Isolamento e misure respiratoria dei mitocondri da Arabidopsis thaliana

L'obiettivo generale dell'isolamento dei mitocondri vegetali intatti e puri è quello di studiare la respirazione, la composizione mitocondriale, la biogenesi e il metabolismo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia energetica delle piante, come l'importanza dei mitocondri e la tolleranza allo stress, in condizioni ambientali mutevoli. Il vantaggio principale di questa tecnica è che quantità sufficienti di mitocondri puri, intatti e funzionali potrebbero essere isolati da quantità relativamente piccole di tessuto vegetale.

A dimostrare la procedura saranno Wenhui Lyu e Jennifer Selinski, del mio laboratorio. Il giorno dell'isolamento mitocondriale, lavare il versatore a gradiente e il tubo peristaltico in PVC con acqua deionizzata per preparare i gradienti. Inclinare per posizionare due provette da centrifuga da 50 ml sul ghiaccio, in modo che l'uscita del tubo peristaltico tocchi la parete delle provette.

Quindi ruotare la leva nera verso il basso per chiudere il collegamento tra la camera interna ed esterna. Posizionare il versatore a gradiente con l'ancoretta magnetica all'interno della camera interna su un agitatore magnetico. Quindi, versare 35 mL di soluzione a gradiente denso nella camera interna.

Erogare metà della soluzione a gradiente pesante attraverso la pompa peristaltica, a 300 mL all'ora, in due provette da centrifuga, mantenute in ghiaccio. Quindi versare 35 mL di soluzione a gradiente leggero nella camera esterna. Immediatamente, ruotare la leva nera verso l'alto a metà per riprendere il collegamento tra la camera interna ed esterna, in modo che le soluzioni si mescolino delicatamente.

Espellere l'intera miscela di gradiente dalle camere, a una velocità di 60 ml all'ora, per formare due gradienti PVP continui dallo 0% al 4,4%. Mantenere sempre le pendenze sul ghiaccio prima dell'uso. È importante non sovraccaricare il tessuto vegetale, altrimenti i mitocondri si rompono.

Per una singola preparazione, tagliare l'intero tessuto della rosetta da almeno 80 piante di Arabidopsis di quattro settimane, coltivate in terra. Quindi aggiungere metà dei tessuti vegetali tagliati a un grande mortaio e pestello raffreddati, contenente 75 ml di terreno di macinazione. Quindi utilizzare il terreno di macinazione per inumidire quattro strati di materiale filtrante, con una dimensione dei pori da 20 a 25 m.

Utilizzare un imbuto di plastica per filtrare l'omogeneità attraverso tutti e quattro gli strati di materiale filtrante e raccoglierla in un pallone conico da 500 ml. Utilizzare altri 75 ml di terreno di macinazione per macinare l'altra metà del tessuto. Quindi unire l'intero omogeneizzato nel materiale filtrante, per filtrare il più possibile.

Utilizzare 150 ml di terreno di macinazione per macinare tutto il tessuto rimanente sul materiale filtrante e filtrare in un pallone conico da 500 ml. Distribuire l'omogenato filtrato in otto provette da centrifuga di plastica da 50 ml pre-refrigerate. E centrifugare a 2.500 g a quattro gradi Celsius, in un rotore ad angolo fisso, per cinque minuti.

Dopo aver versato il surnatante in provette da centrifuga pulite, centrifugare nuovamente a 17, 500 g, a quattro gradi Celsius, per 20 minuti, in un rotore ad angolo fisso. Lasciare 3 mL di surnatante nella provetta. Quindi utilizzare un pennello fine per risospendere delicatamente il pellet nel surnatante rimanente.

Aggiungere 10 mL di tampone di lavaggio a singola intensità a ciascuna delle provette e raggruppare tutte e quattro le provette in una provetta da centrifuga, per un totale di due provette. Regolare il volume a 50 ml con un tampone di lavaggio a forza singola e ripetere i passaggi di centrifugazione. Utilizzando una piccolissima quantità di tampone di lavaggio, disperdere il pellet con il pennello fine, quindi utilizzare un contagocce per raccogliere il pellet mitocondriale grezzo in un tubo.

Quindi stratificare accuratamente la sospensione mitocondriale con un contagocce, su due gradienti PVP continui da 0% a 4%. Utilizzare un tampone di lavaggio a forza singola per bilanciare il peso delle provette ed eseguire una centrifugazione a 40.000 g a quattro gradi Celsius, per 40 minuti. Ricordarsi di spegnere il freno.

Aspirare con cautela i cinque centimetri superiori di soluzione sopra la banda mitocondriale. Quindi distribuire la soluzione mitocondriale in due provette pulite e riempire con un tampone di lavaggio a forza singola. Coprire l'imboccatura del tubo con un film di paraffina di plastica e capovolgerlo più volte per distribuire uniformemente il gradiente di densità colloidale e i mitocondri.

Quindi, centrifugare a 31.000 g per 15 minuti a quattro gradi Celsius, con freno lento. Aspirare il surnatante e regolare il volume della provetta fino a 50 ml con un tampone di lavaggio a forza singola. Capovolgere più volte per una corretta miscelazione.

Centrifugare la soluzione a 31.000 g per 15 minuti a quattro gradi Celsius con freno lento. Aspirare il surnatante e successivamente raccogliere il pellet mitocondriale in 500 l di tampone di lavaggio a forza singola, utilizzando una pipetta con puntale modificato da 200 l. Con lo stantuffo aperto, aggiungere 970 l di mezzo di respirazione saturo d'aria nella camera di reazione.

Quindi aggiungere 150 g di proteina mitocondriale totale, utilizzando una pipetta modificata, e 500 M di adenosina trifosfato nella camera di reazione, per determinare la respirazione mitocondriale. Utilizzare un'ancoretta magnetica per mescolare continuamente la sospensione mitocondriale. Dopo aver chiuso lo stantuffo, fare clic su Avvia registrazione per registrare il consumo di ossigeno.

Attendere un minuto o due per verificare la presenza di una traccia lineare del consumo di ossigeno, che indica un consumo di ossigeno stabile. Quindi, aggiungere 5 mM di succinato e registrare il consumo di ossigeno per circa due minuti. Aggiungere 1 mM di adenosina difosfato e continuare a registrare il tasso di consumo di ossigeno per altri due minuti.

Quindi, aggiungere 1 mM di nicotinammide adenina dinucleotide idrogeno e continuare a registrare il consumo di ossigeno per circa quattro-otto minuti. Quindi aggiungere i reagenti per inibire la via del citocromo C e continuare a registrare il consumo di ossigeno tramite ossidasi alternativa, per circa due minuti. KCN, mixotiazolo e antimicina A sono tutti veleni respiratori.

È importante seguire le istruzioni di sicurezza nelle schede tecniche. Si prega di notare che paesi diversi avranno legislazioni diverse per l'uso di questi inibitori nei nostri esperimenti. Successivamente, aggiungere 5 mM di ditiotreitolo e 10 mM di piruvato per attivare l'alternativa ossidasi.

E continua a registrare per altri cinque o sette minuti. Infine, aggiungere 500 mM di N-propil gallato e registrare per due minuti. Un gradiente rappresentativo, che mostra la presenza di frazione mitocondriale bianco-verdastra vicino al fondo della soluzione del gradiente.

I tilacoidi e altri contaminanti presenti sopra la soluzione del gradiente, sono indicati in bande verde scuro. Tracce rappresentative del consumo di ossigeno da parte dei mitocondri, per mostrare l'integrità della membrana esterna prima della misurazione del consumo di ossigeno. L'integrità della membrana esterna era ben conservata e intatta per circa il 90%.

Tracce rappresentative del consumo di ossigeno da parte dei mitocondri, dopo l'aggiunta di substrati, inibitori ed effettori. I risultati mostrano una compromissione del citocromo c e una via alternativa dell'ossidasi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare e analizzare i mitocondri delle piante.