Name: Isolamento e misure respiratoria dei mitocondri da Arabidopsis thaliana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Scopri l'isolamento di mitocondri intatti e puri da Arabidopsis thaliana per studiare respirazione e metabolismo energetico. Questo metodo consente di ottenere mitocondri funzionali da piccole quantità di tessuto vegetale.

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Questo studio è stato sostenuto da un australiano ricerca Consiglio centro di eccellenza in pianta energia biologia CE140100008, un australiano Consiglio futuro assegno di ricerca (FT130100112) di MWM e un assegno di ricerca di Feodor Lynen (Alexander von Humboldt Fondazione, Germania) a JS.

Questo protocollo viene utilizzato per l'isolamento dei mitocondri intatti da organi di Arabidopsis thaliana coltivati su terreno con pendenze di densità colloidale continuo. La raccolta del materiale di seguito tutte le procedure sono effettuate a 4 ° C.
1. preparazione di macinatura media, lavare, soluzioni tampone e gradienti
<ol><li>Preparare 300 mL di macinazione medio (meno ascorbato e cisteina) e 200 mL di tampone di lavaggio x 2 per ogni tabella 1 un giorno prima l'isolamento, tenerli freddo a 4 ° C. Nota: Aggiungere ascorbato di sodio e la L-cisteina (base libera) a una concentrazione finale di 17,84 e 20,36 mM, rispettivamente, al mezzo di macinazione la mattina dell'isolamento. Se i mitocondri sono da utilizzarsi per la macchia occidentale o blu nativo-poliacrilammide gel analisi elettroforesi (BN-PAGE), compongono il tampone di lavaggio senza BSA: 2x.</li>
	<li>Preparare le sfumature sulla mattina di isolamento mitocondriale (Figura 1 e tabella 1).<ol>
<li>Rendere le soluzioni sfumature leggera e pesante in due bicchieri; 35 mL di ciascuno è sufficiente per due tubi di gradiente.</li>
		<li>Lavare gli alloggiamenti del gradiente versatore e tubazione peristaltica del PVC con acqua deionizzata e garantire anche il flusso attraverso la tubazione da tutta la tubazione.</li>
		<li>Posto 2 provette da centrifuga (50 mL) con una leggera angolazione su ghiaccio con le prese di tubazione peristaltica PVC nastro adesivo all'interno dei tubi per garantire che la soluzione gradiente corre lungo il lato dei tubi.</li>
		<li>Chiudere la connessione tra le camere interne ed esterne (leva nera verso il basso). Versatore gradiente posto su un agitatore magnetico con una piccola ancoretta nella camera interna.</li>
		<li>Versare la soluzione di sfumatura pesante 35 mL nella camera interna (sezione con presa di tubatura). Dispensare la soluzione di sfumatura pesante nelle provette due centrifuga posizionate su ghiaccio fino a metà rimanente con il tasso di pompa peristaltica impostato su veloce (300 mL/h).</li>
		<li>Versare la soluzione di gradienti luce 35 mL nella camera esterna (camera senza presa di tubatura). Aprire la connessione tra le camere (leva di Spinta nero fino a metà) e consentono soluzioni di mescolare delicatamente. Mescolare le soluzioni con l'agitatore magnetico.</li>
		<li>Consentire le soluzioni eseguire lentamente (60 mL/h) fino a quando tutto il mix di gradiente è stata erogata dalle camere due con conseguente 0 - 4,4% (p/v) polivinilpirrolidone (PVP) sfumatura tubi. Mantenere le pendenze su ghiaccio fino al momento di utilizzare nel passo 2.12. Nota: Una volta che il gradiente è stato preparato, diluire 2 x lavaggio medio a 1x con acqua deionizzata a prechilled e mantenere fredda a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. omogeneizzazione e isolamento mitocondriale
<ol><li>Tagliare il tessuto intero Rosetta da 4 - settimana-vecchi piante di Arabidopsis coltivate sul suolo con le forbici, almeno 80 impianti sarà richiesti per 1 prep. Nota: 10-14 giorno vecchio acqua culture, minimo 5 pentole/prep, o 2 - settimana-vecchi piantine coltivate su piastre di agar di Murashige e Skoog basale miscela sale (MS), minimi di 4 piatti, possono anche essere utilizzati.</li>
	<li>Mettere la metà del materiale vegetale che è stato tagliato in piccoli pezzi in un pre-raffreddata 4C ° grande mortaio e pestello con 75 mL di smeriglio (tabella 1) e macinare estesamente per alcuni minuti fino a quando non sono lasciati senza grossi pezzi di tessuto.</li>
	<li>Pre-bagnato 4 strati di materiale di filtrazione (dimensione dei pori di 22-25 µm) con macinatura media e filtrare omogeneato attraverso i 4 strati di materiale di filtrazione attraverso un imbuto di plastica in una beuta da 500 mL.</li>
	<li>Macinare la restante metà del tessuto con un altro 75 mL di mezzo di macinazione.</li>
	<li>Combinare gli omogeneati dei materiali di filtrazione e filtrare quanto più possibile omogeneato attraverso.</li>
	<li>Macinare il tessuto restante restante sul materiale di filtrazione nuovamente con i restanti 150 mL di macinatura media, filtro nuovamente nella beuta da 500 mL.</li>
	<li>Centrifugare l'omogenato filtrata in 8 provette da centrifuga plastica pre-refrigerati 50 mL a 2.500 x g a 4 ° C in un rotore ad angolo fisso per 5 min.</li>
	<li>Versare il supernatante in provette da centrifuga pulita (50 mL; evitare di disturbare la pastiglia verde) e centrifugare a 17.500 x g a 4 ° C per 20 min in un rotore ad angolo fisso.</li>
	<li>Eliminare tutti, ma < 3 mL di surnatante dall'aspirazione (o versare delicatamente senza disturbare il pellet). Risospendere delicatamente nel surnatante residuo utilizzando un piccolo pennello fine.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di tampone di lavaggio 1X in ogni provetta e combinare 4 tubi in provetta pulita 1 (cioè, con conseguente 2 tubi).</li>
	<li>Riempire questi tubi con tampone di lavaggio 1X a 50 mL e ripetere i passaggi 2,7-2,9.</li>
	<li>Piscina pellet mitocondriale grezza in 1 tubo con un contagocce e disperdere uniformemente con il pennello fine (una piccola quantità di tampone di lavaggio possono essere utilizzate ma il volume finale deve essere meno di 3 mL per adattarsi sopra il gradiente). Delicatamente strato la sospensione mitocondriale con un contagocce sui 2 gradienti PVP di continuo 0 - 4,4% (p/v).</li>
	<li>Tubi in equilibrio di peso (con tampone di lavaggio 1X) e centrifugare a 40.000 x g a 4 ° C per 40 min. Accertarsi che la rottura è disattivata. I mitocondri migreranno a una banda nella parte inferiore del tubo, o possono essere presenti nella soluzione pesante nella parte inferiore del tubo (identificato da una banda di schiarita, giallastra; Figura 2).</li>
	<li>Rimuovere con cautela la parte superiore 5 cm della soluzione sopra la banda di mitocondriale dall'aspirazione.</li>
	<li>Distribuire la soluzione rimanente contenente i mitocondri in 2 provette pulite e riempire con tampone di lavaggio 1X. Distribuire uniformemente il gradiente di densità colloidale e mitocondri che copre la bocca del tubo con una pellicola di plastica paraffina ed invertendo più volte. Centrifuga per 15 min a 31.000 x g a 4 ° C con frenata lenta. Nota: Prima di centrifugazione, assicurarsi che i mitocondri e il gradiente di densità colloidale rimanenti sono distribuiti uniformemente. In caso contrario, il gradiente di densità colloidale può concentrarsi nella parte inferiore del tubo e prevenire d'appallottolamento dei mitocondri.</li>
	<li>Eliminare il surnatante tramite aspirazione, riempire il tubo con lavaggio 1X buffer fino a 50 mL e invertire nuovamente per garantire la miscelazione. Centrifuga per 15 min a 31.000 x g a 4 ° C con frenata lenta.</li>
	<li>Aspirare il supernatante e raccogliere i pellet mitocondriali in come piccolo un volume (~ 500 µ l) possibile utilizzando una pipetta iclusi modificate 200 µ l (tagliare la punta un po' sopra alla fine per aumentare la sua apertura). Disporre i mitocondri in una provetta da 1,5 mL e tenere il ghiaccio per uso immediato o conservare a-80 ° C. Nota: Se i mitocondri verranno utilizzati per elettroforesi del gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE), BN-PAGE o analisi di immunoblot, utilizzano lavaggio 1X senza BSA per i lavaggi finali (cioè, passo 2.15 e 2.16).</li>
	<li>Determinare la concentrazione di proteine dei mitocondri mediante il metodo di Bradford. Nota: Per le aliquote di centrifuga BN-PAGE a 4 ° C e negozio di pellet a-80 ° C fino all'utilizzo. Per misure del consumo di ossigeno, possono essere utilizzati soli mitocondri di recente isolati.</li>
</ol>3. misure del consumo di ossigeno
Nota: Consumo di ossigeno da appena isolato pianta i mitocondri possono essere analizzati con un elettrodo di Clark-tipo ossigeno, permettendo la determinazione della integrità mitocondriale, attività di via del citocromo c e l'attività della via alternativa.
<ol><li>Installazione del software<ol>
<li>Installare con licenza ossigeno monitoraggio software sul computer utilizzato per misure del consumo di ossigeno.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione del mezzo di respirazione, substrati, soluzioni chimiche stock e l'elettrodo di Clark-tipo ossigeno<ol>
<li>Preparare il supporto di respirazione (300mm saccarosio, 10 millimetri di NaCl, 5 mM KH2PO4, 2mm MgSO4, 0,1% (p/v) albumina di siero bovino (BSA), 10 mM TES (pH 7,2)) usato per i test di consumo di ossigeno.</li>
		<li>Preparazione di substrati, inibitori e gli effettori utilizzati per misurare la respirazione mitocondriale (tabella 2). Questi può essere preparati in precedenza e conservati a-20 ° C. Nota: Neutralizzare il pH di soluzioni acide quali acidi organici a pH 7.0 usando NaOH prima dell'uso.</li>
		<li>Riscaldare il mezzo di respirazione alla stessa temperatura come la camera di dosaggio (25 ° C).</li>
		<li>Assemblare l'elettrodo di Clark-tipo ossigeno come descritto nel protocollo del produttore.</li>
		<li>Posizionare 1 mL aria satura d'acqua (acqua aria satura è ottenuta agitando vigorosamente una piccola quantità di acqua deionizzata in una beuta da grande) nella camera di misurazione. Per accendere l'agitatore, fare clic sul pulsante "Velocità dell'agitatore". Fare clic sul pulsante "On" e impostare la velocità dell'agitatore a 65 giri/min. Fare clic su "OK" per continuare. Mescolare continuamente l'acqua a 25 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>Calibrazione dell'elettrodo di ossigeno<ol>
<li>Riscaldare l'acqua che verrà utilizzato per la taratura alla stessa temperatura come la camera di dosaggio (25 ° C).</li>
		<li>Attendere che la corrente stabilizzare e calibrare l'elettrodo di ossigeno.</li>
		<li>Per avviare la calibrazione dell'elettrodo ossigeno, fare clic sul pulsante "Calibra", selezionare "Calibrazione di fase liquida", quindi "Aria saturi acqua."</li>
		<li>Una nuova finestra si aprirà (ossigeno calibrazione (fase liquida) - passaggio 1 di 5). Selezionare il canale da calibrare (il canale che la casella di controllo dell'elettrodo è collegata a) e immettere le variabili (set "Temperatura della camera" a 25 ° C e "Pressione atmosferica" a 101.32 kPa). Fare clic su "OK" per continuare.</li>
		<li>Nel prossimo passo (passo 2 di 5), imposta la velocità dell'agitatore (65 giri) e fare clic su "OK" per continuare.</li>
		<li>Nel passaggio 3 di 5, attendere il segnale a raggiungere un plateau. Il termine "Plateau raggiunto, premere OK per continuare" verrà visualizzato nella casella. Fare clic su "OK" per continuare.</li>
		<li>Nel passaggio 4 di 5, stabilire zero ossigeno nella camera aggiungendo Ditionito di sodio 5 mg. Fare clic su "OK" per continuare. Nota: Un calo di concentrazione di ossigeno dovrebbe essere visibile nella traccia e dovrebbe raggiungere 0.</li>
		<li>Nell'ultimo passaggio di calibrazione (passaggio 5 di 5), attendere il segnale a raggiungere un plateau. Il termine "Plateau raggiunto, premere OK per continuare" verrà visualizzato nella casella. Fare clic su "OK" per continuare.</li>
		<li>Fare clic su "Salvare la calibrazione" per salvare la calibrazione. Si aprirà una nuova finestra. Fare clic su "OK" per confermare per salvare la nuova taratura per la casella di controllo di ossigeno. Nota: Dopo la calibrazione di successo, l'etichettatura "ossigeno (nmol/mL)" verrà visualizzato sull'asse y.</li>
		<li>Dopo la calibrazione, è necessario pulire la camera di misurazione risciacquando la camera con acqua (almeno 5 - 10 volte) per garantire una corretta pulizia. Posizionare 1 mL di terreno di respirazione in misura dell'alloggiamento e consentire la membrana equilibrare per pochi minuti fino a quando la traccia del consumo di ossigeno è lineare.</li>
		<li>Adattare la scala della traccia del consumo di ossigeno per ottenere una vista di buona pendenza. Fare clic su "Zoom XY" e immettere le variabili ("Ossigeno" impostato su 0 - 300 e il "asse di tempo" a 0 - 45 min).</li>
	</ol></li>
	<li>Determinazione dell'integrità mitocondriale<ol>
<li>Con stantuffo aperto, aggiungere 970 µ l di terreno di respirazione di aria satura della camera di reazione.</li>
		<li>Aggiungere 30 µ l isolato mitocondri o 150 µ g di proteina mitocondriale totale come determinato dopo isolamento mitocondri (proteine totali deve essere incluso nei calcoli in seguito) alla camera di reazione usando una pipetta con una punta di taglio.</li>
		<li>Mescolare la sospensione mitocondriale continuamente con un agitatore magnetico bar (65 giri) a 25 ° C di aria-saturare la soluzione.</li>
		<li>Tenuta la camera con lo stantuffo, fare clic su "Start Recording" per registrare il consumo di ossigeno e consentire la traccia del consumo di ossigeno stabilizzare (1-2 min).</li>
		<li>Determinare il tasso di consumo di ossigeno manualmente dopo l'aggiunta di ascorbato di 10 mM e 25 µM citocromo c per 5 min ottenere la tariffa "prima di detersivo". Nota: Per identificare l'aggiunta di substrati, inibitori e gli effettori direttamente nella traccia, fare clic sul pulsante "Aggiungi evento Mark" e inserite la denominazione di etichetta corrispondente. Fare clic su "OK" per continuare.</li>
		<li>Determinare il tasso di consumo di ossigeno manualmente per 3 min dopo l'aggiunta di detersivo di 0,05% (v/v) per dare la tariffa "dopo detersivo". Scegliere "Interrompi registrazione".</li>
		<li>Fare clic sul pulsante "Tabella dei tassi di cambiamento". 2 cursori verranno visualizzati come linee verticali sullo schermo grafico. Fare clic e trascinare la coppia di cursori di tasso per le posizioni richieste nella traccia per definire l'intervallo di frequenza. Spostare l'intervallo di frequenza lungo l'analisi utilizzando il cursore di sinistra tasso. Impostare l'intervallo di frequenza se stessa utilizzando il cursore di destra tasso. L'ossigeno automaticamente il software di monitoraggio consente di disegnare una retta di regressione tra i due cursori spostando i cursori di intervallo di velocità lungo la traccia.</li>
		<li>Una volta che è stato definito l'intervallo di frequenza desiderato e la posizione, immettere il tasso nella tabella con un clic destro su 1 i 2 cursori e selezionare "Aggiungi tasso al tavolo." Fare clic sul pulsante "Aggiungi" per confermare per visualizzare il tasso sul tavolo principale tasso.</li>
		<li>Calcolare l'integrità mitocondriale dividendo la tariffa "prima di detersivo" per il "dopo detersivo" tasso, espresso in percentuale e sottrarre 100.</li>
	</ol></li>
	<li>Determinazione della respirazione mitocondriale<ol>
<li>Con stantuffo aperto, aggiungere 970 µ l di terreno di respirazione di aria satura della camera di reazione. Aggiungere 500 µM ATP e 30 µ l isolato mitocondri o 150 µ g di proteina mitocondriale totale utilizzando una pipetta con una punta di taglio per il mezzo di respirazione nella camera di reazione.</li>
		<li>Mescolare la sospensione mitocondriale continuamente con un agitatore magnetico bar (65 giri) a 25 ° C.</li>
		<li>Chiudere lo stantuffo, fare clic su "Start Recording" per registrare il consumo di ossigeno ed attendere 1-2 min per tasso di consumo di ossigeno stabilizzare (quando la traccia di consumo di ossigeno è lineare). Aggiungere succinato di 5 mM. Registrare il tasso di consumo di ossigeno per circa 2 min. Nota: Per identificare l'aggiunta di substrati, inibitori e gli effettori direttamente nella traccia, fare clic sul pulsante "Aggiungi evento Mark" e inserite la denominazione di etichetta corrispondente. Fare clic su "OK" per continuare.</li>
		<li>Aggiungere 1 mM dell'adenosina difosfato (ADP). Continuare a registrare il tasso di consumo di ossigeno per 2 min.</li>
		<li>Aggiungere 1 mM NADH. Registrare il tasso di consumo di ossigeno per 4-8 min. Questa tariffa è la capacità di respirazione tramite citocromo ossidasi.</li>
		<li>Aggiungere 1 mM cianuro di potassio (KCN) (o 2,5 µM myxothiazol o 5 µM antimycin A) per inibire il citocromo c via e continuare a registrare per circa 2 min osservare il consumo di ossigeno tramite le ossidasi alternativa.</li>
		<li>Aggiungere 5 mM dithiothreitol (DTT) e piruvato di 10 mM per attivare completamente l'ossidasi alternativa. Continuare a registrare per 5-7 min: questa è la capacità dell'ossidasi alternativa.</li>
		<li>Aggiungere 500 µM n-propyl gallate (nPG) e registrare per 2 min. Questo valuta Tasso di consumo di ossigeno residuo che non può essere inibita chimicamente. Sottrarre questo tasso dai altri tassi registrati, come non è probabile essere mitocondriale in origine. Consumo di ossigeno ancora in corso dopo inibizione del citocromo c e via di AOX (di KCN e nPG) è molto probabile che provengono da perossidasi presenti come contaminanti nei mitocondri isolati9.</li>
		<li>Scegliere "Interrompi registrazione".</li>
		<li>Fare clic sul pulsante "Tabella tariffe di cambiamento" e immettere il tasso nella tabella con un clic destro su uno dei due cursori e selezionare "Aggiungi tasso di tabella". Fare clic sul pulsante "Aggiungi" per confermare per visualizzare il tasso sul tavolo principale tasso. Nota: Quando l'aggiunta di effettori dissolte in solventi organici (ad es., Antimicina A, nPG, myxothiazol), la camera e il pistone deve essere risciacquati con etanolo e poi l'acqua per garantire una corretta pulizia.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

In genere, isolamento dei mitocondri da Arabidopsis lascia rendimenti a 3 mg di mitocondri da circa 80-100 3 - 4 - settimana-vecchi impianti, anche se rese superiori a 5 mg possono essere realizzate spesso con accurata macinazione. Il rendimento varia con le condizioni di crescita e diminuisce drammaticamente come foglie ratti senesce, anche se i mitocondri struttura sembra essere ben mantenuto durante la senescenza9. Una delle caratteristiche più importanti per ottenere una buona resa è il metodo...

La storia della ricerca mitocondriale pianta ripercorre 100 anni1. I mitocondri intatti in primo luogo sono stati isolati all'inizio del 1950 mediante centrifugazione differenziale. L'avvento di un gradiente di densità colloidale nel 1980 ha permesso i mitocondri per essere purificata senza subire regolazione osmotica. Mentre gradienti mitocondri purificati sono adatti per la maggior parte degli scopi, a causa della sensibilità della spettrometria di massa, contaminanti anche relativamente minore possono essere rilevati e possono essere assegnati in modo inappropriato un mitocondriale posizione2. L'uso del libero flusso elettroforesi può rimuovere entrambi plastidic e peroxisome contaminazione3, ma il libero fluire l'elettroforesi è una tecnica altamente specializzata e non è richiesto per la stragrande maggioranza degli studi. Inoltre, si verifica quando determinazione della posizione di una proteina che deve essere ricordato che dual o targeting più delle proteine nelle cellule. Oltre 100 proteine mirate dual sono descritti per cloroplasti/plastidi e mitocondri4e un numero di proteine mirati ai mitocondri e peroxisomes sono noti anche5. Inoltre, la ri-localizzazione delle proteine sotto stimoli specifici, ad es. stress ossidativo, è un tema emergente nella cellula biologia6. Così, la posizione di proteine deve essere considerato nel contesto della biologia ha studiato, e una varietà di approcci sono utilizzati per determinare e verificare la posizione2.
I mitocondri sono in genere isolati dai tessuti vegetali di omogeneizzazione, è necessario un equilibrio tra rottura aprire la parete cellulare per rilasciare i mitocondri e non danneggiare i mitocondri. Tradizionalmente, con patate e cavolfiori, omogeneizzazione comporta l'uso di apparecchi domestici frullatore/spremiagrumi per rendere un estratto liquido in un buffer con vari componenti per mantenere attività. Isolamento dei mitocondri dalle foglie di pisello, (un materiale popolare per isolamento mitocondriale utilizzando giovani semenzali (~ 10 giorni), utilizza un frullatore per lisare le cellule come il materiale di foglia è morbido. Con la disponibilità di linee di knock-out inserzionali Arabidopsis thaliana T-DNA, la necessità di essere in grado di purificare i mitocondri per svolgere studi funzionali ha reso necessario lo sviluppo di metodi per isolare i mitocondri da foglia, radice o fiore tessuto. Nel complesso i metodi sviluppati per altre piante funzionato ben7, con il perquisite macinazione del materiale necessario per essere ottimizzato. Per Arabidopsis questo può essere realizzato in una varietà di modi (Vedi sotto) e differisce tra tipi di tessuto (radice contro sparare). L'uso del gradiente continuo può essere ottimizzata anche che la densità dei mitocondri da diversi organi o stadi di sviluppo significa che essi possono migrare in modo diverso. Così, per la massima separazione la densità della sfumatura può essere raffinata per garantire per ottenere una migliore separazione.
Una volta purificato i mitocondri possono essere utilizzati per una varietà di studi, compresi gli esperimenti di assorbimento proteico e tRNA, analisi di attività dell'enzima, catena respiratoria misurazioni e analisi western blot. Mitocondri isolati possono anche essere utilizzati per analisi di spettrometria di massa dell'abbondanza di proteine. Reazione più monitoraggio analisi (MRM) consente per la quantificazione della definite proteine, ma richiedono sviluppo di significative analisi mirate. Al contrario, quantificazione di dimetil o altro isotopo etichette8, fornisce un approccio di scoperta nell'identificare le differenze attraverso l'intero proteoma che può essere utilizzato per scoprire nuove conoscenze biologiche.

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>Chimico, sciogliere in etanolo</td></tr><tr><td>l'anticorpo AOX</td><td>da Tom Elthon Elthon</td><td></td><td>et al., 1989</td></tr><tr><td>Ascorbato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0157</td><td>Ascorbato ossidasi da Cucurbita sp.</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A26209</td><td>Chimica</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Bovogen</td><td>BSAS 1.0</td><td>Chiarezza chimica</td></tr><tr><td>substrato ECL occidentale</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1705061</td><td>Criterio chimico</td></tr><tr><td>Gel prefabbricati senza macchie 8-16% 18 Wells</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>5678104</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>cianuro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60178</td><td>chimico</td></tr><tr><td>Citocromo c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3131</td><td></td></tr><tr><td>Chimico Difco Agar, granulato</td><td>BD Biosciences</td><td>214530</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>Ditiotreitolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>EDTA sale disodico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>Gamborg B-5 Basal Medium</td><td>Austratec</td><td>G398-100L</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>Soluzione vitaminica Gamborg (1000x)</td><td>Austratec</td><td>G219-100ML</td><td>IgG</td></tr><tr><td>anti-topo chimico (H + L)-HRP coniugato</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1706516-2ml</td><td>IgG</td></tr><tr><td>anti-coniglio chimico di capra (H + L)-HRP coniugato</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1706515-2ml</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteina</td> chimica <td>Sigma</td><td>C7352-100G</td><td></td></tr><tr><td>solfato</td> <td>di magnesio chimicoSigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Chemical Murashige & Skoog Miscela di sali basali (MS)</td><td>Austratec</td><td>M524-100L</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>Myxothiazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5580</td><td>Chimico, sciogliere in etanolo</td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8129</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>Ndufs4 anticorpo</td><td>da Etienne Meyer Meyer</td><td></td><td>et al., 2009</td></tr><tr><td>n-Propil gallato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130</td><td>Chimico, sciogliere in etanolo</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td>Chimico, gradiente di densità colloidale</td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidone (PVP40)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP40</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>Cianuro di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60178</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>Piruvato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Chem-Supply</td><td>SA046</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>Ditionito di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>157953</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>L-ascorbato di sodio</td><td>Sigma</td><td>A4034-100G</td><td></td></tr><tr><td>Chimico Succinato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Chimico</td><td>SA030</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>TES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1375</td><td></td></tr><tr><td>Pirofosfato tetrasodico chimico (Na4P2O7 &middot; 10H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221368</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot chimico Turbo RTA Midi Kit di trasferimento di nitrocellulosa</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1704271</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>Chimico, detergente</td></tr><tr><td>Western Blocking Reagent</td><td>Sigma</td><td>11921681001</td><td>Chemical Balance</td></tr><tr><td></td><td>Mettler Toledo</td><td>XS204</td><td>Attrezzatura</td></tr><tr><td>Becher</td><td>Isolab</td><td>50 mL</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-26XP</td><td></td></tr><tr><td>Attrezzatura Provette da centrifuga</td><td>Nalgene</td><td>3117-9500</td><td>Attrezzatura</td></tr><tr><td>Julabo</td><td>1124971</td><td></td><td>Attaccato a camera dell'elettrodo di ossigeno</td></tr><tr><td>Pallone conico</td><td>Isolab</td><td>500 mL</td><td></td></tr><tr><td>Contagocce</td><td></td><td>3 mL</td><td></td></tr><tr><td>Rotore ad angolo fisso</td><td>Beckman Coulter</td><td>JA25.5</td><td>Attrezzatura</td></tr><tr><td>Imbuto</td><td>Per Alimenti</td><td>14 cm</td><td>Per filtrazione</td></tr><tr><td>Versatore a gradiente</td><td>Bio-Rad</td><td>165-4120</td><td>Per la preparazione di gradienti</td></tr><tr><td>Agitatore magnetico ATE</td><td>VELP Scientifica</td><td>F20300165</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>VWR</td><td>EM475855-1R</td><td>Materiale filtrante</td></tr><tr><td>Mortaio e pestello</td><td>Jamie Oliver</td><td>Granito, 6 pollici</td><td>Attrezzatura</td></tr><tr><td>O2view</td><td>Hansatech Instruments</td><td></td><td>Software di monitoraggio dell'ossigeno</td></tr><tr><td>Sistema Oxygraph Plus</td><td>Hansatech Instruments</td><td>1187253</td><td>Elettrodo di ossigeno di tipo Clark</td></tr><tr><td>Pennello</td><td>Artista prima scelta</td><td>1008R-12</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>film plastico di paraffina</td></tr><tr><td>Pompa peristaltica</td><td>Gilson</td><td>F155001</td><td>Per la preparazione di gradienti</td></tr><tr><td>Tubo peristaltico in PVC</td><td>Gilson</td><td>F117930</td><td>Per la preparazione di gradienti Bagno</td></tr><tr><td>d'acqua</td><td>VELP Scientifica</td><td>OCB</td><td>Equipment</td></tr></tbody></table>

isolamento e misure respiratoria dei mitocondri da arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

I mitocondri sono organelli essenziali coinvolto in numerose vie metaboliche in piante, in particolare la produzione di adenosina trifosfato (ATP) dall'ossidazione di composti ridotti come nicotinamide adenindinucleotide (NADH) e la flavin adenina dinucleotide (FADH2). L'annotazione completa del genoma di Arabidopsis thaliana ha stabilito come il più diffuso sistema pianta modello, e così la necessità di purificare i mitocondri da una varietà di organi (foglia, radice o fiore) è necessaria per utilizzare pienamente gli strumenti che sono ora disponibili per Arabidopsis studiare biologia mitocondriale. I mitocondri sono isolati di omogeneizzazione del tessuto utilizzando una varietà di approcci, seguita da una serie di passaggi di centrifugazione differenziale producendo un pellet mitocondriale grezza che viene ulteriormente purificato mediante gradiente di densità colloidale continuo centrifugazione. Il materiale di densità colloidale viene successivamente rimosso da più passaggi di centrifugazione. A partire da 100 g di tessuto fogliare fresco, 2-3 mg di mitocondri possono essere ottenuti ordinariamente. Respiratori esperimenti su questi mitocondri visualizzare i tassi tipici di 100-250 nmol O2 min-1 mg proteina mitocondriale totale-1 (tasso di NADH-dipendente) con la possibilità di utilizzare vari substrati e inibitori per determinare quali substrati sono sono ossidati e la capacità delle alternative e citocromo ossidasi terminale. Questo protocollo descrive un metodo di isolamento dei mitocondri da foglie di Arabidopsis thaliana usare gradienti di densità colloidale continuo e un'efficiente misure respiratoria dei mitocondri pianta purificata.

Usando questo protocollo, siamo stati in grado di rilevare diverse proteine mitocondriali di SDS-PAGE e immunoblotting. Come mostrato in Figura 3A, la proteina isolata dal tessuto di coltura di acqua è sufficiente per rilevare una debole banda (2 µ g). L'intensità del segnale aumenta in proporzione agli importi caricati. Per i mitocondri isolati dai tessuti coltivati sulle piastre (Figura 3B), la risposta allo stress di luce alta...

Come i mitocondri sono solo una piccola percentuale della cellula vegetale, hanno bisogno di essere purificato per una serie di studi. I mitocondri possono essere isolati da una varietà di organi vegetali di omogeneizzazione, seguita da centrifugazione in gradiente di differenziale e densità per ottenere una frazione altamente purificata mitocondriale.

Isolamento e misure respiratoria dei mitocondri da Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

L'obiettivo generale dell'isolamento dei mitocondri vegetali intatti e puri è quello di studiare la respirazione, la composizione mitocondriale, la biogenesi e il metabolismo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia energetica delle piante, come l'importanza dei mitocondri e la tolleranza allo stress, in condizioni ambientali mutevoli. Il vantaggio principale di questa tecnica è che quantità sufficienti di mitocondri puri, intatti e funzionali potrebbero essere isolati da quantità relativamente piccole di tessuto vegetale.A dimostrare la procedura saranno Wenhui Lyu e Jennifer Selinski, del mio laboratorio. Il giorno dell'isolamento mitocondriale, lavare il versatore a gradiente e il tubo peristaltico in PVC con acqua deionizzata per preparare i gradienti. Inclinare per posizionare due provette da centrifuga da 50 ml sul ghiaccio, in modo che l'uscita del tubo peristaltico tocchi la parete delle provette.Quindi ruotare la leva nera verso il basso per chiudere il collegamento tra la camera interna ed esterna. Posizionare il versatore a gradiente con l'ancoretta magnetica all'interno della camera interna su un agitatore magnetico. Quindi, versare 35 mL

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Un protocollo spettrofluorimetrico per la misura della permeabilità mitocondriale apertura dei pori di transizione nel cuore topo mitocondri isolati è presentato qui. Il test prevede la misurazione simultanea dei mitocondri...

Multi-parametro di misura della apertura dei pori di transizione di permeabilità nel Cuore mouse mitocondri isolati

Molti mRNA codificanti proteine ​​mitocondriali sono associate alla membrana esterna mitocondriale. Descriviamo una procedura di frazionamento subcellulare volta a isolamento dei mitocondri di lievito con i suoi mRNA e ribosomi associati. Questo protocollo può essere applicato a cellule cresciute in condizioni diverse per rivelare meccanismi di localizzazione mRNA e traduzione localizzata vicino ai mitocondri.

Isolamento di mRNA associati con mitocondri di lievito per studiare i meccanismi di traduzione localizzata

Il confronto del potenziale di membrana mitocondriale tra i campioni fornisce informazioni preziose sullo stato cellulare. Vengono descritti i passaggi dettagliati per isolare i mitocondri e valutare la risposta agli inibitori e ai disaccoppiatori utilizzando la fluorescenza. Il metodo e l'utilità di questo protocollo sono illustrati dall'uso di una coltura cellulare e di un modello animale di stress cellulare.

Isolamento e analisi funzionale dei mitocondri da cellule in coltura e Tissue mouse

I metodi presentati forniscono istruzioni passo dopo passo per l'esecuzione di una raccolta di saggi respirometrici basati su micropiastre utilizzando mitocondri isolati da quantità minime di muscolo scheletrico di topo. Questi saggi sono in grado di misurare i cambiamenti/adattamenti meccanicistici nel consumo di ossigeno mitocondriale in un modello animale di uso comune.

Utilizzo di mitocondri isolati da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per High micropiastre rendimento respiratorie Misure

Qui, presentiamo una modifica di un metodo precedentemente riportato che consente l'isolamento di mitocondri purificati e di alta qualità da piccole quantità di muscolo scheletrico di topo. Questa procedura si traduce in mitocondri altamente accoppiati che respirano con elevata funzione durante i saggi respirometrici basati su micropiastre.

L&#39;isolamento di mitocondri da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per misurazioni High Throughput micropiastre respiratorie

Qui, un campione di muscolo quadricipite viene prelevato da un maiale anestetizzato e i mitocondri vengono isolati mediante centrifugazione differenziale. Quindi, le frequenze respiratorie dei complessi della catena respiratoria mitocondriale I, II e IV vengono determinate utilizzando la respirometria ad alta risoluzione.

L&#39;isolamento di mitocondri intatti dal muscolo scheletrico mediante centrifugazione differenziale per alta risoluzione respirometria Misure

Qui presentiamo un protocollo di cattura di interazione applicato ai protoplasti a foglia di Arabidopsis thaliana . Questo metodo si basa fondamentalmente sulla creazione di reticolazione UV in vivo e consente l'isolamento e l'identificazione delle proteine ​​legate alla mRNA da un ambiente fisiologico.

Cattura di Interactome mRNA da protoplasti vegetali

Viene fornito un protocollo ad alto rendimento per la sterilizzazione superficiale dei semi di Arabidopsisthaliana (Arabidopsis), ottimizzando le fasi di movimentazione del liquido con un semplice dispositivo di aspirazione costruito con una pompa per vuoto. Centinaia di campioni di semi possono essere sterilizzati in superficie in un giorno.

Metodo ad alta produttività, robusto e altamente flessibile nel tempo per la sterilizzazione superficiale dei semi di Arabidopsis

Qui, descriviamo un metodo dettagliato per l'isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo e la successiva analisi della respirazione mediante Oxygen Consumption Rate (OCR) utilizzando saggi respirometrici basati su micropiastre. Questa pipeline può essere applicata per studiare gli effetti di molteplici interventi ambientali o genetici sul metabolismo mitocondriale.

Isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo per saggi respirometrici

Descriviamo un approccio per misurare i cambiamenti nell'efficienza fotosintetica nelle piante dopo il trattamento con bassa CO2 utilizzando la fluorescenza della clorofilla.

Valutazione dell'efficienza fotosintetica nei mutanti fotorespiratori mediante analisi di fluorescenza clorofilliana

La fattibilità e l'efficacia dei metodi scRNA-seq ad alto rendimento annunciano un'era a singola cellula nella ricerca sulle piante. Presentata qui è una procedura robusta e completa per isolare specifici tipi di cellule radice di Arabidopsis thaliana e la successiva costruzione e analisi della libreria di trascrittomi.

Analisi dell'isolamento e del trascrittoma di tipi di cellule vegetali

Scopri l'isolamento di mitocondri intatti e puri da Arabidopsis thaliana per studiare respirazione e metabolismo energetico. Questo metodo consente di ottenere mitocondri funzionali da piccole quantità di tessuto vegetale.

Isolamento e misure respiratoria dei mitocondri da Arabidopsis thaliana

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