la soluzione di fenditura per assicurarsi che viene miscelato in modo uniforme. Attenzione: Poiché triisopropylsilane ed etanditiolo sono aria-sensibile, argon spurgo stock flaconcini di triisopropylsilane ed etanditiolo per 1 min prima di rimetterle.</li>
		<li>Posizionare il vaso di sintesi (SV) su un agitatore per braccio di bloccaggio nella parte inferiore metà della SV. Trasferimento del peptide-resina al SV con 2 mL di soluzione di fenditura fino a quando tutti il peptide-resine vengono trasferiti.</li>
		<li>Lavare i lati dello SV con 3 mL di soluzione di clivaggio. Chiudere il tappo della SV e agitare a 300 oscillazioni/min per 4 h.</li>
		<li>Pesare una provetta vuota 50ml. Registrare la massa.</li>
		<li>Dopo 4 h, è possibile scaricare la soluzione peptide fenduto dalla SV nella provetta da centrifuga 50 mL. Sciacquare la SV parecchie volte con la soluzione rimanente di clivaggio.</li>
		<li>Evaporare la soluzione peptide fenduto con azoto fino a quando c'è meno di 4 mL restanti la provetta da centrifuga.</li>
		<li>Aggiungere alla soluzione di peptide-spaccati 36 mL di etere ghiacciata.</li>
		<li>Vortex la soluzione fino a quando è completamente bianca o gialla. Centrifugare a 3.000 x g per 5 min a 4 ° C e decantare il supernatante.</li>
		<li>Aggiungere 40 mL di etere ghiacciata al tubo. Vortice e Sonicare nuovamente. Ripetere il processo di centrifugazione. Decantare il supernatante.</li>
		<li>Asciugare il pellet PA grezzo con azoto gas spurgo fino a che l'etere è visibilmente volatilizzato.</li>
		<li>Aggiungere 20 mL bidistillata acqua, vortice e trattare con ultrasuoni fino a quando il peptide è completamente dissolto nella soluzione.</li>
		<li>Congelare la soluzione e lyophilize fino a secco.</li>
		<li>Una volta che il peptide è asciugato, pesare la massa della provetta da centrifuga contenente il peptide grezzo. Sciogliere il peptide grezzo in 5 mg/mL di acqua.</li>
		<li>Sciogliere 25 mg di greggio MCP-1 peptide in 5 mL di acqua bidistillata per rendere una concentrazione totale di 5 mg/mL. Purificare il peptide grezzo di MCP-1 mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) con 0,1% TFA in acqua (solvente A) e 0,1% TFA in acetonitrile (solvente B) come fasi mobili su una colonna in fase inversa C8. Iniettare 5 mL del peptide in HPLC. Nota: La fase mobile iniziale consisteva di solvente al 100% A una portata di 9,0 mL/min diminuire solvente A lentamente al 30% in 27 min e tenere a questa composizione per 3 min ritorno la sfumatura al 100% solvente un oltre 3 min e permanenza a questa composizione per 1 min dare un totale di run-time di almeno 34 mantenere la temperatura della colonna a 55 ° C. Modalità di sorgente di ioni positivi di utilizzo per l'analisi. L'acido formico può essere utilizzato al posto di TFA, se TFA è troppo acido per la colonna HPLC. È consigliabile che la velocità di rampa di composizione solvente organico non deve superare 2%/min per la separazione migliore.</li>
		<li>Analizzare ogni frazione usando la spettrometria totale di matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) per il prodotto previsto m/z a 2.890. Nota: Sciogliere l'acido α-ciano-4-idrossicinnamico a 1 mg/mL in acetonitrile/acqua (50: 50% in volume) come la soluzione di matrice. Spot 0,75 µ l di soluzione di matrix sulla piastra MALDI, seguita da 0,75 µ l di ciascuna frazione. Eseguire l'analisi utilizzando una modalità ioni positivi riflettente a un intervallo di massa di 500-5.000 Da.</li>
		<li>Combinare le frazioni di prodotto, soffiare via acetonitrile, congelare e lyophilize peptidi purificati fino a secco.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di MCP-1 PA
	<ol>
<li>Preparare un 1,1 eccesso molare di 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-PEG (2000)-maleimide al peptide in flaconi separati scintillazione. Sciogliere entrambi i composti in acqua bidistillata per rendere ~ 15 mg/mL. Sottoporre ad ultrasuoni per 15 minuti o fino a quando entrambe le soluzioni sono completamente chiare. Nota: DSPE-PEG (2000)-Cy5 è sintetizzato utilizzando lo stesso protocollo con DSPE-PEG (2000)-ammina e Cy5 estere-funzionalizzati N-Idrossisuccinimide (NHS), fatta eccezione per passo 1.2.3, dove il pH della soluzione è regolato a 8,5.</li>
		<li>Aggiungere DSPE-PEG (2000)-con soluzione alla soluzione del peptide. Vortice e Sonicare.</li>
		<li>Aggiungere 1 M NaOH goccia a goccia (1 µ l) alla volta fino a quando il pH della soluzione è 7.</li>
		<li>Soluzione di eliminazione dei fogli inceppati di azoto per 5 min, agitare la soluzione durante la notte.</li>
		<li>Congelare la soluzione e lyophilize fino a secco.</li>
		<li>Una volta essiccato il prodotto grezzo, sciogliere il solido a 5 mg/mL di acqua.</li>
		<li>Purificare con HPLC come descritto sopra. Nota: Peptide non coniugata e DSPE-PEG(2000) dovrebbe eluire tra 15-30% di concentrazione organica (% vol), mentre DSPE-PEG (2000)-MCP-1 coniugato dovrebbe eluire tra 40-50% di concentrazione organica.</li>
		<li>Analizzare ogni frazione utilizzando la spettrometria di massa MALDI per corrispondente m/z DSPE-PEG (2000)-MCP-1 dovrebbe avere un picco di ampia m/z a 5.760. Nota: l'acido 2,5-dihydroxybenzoic è meglio utilizzato come la matrice per DSPE-PEG (2000)-MCP-1 con MALDI.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Assemblea di MCP-1 PAMs
	<ol>
<li>Sciogliere 1,75 mg PAs di MCP-1 con 3 mL di metanolo in un flaconcino 1-dram. Sonicare fino alla completa dissoluzione della PA di MCP-1. Nota: Cy5 anfifili possono essere incorporato con un rapporto molare di 10:90 MCP-1 PA per applicazioni di imaging.</li>
		<li>Far evaporare il metanolo sotto azoto in un movimento circolare durante il risciacquo il metanolo restante fuori il lato del flaconcino fino a formare una pellicola uniforme nella parte inferiore della fiala. Vuoto-il film durante la notte a secco.</li>
		<li>Idratare il film con 3 mL di tampone fosfato o acqua salino (PBS) per ottenere una soluzione di 100 µM di MCP-1 PAMs. Delicatamente il vortice e Sonicare la soluzione fino a clear. Incubare a 80 ° C per 30 min. Nota: La temperatura elevata è stata indicata per accelerare il processo auto-assemblaggio e consente al componente di peptide formare la struttura secondaria più stabile, riducendo il micellare critica (CMC) concentrazione42,43.</li>
		<li>Raffreddare la conseguente dispersione a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. caratterizzazione di MCP-1 PAMs
<ol><li>
Diffusione dinamica della luce (DLS) e potenziale zeta
	<ol>
<li>Posto 100 µM di MCP-1 PAM o strapazzate PAM in una cuvetta secondo le istruzioni dello strumento potenziale DLS o zeta. Nota: DLS e zeta cuvette potenziali possono essere diversi in base alle istruzioni dello strumento.</li>
		<li>Equilibrare lo strumento a temperatura ambiente. Misurare le dimensioni e la carica superficiale di PAM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Microscopia elettronica a trasmissione (TEM)
	<ol>
<li>Aggiungere 7 µ l di 50 µM MCP-1 PAM o PAM uova strapazzate su una griglia TEM sospeso all'interno di una pinzetta autochiusura per 5 min stoppino via la goccia con un panno delicato compito.</li>
		<li>7 µ l di acqua per lavare la griglia. Stoppino via la goccia.</li>
		<li>Aggiungere 7 µ l di acido fosfotungstico di % wt 1 per 2 min. stoppino via la goccia. Ripetere il punto 2.2.2.</li>
		<li>Asciugare la griglia TEM prima dell'analisi TEM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Spettroscopia di dicroismo circolare (CD)
	<ol>
<li>Accendere l'azoto per 5-10 minuti prima dell'uso dello strumento.</li>
		<li>Mettere 300 µ l di vuoto (acqua o PBS) nella provetta.</li>
		<li>Misurare gli spettri a 190-265 nm, 0.2 mm-lunghezza del percorso con un tempo di integrazione 1 s e una larghezza di 1 banda nm a temperatura ambiente. Raccogliere 3 replicati.</li>
		<li>Misura 100 µM peptide di MCP-1, MCP-1 PAM, uova strapazzate peptide e strapazzate PAM sotto la stessa condizione descritta al punto 2.3.3. Sottrarre dallo spazio vuoto.</li>
		<li>Adattare i dati utilizzando un'interpolazione lineare di polilisina spettri di base.</li>
		<li>Spegnere lo strumento. Attendere 10 minuti prima di spegnere l'azoto.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. analisi in Vitro di MCP-1 PAMs
<ol><li>
Biocompatibilità in vitro
	<ol>
<li>Cultura ed espandere WEHI 274.1 monociti murini in per volta Eagle supplementato di Dulbecco con 10% siero bovino fetale (FBS), 1% di penicillina-streptomicina e 0,05 mM 2-mercaptoetanolo a 37 ° C inferiore al 5% di CO2 al passaggio 5. Nota: WEHI 274.1 sono cellule in sospensione. Quando la coltura, i mezzi di comunicazione dovrebbe essere rifornito ogni 2-3 giorni.</li>
		<li>Monociti di dispensare in media in una provetta sterile da 50 mL. Centrifugare a 300 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>Aspirare i vecchi media e risospendere in media fresco 10ml nella provetta da centrifuga. Mescolare lentamente fino a quando le cellule sono distribuite uniformemente nei media. Contare le celle usando la macchiatura blu di trypan e un emocitometro.</li>
		<li>Diluire le cellule tale che ci sono 4.000 monociti a 90 µ l di media per pozzetto. Aggiungere 90 µ l di cellule nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Incubare per 24 h. Nota: Non utilizzare i pozzi sul bordo esterno della piastra per evitare differenze di evaporazione e sbalzi termici nella piastra. Riempire i pozzetti esterni con 100 µ l PBS.</li>
		<li>Sciogliere 0,15 µmol di peptide MCP-1, MCP-1 PAM, peptide strapazzato o uova strapazzate-PAM in 150 µ l PBS in microcentrifuga separata, sterilizzato. Effettuare diluizioni seriali per rendere 65 µ l di 1, 10 e 100 µM di ciascun campione.</li>
		<li>Aggiungere 10 µ l PBS di ciascuna concentrazione in pozzetti contenenti WEHI 274.1 (volume totale: 100 µ l per bene, 6 linee, totale 96 pozzetti). Incubare per 72 h.</li>
		<li>Aggiungere 10 µ l (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (MTS) in ciascun pozzetto. Incubare per 1 h.</li>
		<li>Analizzare l'assorbanza utilizzando un lettore di piastra a 490 nm o in base alle istruzioni del produttore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
In vitro associazione micella
	<ol>
<li>Monociti seme 500.000 in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti in 2 mL di supporto contenente 100 µM Cy5-labeled PAM di MCP-1 (rapporto molare di 10:90 di DSPE-PEG (2000)-Cy5 e MCP-1 PA). Incubare per 1 h.</li>
		<li>Raccogliere WEHI 274.1 mediante centrifugazione a 300 x g per 5 min a 4 ° C. Aspirare i media.</li>
		<li>Risospendere e lavare le cellule in 2 mL di PBS. Centrifugare a 300 x g per 5 min a 4 ° C. Aspirare il PBS. Ripetere il processo di lavaggio con 2 mL di PBS. Aspirare il PBS.</li>
		<li>Aggiungere 2 mL di freddo paraformaldeide al 4% per fissare le cellule. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.</li>
		<li>Dispensare le cellule fissate su un vetrino coprioggetti di vetro sterile all'interno dei pozzetti di una piastra a 6 pozzetti. Centrifugare a 400 x g per 5 min.</li>
		<li>Rimuovere il paraformaldeide. Lavare e sciacquare una volta con 2 mL di PBS. Risospendere con 1 mL di PB Nota: Durante il risciacquo, evitare di perturbare le cellule sul vetrino coprioggetti.</li>
		<li>Mettere 10 µ l di glicerolo 90% in PBS in una diapositiva. Utilizzare un ago e una pinzetta per ritirare il vetrino coprioggetti. Asciugare il bordo del coverslip. Posizionare delicatamente il vetrino coprioggetti in una diapositiva rivolto verso il basso.</li>
		<li>Delicatamente e sigillate il bordo del coprivetrino con smalto trasparente. Mettere in frigorifero fino al momento per l'imaging.</li>
		<li>Utilizzare un laser confocale scansione microscopio (CLSM) installato con laser per Cy5 a λeccitazione = 650 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

MCP-1 PAMs sono una promettente piattaforma di imaging molecolare, costituito da un peptide di targeting idrofilo e coda idrofobica che spinge la natura auto-assemblata di nanoparticella. Questa micella monocito-targeting può essere preparato da semplice sintesi e fasi di purificazione del peptide di MCP-1 e DSPE-PEG (2000)-MCP-1. PAMs hanno molte caratteristiche benefiche per in vivo imaging molecolare come loro self-assembly sotto condizioni blande, biodegradabilità intrinseca e diversità strutturali e chimich...

Le malattie cardiovascolari rimangono per essere le principali cause di morte a livello mondiale con circa 17,3 milioni di morti in tutto il mondo1. Le malattie cardiovascolari sono fornite da aterosclerosi, una condizione in cui si accumulano le placche nelle arterie, quindi inibente sangue e flusso di ossigeno alle cellule del corpo2,3. La progressione di aterosclerosi coinvolge l'ispessimento e l'indurimento delle arterie da una risposta infiammatoria, metabolismo dei lipidi irregolare e l'accumulazione della placca, che conduce a placca la rottura e l'infarto miocardico4,5. Le cellule endoteliali esprimono molecole di adesione e citochine, che comprendono MCP-1, che si lega al recettore di chemochine C-C (CCR2) presente sulla superficie dei monociti6,7,8. Il colesterolo ossidato converte i monociti macrofagi durante la fase iniziale della formazione di placche, che amplifica la risposta infiammatoria nella regione e porta alla lesione del tessuto e la formazione di placche instabili o vulnerabili9, 10.
Tradizionalmente, l'aterosclerosi viene valutata valutando stenosi luminal da imaging anatomico mediante angiografia o ultrasuono11,12. Tuttavia, questi metodi possono determinare solo lo stringimento severo della parete arteriosa e non lo stadio precoce di aterosclerosi, come crescita iniziale della placca causa rimodellamento arterioso mantenere le dimensioni dell'arteria e sangue flusso tasso12,13, 14. Di conseguenza, gli angiogrammi underrepresent prevalenza di aterosclerosi. Inoltre, tecniche di imaging non invasive come singola emissione del fotone computato tomografia, tomografia a emissione di positroni e la risonanza magnetica recentemente sono state usate per caratterizzare la morfologia della placca come possono fornire informazioni iniziali e caratterizzazione delle placche. Tuttavia, queste modalità sono spesso limitate dalla mancanza di sensibilità, risoluzione spaziale, o richiedono l'uso di radiazioni ionizzanti, rendendo imaging progressione della placca nelle diverse fasi molto più impegnativo15,16, 17. Un sistema di consegna imaging che identificherebbe specificamente placche nelle diverse fasi di aterosclerosi rimane ad essere sviluppato.
Le nanoparticelle hanno dimostrato di essere una piattaforma emergente per in vivo della placca di targeting e diagnostica18,19,20,21. In particolare, PAMs sono vantaggiose grazie alla loro diversità chimica e la possibilità di ospitare una varietà di moiety, composizioni, dimensioni, forme e funzionalizzazione superficiale22. Peptide anfifili (PAs) sono costituiti da un peptide "capigruppo idrofilo," attaccato a una coda idrofobica, che in genere sono i lipidi; Questa struttura anfifilica conferisce la capacità di auto-assemblaggio e consente una visualizzazione multivalente di peptidi sulla superficie delle particelle22,23,24. Il peptide headgroups possono influenzare la forma delle particelle attraverso pieghevoli e legame tra peptidi25dell'idrogeno. Peptidi che piega attraverso l'interazione di β-foglio sono stati indicati per formare micelle allungate, mentre α-elica conferma può formare entrambe micelle sferiche e allungata22,23,24, 25,26,27. Linker di polietilenglicole (PEG) che lo scudo la carica superficiale del peptide può essere collocato tra il peptide idrofilo e la coda idrofobica di PAMs, migliorare la disponibilità della nanoparticella in circolazione sistemica28, 29 , 30 , 31. PAMs sono vantaggiose anche perché sono biocompatibili e hanno dimostrati di avere una vasta gamma di applicazioni32,33. La solubilità in acqua delle micelle offre un vantaggio sopra altri sistemi basati su nanoparticelle come certe nanoparticelle polimeriche che non sono solubili in acqua e devono essere sospese in res per iniezioni34. Inoltre, la possibilità di creare PAMs smontare in risposta a un stimoli specifici rende PAMs un attraente candidato per controllato di farmaci intracellulari di consegna35.
Legandosi al recettore CCR2 e accumulando nell'arco aortico, PAMs precedentemente sono state sviluppate per monocito targeting per monitorare le diverse fasi delle lesioni aterosclerotiche dell'aorta9. In topi ApoE- / - monocito accumulo aumenta proporzionalmente a placca progressione36. Inoltre, è emerso che i pazienti con placche rottura-incline, fase avanzata contengono una maggiore quantità di monociti37. Pertanto, la modifica di PAMs incorporare MCP-1 è utile perché permette una maggiore specificità targeting e differenziazione tra lesioni aterosclerotiche e tardo-fase iniziale. Questi studi di proof-of-concept anche verificato che PAMs sono abbastanza sicura di essere utilizzato preclinicamente e vengono eliminate per via renale38. Poiché i monociti e infiammazione sono caratteristici di altre malattie, MCP-1 PAMs hanno il potenziale per essere utilizzato per applicazioni terapeutiche e diagnostiche in altre malattie oltre l'aterosclerosi8,39,40 , 41.
Qui, segnaliamo la realizzazione di auto-assemblati e scalabile PAMs di MCP-1 che ha dimostrato la dimensione ottimale della particella, carica superficiale e targeting selettivo di monociti per applicazioni avanzate di imaging nell'aterosclerosi.

<table><tbody><tr><td>1,2-etanedithiol</td><td>VWR</td><td>E0032</td><td>per la sintesi di peptidi</td></tr><tr><td>10 mL pipette sierologiche monouso</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td>per colture cellulari</td></tr><tr><td>15 mL provette da centrifuga, polipropilene</td><td>VWR</td><td>89401-566</td><td>per varie applicazioni</td></tr><tr><td>Acido 2,5-diidrossibenzoico, 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC165200050</td><td>per MALDI</td></tr><tr><td>25 mL monouso pipette sierologiche</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td>per colture cellulari</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo, 50 mM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350010</td><td>per colture cellulari</td></tr><tr><td>5 mL pipette sierologiche monouso</td><td>VWR</td><td>89130-896</td><td>per colture cellulari</td></tr><tr><td>50 mL provette da centrifuga</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td>per varie applicazioni</td></tr><tr><td>Pallone di coltura da 75 cm2</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-680-65</td><td>per coltura cellulare</td></tr><tr><td>recipiente di reazione da 75 mL</td><td>Protein Technologies</td><td>3000005</td><td>per la sintesi di peptidi</td></tr><tr><td>piastra per colture cellulari a 96 pozzetti</td><td>VWR</td><td>40101-346</td><td>per saggio MTS</td></tr><tr><td>Acetonitrile, grado HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998SK-4</td><td>per purificazione HPLC</td></tr><tr><td>Vetro borosilicato, 1 dram</td><td>VWR</td><td>66011-041</td><td>per la sintesi PAM</td></tr><tr><td>Pipetta in vetro borosillicato, punte lunghe</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td>per varie applicazioni</td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti, 0,16-0,19 mm, 22 x 22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B</td><td>per microscopia confocale</td></tr><tr><td>Cy5 ammina</td><td>Abcam</td><td>ab146463</td><td>per coniugazione di peptidi</td></tr><tr><td>Etere dietilico, grado ACS</td><td>Fisher Scientific</td><td>E138-1</td><td>per precipitazione di peptidi</td></tr><tr><td>Monouso siringhe, 20 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-54</td><td>per purificazione HPLC</td></tr><tr><td>Emocitometro a doppio neubauer VWR</td><td></td><td>63510-13</td><td>per conteggio di cellule</td></tr><tr><td>DSPE-PEG(2000) ammina</td><td>Avanti</td><td>880128P</td><td>per coniugazione di peptidi</td></tr><tr><td>DSPE-PEG(2000) maleimmide</td><td>Avanti</td><td>880126P</td><td>per coniugazione di peptidi</td></tr><tr><td>DSPE-PEG(2000)-NHS ester&nbsp;</td><td>Nanocs</td><td>PG2-DSNS-10K</td><td>per la coniugazione con Cy5</td></tr><tr><td>Eagle modificato di Dulbecco glucosio medio-alto</td><td>Sigma</td><td>Aldrich D5796-500ML</td><td>per colture cellulari</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, qualificato, inattivato a caldo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10438026</td><td>per colture cellulari</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ala-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-A</td><td>per la sintesi</td></tr> <tr><td>di peptidiFmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-RBF</td><td>per la sintesi di peptidi</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-NT</td><td>per la sintesi di peptidi</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-CT</td><td>per la sintesi di peptidi</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-QT</td><td>per la sintesi di peptidi</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ile-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-I</td><td>per la sintesi di peptidi</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Leu-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-L</td><td>per la sintesi di peptidi</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-KBC</td><td>per la sintesi di peptidi</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Phe-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-F</td><td>per la sintesi di peptidi</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-SB</td><td>per la sintesi di peptidi</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-TB</td><td>per la sintesi di peptidi</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-YB</td><td>per la sintesi di peptidi</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Val-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-V</td><td>per la sintesi di peptidi</td></tr><tr><td>Resina Fmoc-Lys(Boc)-wang, 100-200 mesh</td><td>Novabiochem</td><td>856013</td><td>per la sintesi di peptidi</td></tr><tr><td>Acido formico, grado LC/MS ottimale</td><td>Fisher Scientific</td><td>A117-50</td><td>per la purificazione HPLC</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>VWR</td><td>M152-1L</td><td>per microscopia confocale</td></tr><tr><td>Contatore di conteggio manuale</td><td>Fisher Scientific</td><td>S90189</td><td>per il conteggio delle cellule</td></tr><tr><td>Barre di agitazione magnetiche, </td><td>VWR</td><td>58949-006</td> a forma di uovo <td>per coniugazione di peptidi</td></tr><tr><td>Metanolo, certificato ACS</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>per la sintesi di PAM</td></tr><tr><td>Kit di saggio colorimetrico per la proliferazione cellulare MTS</td><td>VWR</td><td>10191-104</td><td>per il saggio MTS</td></tr><tr><td>N,N-Dimetilformammide, grado di sequenziamento</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1160-4</td><td>per la sintesi di peptidi</td></tr><tr><td>N-Metilmorfolina</td><td>Protein Technologies</td><td>S-1L-NMM</td><td>per la sintesi di peptidi</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC416780250</td><td>per il fissaggio di cellule</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010049</td><td>per varie applicazioni</td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina, 10.000 U/mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>per colture cellulari</td></tr><tr><td>Recipiente di sintesi peptidica, 25 mL& nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>CG186011</td><td>per la sintesi di peptidi</td></tr><tr><td>Acido fosfotungstico&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A248-25</td><td>per TEM</td></tr><tr><td>Spettro di piperidina</td><td></td><td>P1146-2.5LTGL</td><td>per sintesi di peptidi</td></tr><tr><td>Vetrino per microscopio in vetro semplice 75 x 25 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>per microscopia confocale</td></tr><tr><td>Serbatoi di reagenti, sterili</td><td>95128093</td><td>VWR per colture cellulari</td><td></td></tr> <tr><td>Pinzetta autochiudente</td><td>TedPella</td><td>515</td><td>per TEM</td></tr><tr><td>Pellicola di supporto TEM</td><td>TedPella</td><td>01814F</td><td>per TEM</td></tr><tr><td>Acido trifluoroacetico&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP618-500</td><td>per la scissione dei peptidi e la purificazione HPLC</td></tr><tr><td>Triisopropilsilano</td><td>VWR</td><td>TCT1533-5 ml</td><td>per la scissione dei peptidi</td></tr><tr><td>Soluzione di tripano blu, 0,4%</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td>per il conteggio delle cellule</td></tr><tr>Pinzetta, <td>VWR</td><td>231-SA-SE</td><td>seghettato per uso generale</td><td>per microscopia confocale</td></tr><tr><td>WEHI-274.1</td><td>ATCC</td><td>ATCC&nbsp; CRL-1679</td><td>sintetizzatore</td></tr><tr><td>di peptidi da banco automatizzato</td> per monociti murini <td>Sintetizzatore di peptidi da banco</td> <td>Protein Technologies</td><td></td> PS3</tr> <tr><td>&alpha;- acido ciano-4-idrossicinnamico, 99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>476870-2G</td><td>per MALDI</td></tr></tbody></table>

sintesi del monocito-targeting peptide amphiphile micelle per l'imaging di aterosclerosi

Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

L'aterosclerosi è un contributore importante alla malattia cardiovascolare, la principale causa di morte nel mondo, che sostiene 17,3 milioni di vite ogni anno. L'aterosclerosi è anche la principale causa di morte improvvisa e l'infarto miocardico, istigato da placche instabili che si rompono e occludono il vaso sanguigno senza avviso. Modalità di formazione immagine corrente non può distinguere tra placche stabili e instabili che rottura. Micelle di peptide anfifili (PAMs) possono ovviare a questo inconveniente come possono essere modificati con una varietà di molecole che si legano specificamente a tessuto malato di targeting. I monociti sono stati indicati per essere marker precoce di aterosclerosi, mentre il grande accumulo di monociti è associato con le piastre alla rottura incline. Quindi, nanoparticelle che possono mirare monociti possono essere utilizzate per discriminare le diverse fasi di aterosclerosi. A tal fine, qui, descriviamo un protocollo per la preparazione di monocito-targeting PAMs (monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs sono auto-assemblate attraverso sintesi in condizioni blande di forma nanoparticelle di 15 nm di diametro con vicino neutro carica superficiale. In vitro, PAMs sono state trovate per essere biocompatibile e aveva una legame ad alta affinità per i monociti. I metodi descritti nel presente documento mostrano la promessa per una vasta gamma di applicazioni nell'aterosclerosi, nonché altre malattie infiammatorie.

Preparazione di MCP-1 PAM Il motivo di CCR2-legante (residui, 13-35) della proteina di MCP-1 [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] o strapazzato peptide [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] è stato modificato mediante l'aggiunta di un residuo di cisteina su N-terminale. Il peptide di MCP-1 è stato sintetizzato da un metodo di fase solida Fmoc-mediata utilizzando un sintetizzatore di peptidi automatizzato. Il peptide grezzo è stato purificato mediante HPLC in fase inversa su una colonna C8 a 5...

Questo articolo presenta un metodo che coinvolge la sintesi e la caratterizzazione delle micelle di amphiphile peptide monocito-targeting e le corrispondenti saggi per verificare la biocompatibilità e capacità la micella di associare ai monociti.

Sintesi del monocito-targeting Peptide Amphiphile micelle per l'Imaging di aterosclerosi

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di sintetizzare micelle di anfifili peptidici mirati ai monociti per l'imaging dell'aterosclerosi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo cardiovascolare sulla diagnostica per immagini della placca aterosclerotica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'incorporazione di micelle peptidiche anfifile con MCP-1 consente una maggiore specificità di targeting e differenziazione tra lesioni aterosclerotiche in stadio precoce e tardivo.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi di placca in diversi stadi dell'aterosclerosi, poiché i pazienti con placche in fase avanzata inclini alla rottura contengono un numero maggiore di monociti. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'aterosclerosi, può essere applicato anche ad altre malattie, come il cancro. A dimostrare la procedura con me sarà Jonathan Wang, uno studente laureato del nostro laboratorio.Inizia pesando 0,25 millimoli di fmach-L-lisina-bach-wong-resina in un recipiente di reazione. Trasferire il recipiente in una cappa chimica e sciacquare i lati del recipiente con cinque millilitri di dimetilforamide. Caricare il recipiente di reazione e le fiale di amminoacidi preconfezionate dal terminale C-N su un sintetizzatore di peptidi da banco automatizzato, inclusa una fiala vuota all'estremità per la deprotezione finale.Dopo aver eseguito la sintesi, trasferire i peptidi e la resina dal recipiente di reazione in una fiala di scintillazione contenente due o tre millilitri di metanolo fino a quando tutta la resina non è stata trasferita. Quando la resina è affondata sul fondo della fiala, rimuovere il supernane e lasciare asciugare la resina all'aria, seguita da un'asciugatura sottovuoto per almeno due ore a temperatura ambiente. Quando la fiala è completamente asciutta, utilizzare una pinza per fissare la metà inferiore di un recipiente di sintesi su uno shaker a braccio e aggiungere due millilitri di soluzione di scissione alla fiala di scintillazione.Trasferire l'intero volume di resina peptidica nel recipiente di sintesi e lavare i lati del recipiente con tre millilitri di soluzione di scissione fresca. Quindi agitare il recipiente, tappato, per quattro ore a 300 oscillazioni al minuto. Al termine dell'incubazione con agitazione, scolare la soluzione peptidica scissa in una provetta conica da 50 millilitri pesata in modo bilanciato e sciacquare più volte il recipiente di sintesi con la soluzione di scissione rimanente.Far evaporare la soluzione peptidica scissa con azoto fino a quando non rimangono meno di quattro millilitri di soluzione nella provetta da centrifuga e aggiungere 36 millilitri di etere ghiacciato alla soluzione scissa del peptide. Vortex la soluzione risultante. Quando la sospensione diventa completamente bianca o gialla, pellettare i peptidi mediante centrifugazione.Risospendere il peptide in 40 millilitri di etere ghiacciato e vortice e sonicare nuovamente il peptide. Dopo una seconda centrifugazione e decantazione del surnatante, essiccare il pellet di peptide anfifilo grezzo con spurgo di azoto gassoso. Quando l'etere è stato visibilmente evaporato, aggiungere 20 millilitri di acqua distillata doppia al tubo e agitare e sonicare il tubo fino a quando il peptide non è completamente disciolto in soluzione.Congelare la soluzione e rivitalizzare fino a quando non si asciuga. Quindi pesare nuovamente il tubo e sciogliere il peptide grezzo in cinque milligrammi per millilitro di acqua. Quindi, iniettare l'intero volume del peptide MCP-1 grezzo in uno strumento per cromatografia liquida ad alte prestazioni o HPLC.Analizza ogni frazione utilizzando la spettroscopia di massa a ionizzazione a desorbimento laser assistita da matrice per la carica di massa del prodotto prevista a 2.890. Quindi unire le frazioni di prodotto. Soffiare via l'acetonitrile e congelare e rivitalizzare i peptidi purificati fino a quando non si asciugano.Per preparare gli anfifili peptidici MCP-1 o PA, sciogliere prima il peptide vitalizzato in 15 milligrammi per millilitro di acqua e combinare la soluzione peptidica con 15 milligrammi per millilitro di DSPE PEG 2000 millimide solution. Aggiungere una mole di idrossido di sodio goccia a goccia fino a quando il pH della soluzione è uguale a sette. Quindi spurgo con azoto per cinque minuti, seguito da un'agitazione notturna.La mattina successiva, congelare e rivitalizzare la soluzione. Quando il prodotto grezzo è asciutto, sciogliere il solido in cinque milligrammi per millilitro di acqua e purificare il peptide mediante HPLC, come appena dimostrato. Per assemblare le membrane PA, sciogliere 1,75 milligrammi di PA MCP-1 in tre millilitri di metanolo in una fiala da un bicchierino e sonicare fino a quando il PA MCP-1 non è completamente disciolto.Far evaporare il metanolo sotto l'azoto muovendo il flaconcino con un movimento circolare e risciacquando il metanolo rimanente dai lati del flaconcino, fino a formare una pellicola uniforme sul fondo. Asciugare la pellicola con l'aspirapolvere durante la notte. La mattina successiva, idratare il film con tre millilitri di acqua per ottenere una soluzione di 100 micromolari di MCP-1 PAM e agitare delicatamente e sonicare la soluzione fino a renderla limpida.Incubare la soluzione a 80 gradi Celsius per 30 minuti, quindi raffreddare la dispersione risultante. Nel seguente esperimento rappresentativo, MCP-1 e peptide strapazzato sono stati purificati mediante HPLC in fase inversa su una colonna di CA a 50 gradi Celsius utilizzando acido trifluoroacetico allo 0,1% in miscele di acetonitrile e acqua. E caratterizzato da spettrometria di massa a ionizzazione a desorbimento laser assistita da matrice, come appena dimostrato.I peptidi contenenti desiti sono stati coniugati su DSPE PEG 2000 milliamide per produrre coniugati peptidici DSPE PEG 2000 tramite un legame tioetere e purificati mediante HPLC utilizzando una colonna C4. L'analisi dinamica della diffusione della luce e l'imaging al microscopio elettronico a trasmissione dei PAM mirati ai monociti hanno rivelato nanoparticelle sferiche ben disperse con potenziali zeta leggermente positivi. L'analisi della spettroscopia dei dicroismi circolari ha confermato che l'incorporazione del peptide MCP-1 all'interno della micella ha migliorato la struttura secondaria.L'incubazione di monociti di amalse con concentrazioni fino a 100 micromolari di peptide MCP-1, PAM MCP-1, peptide strapazzato e PAM strapazzato per 72 ore ha dimostrato la vitalità e la biocompatibilità dei peptidi. Il legame specifico dei monociti ai PAM MCP-1 rispetto ai PAM criptati viene quindi stabilito mediante microscopia confocale. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come preparare le micelle anfifile peptidiche mirate ai monociti attraverso la sintesi e la purificazione del peptide MCP-1 e la preparazione dell'assemblaggio di anfifili e micelle peptidiche MCP-1.Non dimenticare che lavorare con un reagente chimico può essere estremamente pericoloso e che quando si lavora con questi materiali è necessario prendere sempre precauzioni, come la lettura della scheda di sicurezza e lavorare all'interno di una cappa chimica.

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Impara la sintesi di micelle peptidiche anfifile per il targeting dei monociti nell'imaging dell'aterosclerosi. Questo metodo migliora la specificità diagnostica per distinguere le lesioni precoci dalle avanzate.

Sintesi del monocito-targeting Peptide Amphiphile micelle per l'Imaging di aterosclerosi

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