Rilevamento rapido dei fenotipi di Neurodevelopmental in cellule precursori neurali umane (NPC)

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di caratterizzare i processi di sviluppo cerebrale precoce delle cellule precursori neurali umane in modo rapido e riproducibile e di definire gli effetti di importanti fattori extracellulari nella regolazione di questi processi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande importanti nel campo della neuropsichiatria e dei disturbi dello sviluppo neurologico, come ad esempio: tutti gli individui colpiti hanno la stessa anomalia cellulare o, in alternativa, ognuno mostra la disfunzione specifica di una persona? Il vantaggio principale del nostro protocollo è che è rapido, altamente riproducibile e facile da implementare.

Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per fornire informazioni sui disturbi dello sviluppo neurologico, può anche essere utilizzato per studiare disturbi neurodegenerativi e neuropsichiatrici come l'Alzheimer e la depressione. La dimostrazione visiva di alcuni di questi metodi è necessaria in quanto alcune tecniche comportano lo spostamento di cellule da una piastra all'altra o richiedono analisi morfologiche che sono meglio comunicate attraverso la dimostrazione visiva. Per sollevare le cellule precursori neurali umane, aspirare il terreno e lavare le cellule una volta con soluzione salina tamponata con fosfato 1X.

Aspirare la soluzione salina tamponata con fosfato e aggiungere 500 microlitri di soluzione di distacco cellulare 1X in un pozzetto con le cellule precursori neurali. Quindi, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, utilizzare una pipetta P1000 per aggiungere 500 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato mantenuta a temperatura ambiente per lavare e rimuovere le cellule.

Quindi, trasferire le cellule in soluzione salina tamponata con fosfato in una provetta conica da 15 millilitri. Lavare nuovamente il pozzetto con un millilitro di soluzione salina tamponata con fosfato e trasferire il lavaggio nella provetta. Quindi, centrifugare le celle a 300 G per cinque minuti per formare il pellet.

Quindi, scartare il surnatante e risospendere il pellet in uno o cinque millilitri di terreno DMEM F12 preriscaldato. Piastra 100.000 cellule in pozzetti triplicati in una piastra a 24 pozzetti. Dopo 46 ore, aggiungere la timidina triziata al terreno di coltura e incubare a 37 gradi Celsius per due ore.

Quindi, dopo aver rimosso il terreno, aggiungere 300 microlitri di tripsina EDTA allo 0,25% preriscaldata e incubare per 20 minuti a 37 gradi Celsius per rompere le cellule e rilasciare il DNA. Quindi, accendere la raccoglitrice di cellule e pompare. Metti una carta da filtro nella raccoglitrice di cellule.

Continuare a raccogliere le provette della raccoglitrice di cellule in un vassoio vuoto vuoto. Quindi, premere il prelavaggio per bagnare la carta da filtro. Posizionare le provette di raccolta nei pozzetti del campione e iniziare.

Utilizzare una fonte di luce calda per asciugare la carta da filtro e disporre le fiale corrispondenti sul vassoio. Perforare i pezzi di carta nelle fiale e poi aggiungere due millilitri di cocktail di scintillazione liquida a ciascuna fiala. Incubare le fiale per un'ora nel contatore a scintillazione prima di azionare la macchina per ottenere i conteggi al minuto di ciascun campione che riflettono la sintesi attiva del DNA.

Semina 500.000 cellule in una piastra di coltura da 35 millimetri. Quindi, agitare il piatto in tutte le direzioni per distribuire uniformemente le cellule. Quindi, incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 46 ore.

Quindi, aggiungere due microlitri per millilitro di cinque millimolari di EdU alla coltura e incubare per due ore. Quindi, dissociare e pellettare le cellule. Al pellet cellulare, aggiungere tre millilitri di terreno di espansione al 30% con o senza fattori di crescita o farmaci.

Piastra un millilitro di sospensione cellulare sulle piastre pre-rivestite e incuba la piastra a 37 gradi Celsius per due ore. Per studiare il numero di cellule precursori neurali in coltura, dopo due giorni, etichettare e preparare le provette per microcentrifuga. Quindi, aspirare il terreno dal pozzetto e aggiungere 200 microlitri di soluzione di distacco cellulare 1X e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 15 minuti.

Dopo il distacco delle cellule, aggiungere 300 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato 1X a ciascun pozzetto. Utilizzare una pipetta P1000 per pipettare più volte la soluzione cellulare e staccare le cellule dalla piastra. Quindi, trasferire la soluzione cellulare nella provetta da 1,5 millilitri preparata e capovolgere la provetta due o tre volte.

Utilizzando una pipetta, prelevare 50 microlitri di cellule a metà della provetta e aggiungerle alla soluzione di trypan blue in una provetta da 0,5 millilitri. Quindi, contare le cellule utilizzando un emocitometro. Per formare la neurosfera, pipettare un millilitro di terreno di espansione al 100% in un piatto da 35 millimetri senza alcun substrato di rivestimento.

Quindi, aggiungi un milione di cellule precursori neurali in ciascuna di queste piastre e incuba la piastra a 37 gradi Celsius per 48-96 ore. Per preparare la piastra alla migrazione della neurosfera, sciogliere le aliquote di gel che imitano la MEC in sei millilitri di terreno di espansione al 30%. Aggiungere un millilitro di gel ECM-mimic con il 30% di terreno di espansione in un singolo pozzetto di una piastra a sei pozzetti.

Quindi, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Per placcare le neurosfere, utilizzare una pipetta per raccogliere le cellule nel terreno dal piatto da 35 millimetri e trasferirle in un tubo conico. Quindi, centrifugare il tubo a 100 G per pellettare le neurosfere.

Quindi, risospendere il pellet in uno o tre millilitri di terreno di espansione preriscaldato al 30%. Quindi, pipettare 200 microlitri di neurosfere risospese nella piastra a sei pozzetti contenente il gel meccano della MEC con il 30% di terreno di espansione e far oscillare la piastra. Quindi, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 48 ore.

Aspirare il gel mecca della MEC con il 30% di terreno di espansione e poi fissare le cellule per 30 minuti utilizzando il 4% di paraformaldeide. Per analizzare le neurosfere, acquisire immagini utilizzando le impostazioni di contrasto di fase con ingrandimento 10X. Utilizza il software NIH ImageJ per misurare la migrazione media delle neurosfere.

Su ImageJ, utilizzare lo strumento linea a mano libera per tracciare il contorno esterno della neurosfera. Quindi, utilizzare la funzione di misurazione per calcolare l'area della traccia e tracciare la massa della cellula interna della sfera. Sottrarre la massa cellulare interna dall'area totale della neurosfera per quantificare la migrazione media.

La colorazione immunocitochimica è stata eseguita per studiare l'espressione delle proteine del citoscheletro e dei fattori di trascrizione come SOX2, PAX6 e nestina nelle cellule precursori neurali al terzo passaggio. Successivamente, sono state acquisite immagini a contrasto di fase per identificare le cellule portatrici di neuriti. Dall'immagine, le cellule con processi uguali o più lunghi di due corpi cellulari sono considerate portatrici di neuriti, mentre le cellule con processi più corti di due corpi cellulari non sono considerate portatrici di neuriti.

Per confermare la formazione della neurosfera, sono state catturate immagini a contrasto di fase che mostrano che le neurosfere raccolte al punto temporale di 72 ore hanno una dimensione compresa tra 80 micrometri e 120 micrometri e, pertanto, possono essere utilizzate per il saggio di migrazione. Per definire la capacità proliferativa, le cellule precursori neurali sono state coltivate in condizioni di controllo o di fattore di crescita dei fibroblasti e colorate per la presenza di EdU. Le immagini fluorescenti a contrasto di fase mostrano che le cellule trattate con il fattore di crescita dei fibroblasti hanno una percentuale più elevata di cellule impegnate nella fase S, come mostrato dalla colorazione EdU.

Successivamente, per verificare la crescita dei neuriti, le cellule sono state analizzate in condizioni di controllo e confrontate con PACAP. Sono state acquisite immagini a contrasto di fase che mostrano un aumento del numero di cellule con neuriti in trattamento con PACAP. Quindi, per comprendere la migrazione della neurosfera, le cellule sono state trattate con neuropeptidi PACAP.

Le immagini a contrasto di fase ottenute mostrano un aumento della migrazione della neurosfera rispetto al controllo. Il nostro protocollo contiene molte tecniche e saggi, ognuno dei quali richiede tempi diversi. Una volta acquisita, il test medio può richiedere da due a tre ore per l'impostazione e da 30 minuti a tre ore per l'analisi.

Durante l'esecuzione di queste procedure, è fondamentale assicurarsi di utilizzare cellule precursori neurali di alta qualità e che queste cellule siano completamente dissociate e distribuite uniformemente in tutte le condizioni, ad eccezione del test della neurosfera. A seguito di queste procedure, possono essere eseguite altre analisi tra cui Western blotting, QRT-PCR, trascrittomica, proteomica e metabolomica al fine di caratterizzare i meccanismi sottostanti. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.