Name: Isolamento e coltura dei progenitori neurali seguito da immunoprecipitazione della cromatina di istone 3 lisina 79 Dimethylation Mark (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Scopri l'isolamento e la coltura di progenitori neurali cerebellari per analizzare le modificazioni epigenetiche H3K79me2 durante lo sviluppo cerebrale. Questo metodo consente studi ChIP riproducibili su tessuto encefalico murino.

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Ringraziamo Henriette Bertemes per aver contribuito a stabilire il protocollo di coltivazione CGN all'interno del laboratorio. Questa carta di metodo era sostenuta dall'epigenetica medica CRC992 DFG-finanziato dai finanziamenti alla TV. Gli autori riconoscono il supporto del Team Galassia Freiburg: Pavankumar Videm, Björn Grüning e Prof. ssa Rolf Backofen, bioinformatica, Università di Friburgo, in Germania, finanziato dal centro ricerca collaborativo 992 epigenetica medica (grant DFG SFB 992/1 2012) e Ministero federale tedesco dell'istruzione e della ricerca (BMBF grant 031 A538A RBC (de. NBI)).

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<li>Hirabayashi, Y., Gotoh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+control+of+neural+precursor+cell+fate+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Epigenetic control of neural precursor cell fate during development.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 377-388 (2010).</li>
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<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modification+mapping+in+human+brain+reveals+aberrant+expression+of+histone+H3+lysine+79+dimethylation+in+neural+tube+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects.</a> Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).</li>
<li>Zhang, Y., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+regulation+by+histone+methylation%3A+interplay+between+different+covalent+modifications+of+the+core+histone+tails%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails.</a> Genes Dev. 15, 2343-2360 (2001).</li>
<li>Sanders, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+of+histone+H4+lysine+20+controls+recruitment+of+Crb2+to+sites+of+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Methylation of histone H4 lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage.</a> Cell. 119, 603-614 (2004).</li>
<li>Martin, C., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diverse+functions+of+histone+lysine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The diverse functions of histone lysine methylation.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 838-849 (2005).</li>
<li>Greer, E. L., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation%3A+a+dynamic+mark+in+health%2C+disease+and+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance.</a> Nat. Rev. Genet. 13, 343-357 (2012).</li>
<li>Ng, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+methylation+within+the+globular+domain+of+histone+H3+by+Dot1+is+important+for+telomeric+silencing+and+Sir+protein+association%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Lysine methylation within the globular domain of histone H3 by Dot1 is important for telomeric silencing and Sir protein association.</a> Genes Dev. 16, 1518-1527 (2002).</li>
<li>Kebede, A. F., Schneider, R., Daujat, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+types+and+sites+of+histone+modifications+emerge+as+players+in+the+transcriptional+regulation+contest%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Novel types and sites of histone modifications emerge as players in the transcriptional regulation contest.</a> FEBS J. 282, 1658-1674 (2015).</li>
<li>Roidl, D., Hacker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation+during+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Histone methylation during neural development.</a> Cell Tissue Res. 356, 539-552 (2014).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari

Ci sono due modi principali per eseguire immunoprecipitazione della cromatina per rilevare l'occupazione genomica di modificazioni istoniche, fattori di trascrizione, i lettori di codice dell'istone, scrittori o gomme. Uno è il metodo di ChIP nativo usando nucleasi digerita, nativo della cromatina per immunoprecipitazione, e l'altro è il metodo presentato utilizzando la cromatina PFA-fisso, tranciata, in cui i nucleosomes e altre proteine DNA-collegato sono covalentemente al DNA 39. ChIP nativo co...

Le funzioni sensoriali, motorie e cognitive del cervello sono estremamente complessi e sensibili ai cambiamenti fisici ed ambientali. Il cervello è costituito da tre parti generali hind-, mid-e del forebrain, che sono profondamente collegati. All'interno del forebrain, telencefalo può essere diviso in un telencefalo dorsale (DT) e un ventrale telencefalo (VT). Il DT dei topi è costituito da sei strati corticali che si formano tra E11.5 ed E18.5 in un modo "inside-out"1. Il VT comprende le eminenze gangliare in sviluppo, che poi formano i gangli basali2,3. Diversi tipi di cellule possono essere classificati nel sistema nervoso centrale dei mammiferi quali neuroni, astrociti e oligodendrociti4, che si sviluppano in un modo temporo-spaziale5. In primo luogo, le cellule progenitrici neurali (NPC) danno origine a diversi tipi di neuroni, interneuroni nel VT e neuroni di proiezione nella DT e successivamente ai cellule gliali (ad es., gli astrociti6). Durante lo sviluppo corticale, lo strato più superficiale (strato I), che contiene le cellule di Cajal-Retzius, si forma dapprima. Quindi, tra 12.5 ed e 14.5, NPC generano più profondi strati neuronali (VI, V) mentre tra 14,5 e 16,5, progenitori danno origine al livello superiore (IV-II) neuroni7,8. Un neurone identità viene specificata da diversi programmi di transcriptional temporo-spaziale indotta da morfogeno e inoltre da epigenetici programmi2.
Il cervelletto, che è implicato nella coordinazione motoria, si trova del hindbrain e si sviluppa tra E10 e approssimativamente P20 in topi9. Esso contiene la corteccia cerebellare ed i nuclei cerebellari10. La corteccia cerebellare adulta è costituito da tre strati, lo strato molecolare più esterno, lo strato delle cellule di Purkinje e lo strato granulare più interno che contiene neuroni granulari10. Le cellule cerebellari del granello sono i neuroni più piccoli e rappresentano circa l'80% di tutti i neuroni nel cervello dei vertebrati11. Sviluppano da precursori che si trova nella zona germinale esterna e migrano attraverso lo strato di cellule di Purkinje al loro destinazione12. Come nel telencefalo, lo sviluppo del cervelletto è regolato da diversi importanti morfogeni, che hanno funzioni specifiche e spazio-temporale e avviare definiti programmi trascrizionali10.
Lo sviluppo degli strati corticali e cerebellari è controllato dall'espressione trascrizionale di specifici morfogeni e, quindi, dallo stato della cromatina del DNA. In una vista semplificata, gli Stati della cromatina è divisibile in euchromatin come trascrizionalmente attiva e l'eterocromatina come regioni transcriptionally silenziose. Il nucleosoma come unità di base della cromatina contiene due copie di ogni istone core H2A, H2B, H3 e H4, circondato da 147 paia di basi di DNA13. Gli istoni sono altamente traduzionalmente modificati di metilazione, acetilazione, fosforilazione, ubiquitinazione, sumoilazione, ADP-ribosylation, deaminazione e prolina isomerizzazione14,15. Metilazione dell'istone lisina è considerata il più stabile modifica dell'istone che controlla la trascrizione, replica, ricombinazione16, DNA-danno risposta17e imprinting genomico18. Lisine possono essere mono-, di- o tri-metilato19 e appaiono non solo sulle code degli istoni accessibile, ma anche all'interno del dominio globulare di istoni20. Iperomocisteinemici specifici alle H3K4 e H3K36 sono associate principalmente l'eucromatina, specifici iperomocisteinemici H3K9, H3K27 o H4K20 si trovano principalmente in regioni eterocromatiche, anche se tutti i residui sono situati entro l'istone coda14, 19,21. La metilazione di H3K79 si trova all'interno del dominio globulare istone ed è stata associata con l'attività trascrizionale, ma anche con regioni genomiche trascrizionalmente inerte22. La modifica è evolutivamente conservata poiché è stato osservato in lievito, timo di vitello, pollo e umano23. H3K79 mono, di e trimethylation (H3K79me1, me2, me3) sono catalizzate dalle istone metiltransferasi DOT1L24,25 e il nucleare SET dominio-contenente della proteina 2 (Nsd2)26. DOT1L è implicato nella proliferazione e riparazione del DNA cellulare riprogrammazione27. Perdita di Dot1l in topi porta ad una morte prenatale intorno la fase inerente allo sviluppo e 10.528,29. Durante lo sviluppo del cuore e nella differenziazione dei myocardiocyte, DOT1L è essenziale per gene espressione regolamento30. Nel sistema nervoso centrale, DOT1L funzione potrebbe essere implicato nel tubo neurale sviluppo31, è coinvolto nella soppressione Tbr1-espressione nel proencefalo sviluppo32e potrebbe funzionare nella regolazione di sforzo di ER geni di risposta33. Il contesto-dipendente attivando o reprimere azione di H3K79me, soprattutto con situazioni in vivo come lo sviluppo del sistema nervoso centrale, è ad oggi solo parzialmente capito32. Poiché H3K79 metilazione si trova nel dominio globulare dell'istone 3, è stericamente meno accessibile rispetto alle modifiche sui code istoniche flessibile23. Per comprendere la funzione di metilazione di H3K79, sono necessari metodi di analisi affidabili e riproducibili per determinare la sua posizione e ambiente genomica. In questa carta di metodi, presentiamo metodi di isolamento di diversi progenitori neurali (CPC per la corteccia) e CGNPs per il cervelletto, efficace trattamento dell'inibitore di DOT1L e un metodo di ChIP per analizzare la metilazione H3K79 via qPCR o sequenziamento in tempi diversi punti durante lo sviluppo corticale e cerebellare. Per una panoramica del protocollo e delle sue possibilità, Vedi Figura 1.

<table><tbody><tr><td>Anti-GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab8245</td><td>Category: Antibody Abbreviation/Commento: Diluizione dell'immunoblot 1:5000</td></tr><tr><td>Anti-H3</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td>Category: Antibody Abbreviation/Commento: Diluizione dell'immunoblot 1:3000</td></tr><tr><td>Anti-H3K79me2</td><td>Diagenode</td><td>pAb-051-050</td><td>Category: Antibody Abbreviation/Commento: Anticorpo ChIP</td></tr><tr><td>Anti-H3K79me2</td><td>Abcam</td><td>ab-051-050</td><td>Category: Antibody Abbreviation/Commento: Diluizione di immunoblot 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-rabbit-IgG</td><td>Diagenode</td><td>C15410206</td><td>Category: Antibody Abbreviation/Commento: ChIP Ctrl Antibody</td></tr><tr><td>Anti-Tubulin alpha</td><td>Abcam</td><td>ab108629</td><td>Category: Antibody Abbreviation/Commento: Diluizione di Immunoblot 1:3000</td></tr><tr><td>Apo-Transferrin (1 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1147</td><td>Category: Coltura cellulare Abbreviation/Commento: Per l'integratore CCM</td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Category: Cell Culture Abbreviation/Commento: Per le tecnologie CCM</td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2940CA</td><td>Category: ChIP Abbreviation/Commento: Per l'analisi della cromatina tranciata</td></tr><tr><td>Bioruptor NextGen</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td>Category: ChIP Abbreviation/Commento: Ultrasuonatore</td></tr><tr><td>Acido borico pH 8.4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td>Category: Coltura cellulare Abbreviation/Commento: Per la coltura CPC</td></tr><tr><td>CFX Connect RT PCR Detection System</td><td>Bio-Rad</td><td>1855201</td><td>Category: ChIP Analysis Abbreviation/Commento: Sistema di rilevamento per qPCR</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td>Category: Coltura cellulare Abbreviation/Commento: Per CGM</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>Invitrogen</td><td>10001D</td><td>Category: ChIP Abbreviation/Commento: Perline magnetiche, per ChIP</td></tr><tr><td>EPZ-5676</td><td>Selleckchem</td><td>S7062</td><td>Category: Inibizione DOT1L Abbreviation/Commento: Per l'inibizione di DOT1L in coltura cellulare</td></tr><tr><td>Acido etilendiammine tetraacetico</td><td>SERVA</td><td>39760.01</td><td>Category: ChIP Abbreviation/Commento: EDTA</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino 10% (v/v)</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td>Category: Coltura cellulare Abbreviation/Commento: Per l'isolamento CPC e CGM</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>Category: Cell Culture Abbreviation/Commento: Per l'isolamento CGNP</td></tr><tr><td>Glutatione (1,25 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td>Category: Coltura cellulare Abbreviation/Commento: Per CCM</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Carl Roth</td><td>3187</td><td>Category: ChIP Abbreviation/Commento: Per la fissazione cellulare</td></tr><tr><td>GoTaq mastermix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td>Category: ChIP Analysis Abbreviation/Commento: Miscela master di DNA polimerasi per qPCR</td></tr><tr><td>Hank' s Soluzione salina bilanciata</td><td>Life Technologies</td><td>14025-100</td><td>Category: Cell culture Abbreviation/Commento: HBSS</td></tr><tr><td>L-glutammina (200 mM)</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td>Category: Cell culture Abbreviation/Commento: Per CCM</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>Category: Coltura cellulare Abbreviation/Commento: Per la coltura di CPC</td></tr><tr><td>Cloruro di litio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4408</td><td>Category: ChIP Abbreviation/Commento: Integratore LiCl</td></tr><tr><td>N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td>Category: Coltura cellulare Abbreviation/Commento: Per CGM</td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher</td><td>3300</td><td>Category: ChIP Abbreviation/Commento: Fluorospettrometro per la quantificazione del DNA</td></tr><tr><td>NEB Next Ultra Kit di preparazione della libreria DNA per Illumina</td><td>NEB</td><td>E7645S</td><td>Category: ChIP Analysis Abbreviation/Commento: Kit per la preparazione della libreria</td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina</td><td>NEB</td><td>E7335</td><td>Category: ChIP Analysis Abbreviation/Commento: Oligo per la preparazione della libreria</td></tr><tr><td>Medium neurobasale</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Category: Coltura cellulare Abbreviation/Commento: Per CCM</td></tr><tr><td>NP-40 Alternative</td><td>Calbiochem</td><td>492016</td><td>Category: ChIP Abbreviation/Commento: Per tampone ChIP</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Carl Roth</td><td>335</td><td>Category: ChIP Abbreviation/Commento: PFA, per la fissazione cellulare</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina-Neomicina 1% (v/v)</td><td>Life Technologies</td><td>15640055</td><td>Category: Cell culture Abbreviation/Commento: PSN, per soluzione salina tamponata con fosfato CCM e CGM</td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies</td><td>10010023</td><td>Category: Coltura cellulare Abbreviation/Commento: PBS, per l'isolamento CPC</td></tr><tr><td>PicoGreen Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>P11496</td><td>Category: ChIP Analysis Abbreviation/Commento: Colorante di visualizzazione per la quantificazione del DNA</td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>Category: Coltura cellulare Abbreviation/Commento: Per l'isolamento CGNP</td></tr><tr><td>Bromidrato di poli-L-ornitina</td><td>Sigma</td><td>Aldrich P3655</td><td>Category: Coltura cellulare Abbreviation/Commento: Per la coltura di CPC</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9640G</td><td>Category: Coltura cellulare Abbreviation/Commento: KCl, per</td></tr><tr><td>l'inibitore della proteasi</td> CGM <td>Roche</td><td>4693159001</td><td>Category: ChIP Abbreviation/Commento: Per la</td></tr><tr><td>proteinasi</td> ChIP K <td>Sigma-Aldrich</td><td>3115879001</td><td>Category: ChIP Abbreviation/Commento: Per ChIP</td></tr><tr><td>Qiagen MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Category: ChIP Abbreviation/Commento: Kit per la purificazione del DNA</td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>Category: ChIP Abbreviazione/Commento: Per ChIP</td></tr><tr><td>SGC0946</td><td>Selleckchem</td><td>S7079</td><td>Category: Inibizione DOT1L Abbreviazione/Commento: Per l'inibizione di DOT1L in coltura cellulare</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Carl Roth</td><td>8551.1</td><td>Category: ChIP Abbreviazione/Commento: </forte> per tampone di eluizione</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Carl Roth</td><td>9265</td><td>Category: ChIP Abbreviation/Commento: NaCl, per il tampone ChIP</td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td>Category: ChIP Abbreviation/Commento: per ChIP</td></tr><tr><td>Sodium dodecilsolfato</td><td>Carl Roth</td><td>183</td><td>Category: ChIP Abbreviation/Commento: SDS, for ChIP</td></tr><tr><td>Sonic hedgehock (SHH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRP6004</td><td>Category: Cell culture Abbreviation/Commento: Per l'isolamento CGNP</td></tr><tr><td>Superossido dismutasi (1mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7571</td><td>Category: Coltura cellulare Abbreviation/Commento: Per CCM</td></tr><tr><td>Tris(idrossimetil)aminometano</td><td>Carl Roth</td><td>9090</td><td>Category: ChIP Abbreviation/Commento: TRIS, per tampone ChIP</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth</td><td>X100</td><td>Category: ChIP Abbreviation/Commento: Per il tampone ChIP</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,05% (w/v)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59417C</td><td>Category: Cell culture Abbreviation/Commento: Per l'isolamento CPC</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Carl Roth</td><td>28320</td><td>Category: ChIP Abbreviation/Commento: Per la preparazione di perline</td></tr><tr><td>Altri dispositivi da laboratorio: Camera di conteggio Neubauer, Incubatore, Rotatore, Agitatore, Set di dissezione, Bagno</td><td></td><td></td><td></td>d'acqua</tr><tr><td>CCM: Terreno</td><td></td><td></td><td></td>cellulare corticale</tr><tr><td>CGM: Terreno</td><td></td><td></td><td></td> di coltura cellulare CGNP</tr></tbody></table>

isolamento e coltura dei progenitori neurali seguito da immunoprecipitazione della cromatina di istone 3 lisina 79 dimethylation mark

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Lo sviluppo del cervello è un processo complesso, che è controllato in maniera temporo-spaziale dai gradienti di morfogeni e diversi programmi trascrizionali. Inoltre, modificazioni epigenetiche della cromatina, come metilazione dell'istone, hanno un ruolo importante per stabilire e mantenere destini cellulari specifici all'interno di questo processo. La stragrande maggioranza di metilazione dell'istone si verifica sulla coda dell'istone flessibile, che è accessibile ai modificatori dell'istone, gomme e proteine istoniche lettore. Al contrario, H3K79 metilazione si trova nel dominio globulare dell'istone 3 ed è implicata in diverse funzioni evolutive. H3K79 metilazione è evolutivamente conservata e può essere trovata in una vasta gamma di specie da Homo sapiens di Saccharomyces cerevisiae. La modifica avviene in popolazioni differenti delle cellule all'interno di organismi, comprese le cellule progenitrici neurali. La posizione di metilazione di H3K79 nel dominio globulare dell'istone 3 lo rende difficile da valutare. Qui, presentiamo metodi per isolare e progenitrici corticale cultura cellule (CPCs) dal tessuto cerebrale corticale embrionale (E11.5-e. 14.5) o progenitori del neurone granulare cerebellare (CGNPs) dal tessuto postnatale (P5-P7) e in modo efficiente immunoprecipitate H3K79me2 per PCR quantitativa (qPCR) e sequenziamento del genoma.

Schema generale di isolamento progenitrici neurali, coltivazione, metodi di analisi H3K79me2 ChIP e ChIP: La figura 1 Mostra un diagramma di flusso per eseguire H3K79me2 ChIP di cellule progenitrici corticale in diversi momenti durante lo sviluppo embrionale del cervello o dei progenitori del neurone granulare cerebellare nelle fasi post-natale. Come primo passo, il cervello deve essere isolato e il telencefalo (tra E11.5 ed e 14.5) o del cer...

Presentiamo un metodo efficace e riproducibile per isolare e coltura di cellule progenitrici neurali dal tessuto di cervello embrionale e postnatale per immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di istone 3 lisina 79 dimethylation (H3K79me2) - un contrassegno dell'istone si trova all'interno del dominio globulare dell'istone 3.

Isolamento e coltura dei progenitori neurali seguito da immunoprecipitazione della cromatina di istone 3 lisina 79 Dimethylation Mark

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è analizzare le modificazioni epigenetiche durante lo sviluppo del cervello, in particolare nella corteccia cerebrale e nel cervelletto. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande chiave nel campo della neurobiologia, come ad esempio come le modifiche istoniche come la metilazione di H3K79 possono influenzare lo sviluppo della stratificazione corticale e cerebellare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo studiare in vivo le modificazioni istoniche, locus-specifiche o genome-wide, in regioni cerebrali distinte in specifici punti temporali dello sviluppo.Inizia con i cervelli da P5 a P7 e i topi MRI. Rimuovere tutte le meningi e i vasi sanguigni. Quindi trasferire da tre a cinque cerelli per chip in tubi da 15 millilitri.Lavare il cervelletto con glucosio HBSS prima della centrifugazione. Centrifugare le provette per raccogliere il tessuto. Dopo il lavaggio finale, omogeneizzare il cervelletto pipettando delicatamente su e giù due o tre volte con una pipetta da un millilitro fino a quando i frammenti non hanno una dimensione compresa tra 0,5 e un millimetro cubo.Rimuovere delicatamente tutto il liquido fino

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L'eterogeneità cellulare del tessuto cerebrale rappresenta una limitazione significativa per lo studio delle marcature epigenetiche della cromatina perché la maggior parte saggi mancanza risoluzione singola cella. I neuroni sono in genere mescolati con glia altri e cellule non neuronali. Forniamo un protocollo per estrarre e raccogliere i nuclei neuronali dal cervello umano.

Nuclei di isolamento dal tessuto neuronale del cervello umano Postmortem

Qui, descriviamo come produrre, espandere e immunolabel postnatale cellule dell'ippocampo progenitrici neurali (NPC) in tre dimensioni (3D) della cultura. Successivamente, utilizzando le tecnologie di visualizzazione ibrida, che dimostrano come le immagini digitali di criosezioni immunolabelled può essere usata per ricostruire e mappare la posizione spaziale delle cellule immunopositive tutto il neurosfere 3D intero.

Proteine ​​localizzazione in 3D Cultura cellule staminali neurali: una metodologia di visualizzazione ibrida

Questo protocollo vengono utilizzati dei metodi utilizzati per stabilire gli ambienti 2D e 3D in custom-designed camere electrotactic, che permette di monitorare le...

Di campo elettrico controllato migrazione diretta di cellule progenitrici neurali in ambienti 2D e 3D

Isolamento di embrionale cresta neurale dal tubo neurale facilita l'uso...

Isolamento e la coltura delle cellule della cresta neurale da Embryonic Murine tubo neurale

Fonte: Tagliafierro, L., et al. Piattaforma vettoriale lentivirale per la somministrazione efficiente di strumenti di editing dell'epigenoma in modelli di malattia derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane. J. Vis. Exp. (2019)Questo video dimostra la trasduzione lentivirale delle cellule progenitrici neurali (NPC) per la modifica epigenetica mirata dell'alfa-sinucleina, una proteina chiave nella malattia di Parkinson. Il protocollo consente la metilazione del DNA mediata dalla...

Trasduzione lentivirale delle cellule progenitrici neurali per la regolazione epigenetica dell'espressione dell'alfa-sinucleina

Questo video mostra una tecnica per isolare le cellule progenitrici neurali indotte (iNPC) derivate da fibroblasti umani adulti. Delinea le fasi dell'isolamento delle colonie di iNPC e della loro coltura in pozzetti a piastre multipozzetto rivestiti di laminina in presenza di terreni di coltura adeguati che facilitano la continua proliferazione ed espansione della popolazione di iNPC.

Isolamento di colonie di cellule progenitrici neurali indotte derivate da fibroblasti umani adulti

Questo video dimostra l'isolamento e la coltivazione di cellule progenitrici neurali cerebellari dal cervelletto di un cucciolo di topo. I progenitori dei neuroni dei granuli cerebellari vengono isolati e purificati attraverso l'adesione differenziale, rimuovendo efficacemente gli astrociti. Questi progenitori in coltura si differenziano successivamente in neuroni granulari cerebellari.

Isolamento e coltura di progenitori di neuroni granulari cerebellari murini

Fonte: Mendez, F. M. et al., Immunoprecipitazione della cromatina nativa utilizzando neurosfere tumorali cerebrali mure. J. Vis. Exp. (2018). Questo video dimostra l'isolamento di complessi proteina-DNA da cellule della neurosfera derivate da un tumore cerebrale di topo utilizzando l'immunoprecipitazione nativa della cromatina. Descrive in dettaglio le fasi per la preparazione della cromatina, l'immunoprecipitazione, il lavaggio e la digestione delle proteine per rilasciare il DNA per l'analisi...

Immunoprecipitazione nativa della cromatina delle cellule della neurosfera

Con l'intento di caratterizzare i cambiamenti nei miRNA su cellule staminali neurali umane differenziate (hNSC), descriviamo la differenziazione delle hNSC su un sistema tridimensionale, la valutazione dei cambiamenti nell'espressione dei microRNA mediante array PCR di miRNA e l'analisi computazionale per la previsione del bersaglio dei miRNA e la sua convalida mediante doppio saggio della luciferasi.

Differenziazione di una linea di cellule staminali neurali umane in Tre Culture dimensionali, Geni Analisi di MicroRNA e putativo di destinazione

Il midollo spinale adulto dei mammiferi contiene cellule staminali/progenitrici neurali (NSPC) che possono essere isolate ed espanse in coltura. Questo protocollo descrive la raccolta, l'isolamento, la coltura e il passaggio di NSPC generate dalla regione periventricolare del midollo spinale adulto dal ratto e da donatori di trapianto di organi umani.

Isolamento di Neural cellule staminali / progenitrici dalla Regione periventricolare del ratto adulto e midollo spinale umano

Meccanismi epigenetici sono frequentemente alterati nei gliomi. Immunoprecipitazione della cromatina poteva essere utilizzati per studiare le conseguenze delle alterazioni genetiche in glioma risultanti dalle modifiche in modificazioni istoniche che regolano la trascrizione di gene e la struttura della cromatina. Questo protocollo descrive immunoprecipitazione della cromatina nativo su neurosfere tumore del cervello murino.

Immunoprecipitazione della cromatina nativo utilizzando neurosfere tumore del cervello murino

Scopri l'isolamento e la coltura di progenitori neurali cerebellari per analizzare le modificazioni epigenetiche H3K79me2 durante lo sviluppo cerebrale. Questo metodo consente studi ChIP riproducibili su tessuto encefalico murino.

Isolamento e coltura dei progenitori neurali seguito da immunoprecipitazione della cromatina di istone 3 lisina 79 Dimethylation Mark (Video) | JoVE Journal

Isolamento e coltura dei progenitori neurali seguito da immunoprecipitazione della cromatina di istone 3 lisina 79 Dimethylation Mark

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