Name: Analisi di Imaging di complementazione di luciferase in foglie di Nicotiana benthamiana per transitoriamente determinare dinamiche di interazione proteina-proteina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Impara a rilevare interazioni proteina-proteina in foglie di Nicotiana benthamiana mediante complementazione di luciferasi. Questo metodo quantitativo utilizza luminometro o camera CCD per studiare dinamiche di segnalazione cellulare.

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Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione con scienze naturali della provincia di Jiangsu (BK20140919), National Natural Science Foundation of China (31470375), la priorità programma sviluppo di Jiangsu istruzione superiore istituzioni accademiche e Qing Lan Project.

1. preparazione delle piante (8 settimane)
<ol><li>Mettere 50 semi di Nicotiana benthamiana in una microcentrifuga da 1,5 mL contenente 1 mL di 5% NaClO e soluzione 0,1% Triton X-100 (V/V) e lasciare agire per 5 min sterilizzare i semi.</li>
	<li>Sciacquare i semi con acqua sterile 5 volte e sospendere semi in 200 µ l di acqua sterile.</li>
	<li>Accuratamente posto semi individuali sulla superficie del terreno di MS-agar (1 l.: 1 x sali di Murashige e Skoog, 10 g di saccarosio, pH 5,8 (KOH), 1% agar) con estremità sottili e piastre di terreno di negozio a 4 ° C per 3 giorni sincronizzare la germinazione. Nota: Per evitare la contaminazione di microbo, eseguire questo passaggio su un banco pulito. Non è necessario agitare il tubo durante la sterilizzazione.</li>
	<li>Posizionare le piastre di terreno in condizioni di crescita normali (22 ° C, intensità luminosa di 80-90 µmolm-2s-1 bianco) per 10 giorni e quindi trasferire le piantine germinate nel terreno. Nota: Assicurarsi di inserire le radici della piantina nel terreno e non danneggiare le radici. Coprire il vassoio con un coperchio in plastica trasparente durante la notte per mantenere l'umidità.</li>
	<li>Crescere le piante in una stanza di crescita controllata su un 16 h/8 h chiaro/scuro ciclo e 70% di umidità. 7-settimana-vecchio N. benthamiana piante sono pronte per l'infiltrazione Agrobacteriumtumefaciens (Figura 1A). Nota: Innaffiare le piante e controllare i parassiti come necessario per mantenere le piante sane.</li>
</ol>2. transitoria espressione nelle foglie N. Benthamiana (7-10 giorni)
<ol><li>Consegnare 150 ng di plasmidi (plasmide pEGAD-HA-LUC controllo, vettore vuoto e plasmide costruito per LCI dosaggio, in questo caso abbiamo usato pCAMBIA1300-Nluc e pCAMBIA1300-Cluc per costruzione del plasmide) in cellule competenti di a. tumefaciens ceppo GV3101 con un Metodo standard elettroporazione.</li>
	<li>Cultura a. tumefaciens Luria-Bertani (LB) agar medium (1 l: 10 g NaCl, Estratto di lievito 5 g, 10 g triptone, 1,5% agar) contenente 50 µ g/mL di kanamicina e 50 µ g/mL di rifampicina a 28 ° C per 4 giorni. Nota: La scelta degli antibiotici dipende il vettore e il ceppo di a. tumefaciens usato.</li>
	<li>Inoculare una singola colonia di a. tumefaciens da ogni piatto in 3 mL di terreno liquido LB contenente 50 µ g/mL di kanamicina e 50 µ g/mL di rifampicina e agitare a 220 giri/min a 28 ° C per 24 h propagare la coltura delle cellule.</li>
	<li>Trasferimento 75 µ l di coltura in terreno liquido del LB fresco 15 mL contenente 50 µ g/mL di kanamicina e 50 µ g/mL di rifampicina, diluirla con un fattore di 200. Cultura, i batteri a 220 giri/min a 30 ° C per circa 8 ore, fino a quando OD600 è tra 0,5 e 1,0.</li>
	<li>Trasferire la coltura liquida di a. tumefaciens in provette per centrifuga da 15 mL e centrifugare a 4.000 x g e a 4 ° C per 15 min. scartare il sopranatante e sospendere il pellet in 15 mL di soluzione di trasformazione per lavare il pellet.</li>
	<li>Girare il tubo a 4.000 x g e a 4 ° C per 15 min e scartare il surnatante. Ripetere ancora una volta la fase di lavaggio.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 5 mL di soluzione di trasformazione e mantenere per 2 h a temperatura ambiente. Regolare la densità delle cellule di pellet a. tumefaciens con soluzione di trasformazione fino a quando la concentrazione finale di OD600 è 0,5, o mix due campioni con volume uguale per test interazioni proteina accoppiati.</li>
	<li>Le cellule si infiltrano in sospeso in 4th a 7th lascia con una siringa senza ago da 1 mL (Figura 1B-C). Dopo l'infiltrazione, coprire immediatamente le piante con una copertura di plastica nera e posizionare il vassoio nel buio per 12 h. Dopo di che, crescono piante come al solito per 2 a 4 giorni prima rilevazione attività LUC. Nota: Scegliere sane foglie di dimensioni simili. L'infiltrazione di quattro diverse zone in una foglia va bene.</li>
</ol>3. rilevare l'attività luciferasica (un giorno)
Nota: Ci sono due modi per monitorare l'attività luciferasica. Uno si basa sull'imaging e l'altro è quello di misurare quantitativamente l'attività luciferasica.
<ol><li>
Metodo di formazione immagine
	<ol>
<li>Staccare una foglia di infiltrati e mettere l'intero opuscolo su MS-agar.</li>
		<li>Buffer di lavoro luciferina spray sulla superficie adassiale foglia con un flacone spray da 50 mL. Conservare il materiale al buio per 5 min placare la auto-fluorescenza della clorofilla.</li>
		<li>Utilizzare un CCD raffreddata di basso-luce imaging apparato (raffreddato a-30 ° C) per catturare le immagini (Figura 2). Il tempo di esposizione di luce-archiviato è 50 ms, e tempo di rilevamento di luminescenza è 1 min. Nota: Regolare i parametri secondo il manuale della macchina. Temperature più basse migliorerà il rapporto segnale-rumore per migliorare la qualità dell'immagine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>In alternativa, misurare luminescenza direttamente con un luminometro commerciale.<ol>
<li>Accuratamente tagliare frammenti di foglia (circa 0,25 cm2) dalla zona di infiltrazione delle foglie N. benthamiana e immergere il disco di foglia in 100 µ l di acqua deionizzata in un piatto bianco 96 pozzetti (Figura 3).</li>
		<li>Aggiungere 10 µ l di buffer di lavoro luciferina e lasciare per 5 min. Quindi eseguire trattamenti specifici per lo studio della dinamica di interazione della proteina. Nota: Rilevare la luminescenza con un luminometro intervalli di tempo diversi per ottenere la dinamica attività di luciferasi, che rappresentano la cinetica delle interazioni proteina-proteina sotto determinato trattamento. Questo metodo presenta vantaggi per il test di un gran numero di coppie di proteine contemporaneamente. Per quelli senza un luminometro commerciale, esaminare le abbondanze di proteina luciferasi mediante western blot, pertanto consultare la quantità di attività LUC. Se la luce non è necessariamente richiesta, basta tenere la piastra sul luminometro e misurare luminescenza in diversi momenti. In caso contrario, spostare la piastra in una camera di crescita durante il gap di rilevamento. Per ottenere risultati statisticamente significativi, è necessario utilizzare almeno tre replicati biologici. Sebbene LUC attività dalle zone di infiltrazione differenti variano, cambiamenti dei loro modelli sono coerenti dopo la normalizzazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Thines, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAZ+repressor+proteins+are+targets+of+the+SCF%28COI1%29+complex+during+jasmonate+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 661-665 (2007).</li>
<li>Chini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JAZ+family+of+repressors+is+the+missing+link+in+jasmonate+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 666-671 (2007).</li>
<li>Jones, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Border+control--a+membrane-linked+interactome+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Border control--a membrane-linked interactome of Arabidopsis.</a> Science. 344, 711-716 (2014).</li>
<li>Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+network+evolution+in+an+Arabidopsis+interactome+map%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map.</a> Science. 333, 601-607 (2011).</li>
<li>Yazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+transcription+factor+interactome+networks+using+HaloTag+protein+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).</li>
<li>Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein-protein+interactions+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> Methods. 24, 289-296 (2001).</li>
<li>Walter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant J. 40, 428-438 (2004).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+luciferase+complementation+imaging+assay+for+protein-protein+interactions+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants.</a> Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).</li>
<li>Layton, C. J., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+protein-protein+interactions+by+thermal+stability+shift+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis.</a> Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).</li>
<li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+determination+of+binding+affinity+and+kinetics+using+surface+plasmon+resonance+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors.</a> Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).</li>
<li>Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+repression+of+photomorphogenesis%3A+role+switching+of+COP%2FDET%2FFUS+in+light+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+plant+biology%22%5BJournal%5D)">Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling.</a> Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).</li>
<li>Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+cryptochrome+1+interacts+with+SPA1+to+suppress+COP1+activity+in+response+to+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light.</a> Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).</li>
<li>Lian, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue-light-dependent+interaction+of+cryptochrome+1+with+SPA1+defines+a+dynamic+signaling+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism.</a> Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).</li>
<li>Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+light-dependent+interaction+of+CRY2+with+SPA1+regulates+COP1+activity+and+floral+initiation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis.</a> Curr Biol. 21, 841-847 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il protocollo descritto qui è semplice e riproducibile per studiare in vivo interazioni proteina-proteina e particolarmente adatto per la rilevazione di dinamiche di interazione della proteina sotto trattamento esogeno. Il passo fondamentale in questa analisi è N. benthamiana infiltrazione. Per garantire il successo di infiltrazione, le piante devono essere molto sani. Un altro fattore critico è quando controllare l'attività luciferasica dopo infiltrazione. Non c'è nessuna risposta corretta a questa dom...

Al fine di coordinare la crescita con il suo ambiente, le piante hanno sviluppato eleganti vie di segnalazione per percepire, trasduce e rispondere ai segnali di segnalazione. Come i corridori in una gara a staffetta, le proteine sono necessari giocatori nella trasduzione del segnale di pianta. È stato ampiamente riconosciuto che l'interazione proteina-proteina (PPI) svolge un ruolo importante per la comunicazione cellulare. Degradazione, acetilazione e fosforilazione della proteina dipendono tutti dalla interazione fisica tra una proteina dell'obiettivo e suoi enzimi di modificazione. Ad esempio, proteine della famiglia di Jasmonate ZIM-dominio della proteina (JAZ) interagiscono con il fattore di trascrizione MYC2 e sopprimono la sua attività trascrizionale1,2. Data l'importanza di PPI, su grande scala della proteina Interattomi nelle piante sono state recentemente esplorato3,4,5. Questi risultati Interactoma ulteriormente rivelano la complessa rete di regolamentazione che coordina diverse funzioni cellulari.
Ci sono alcuni approcci stabiliti per il monitoraggio di PPI. Il dosaggio di lievito due ibridi (Y2H) è il metodo più utilizzato per il rilevamento di PPI. Y2H è facile da eseguire e adatto per un rapido test esaminare le interazioni della proteina. Y2H è anche ampiamente usato per lo screening di partners di interazione sconosciuto per la proteina di interesse specifico. Tuttavia, poiché Y2H è interamente realizzato in lievito, non può riflettere lo scenario reale in pianta cellule e porta alto tasso di falsi positivi. Un'altra strategia simile è il test di discesa. In generale, due proteine sono espresse e purificati da cellule di Escherichia coli e quindi misto e immobilizzati per rilevare le interazioni della proteina. Anche se questo metodo non è che richiede tempo, non è possibile ottenere in vivo risultati di interazione sia. Per scopi di interazione in vivo , co-immunoprecipitazione (co-IP) è il test più popolare, che richiede dell'anticorpo di alta qualità a immunoprecipitate la proteina di interesse e non può escludere la possibilità di PPIs indiretta. Inoltre, a causa di complicate procedure sperimentali in co-IP, i risultati variano solitamente con competenze individuali.
Saggi di ricostituzione reporter basato avanzano notevolmente il rilevamento di in vivo PPI. Questi metodi includono fluorescenza resonance energy transfer (FRET)6, fluorescenza bimolecolare complementazione (BiFC)7e la complementazione di firefly luciferase imaging (LCI) dosaggio8. Anche se questi tre approcci sono meglio di co-IP per riflettere il diretto in vivo PPI, FRET e BiFC bisogno specifici microscopi per rilevare segnali di fluorescenza e facilmente non può quantificare l'intensità di interazione. Al contrario, LCI si avvale della luciferasi firefly, che si illuminerà dopo reagendo con sua luciferina di substrato. Ancora più importante, intensità PPI può essere determinato dal valore dell'attività luciferasica. Così, LCI non solo indica se due proteine interagiscono o non, ma fornisce anche informazioni sulle dinamiche di interazione sul trattamento. Anche se ci sono alcuni metodi stabiliti per il monitoraggio di interazione dinamica (basata su turni di stabilità termica o risonanza plasmonica di superficie)9,10, questi approcci richiedono strumenti delicati o etichettatura specifica. Al contrario, LCI è più facile da eseguire e rilevare.
Il principio per LCI è che le metà amino-terminale e carbossi-terminale della luciferasi (denominato N-Luc o C-Luc, rispettivamente) sono stati fusi con proteina A e B e questi due fusione proteine contemporaneamente sono state espresse nelle cellule vegetali. Se la proteina A interagisce con la proteina B, quindi le due metà della luciferasi verrà ricostituita per essere un enzima luciferasi attivo. L'attività luciferasica può essere rilevato con un luminometro o la telecamera CCD. Non è necessario ottenere trasformanti stabili per LCI; l'espressione transitoria è sufficiente per ottenere un risultato di alta qualità di interazione.
ANELLO-tipo E3 ubiquitina ligasi costitutiva fotomorfogeniche 1 (COP1) interagisce con una miriade di fattori di trascrizione e promuove la loro degradazione attraverso il proteasoma 26S11. Alcuni di questi fattori di trascrizione COP1-mirati sono regolatori positivi per fotomorfogenesi. Nel buio, COP1 interagisce con soppressore di Fitocromo A-105 1 (SPA1), che esalta la COP1 E3 attività8. Dopo la percezione della luce, fotorecettori si abolisce l'interazione COP1-SPA1 per inibire l'attività COP1 e quindi stabilizzare COP1 substrati12,13,14. Questo esempio illustra il significato biologico di studiare PPI e determinare dinamiche PPI.

<table><tbody><tr><td>Soluzione di trasformazione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Acido morfolinetsolfonico</td><td>VETEC</td><td>V900336&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>27.8 mM Glucosio</td><td>VETEC</td><td>V900392</td><td></td></tr><tr><td>10 mM MgCl2&volte; 6H2O</td><td>VETEC</td><td>V900020&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>150 &mu; M Acetosiringone</td><td>ALDRICH</td><td>D134406&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pH 5,7</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Luciferina tampone di lavoro</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mM Luciferina sale di potassio</td><td>GOLD BIOTECHNOLOGY</td><td>LUCK-100</td><td></td></tr><tr><td>0,025% Triton X-100</td><td>VETEC</td><td>V900502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>H2O a 10 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analisi di imaging di complementazione di luciferase in foglie di nicotiana benthamiana per transitoriamente determinare dinamiche di interazione proteina-proteina

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Interazioni proteina-proteina sono meccanismi fondamentali per l'inoltro della trasduzione del segnale nei processi più cellulari; Pertanto, identificazione delle coppie di interazione proteina-proteina novella e dinamiche di interazione della proteina di monitoraggio sono di particolare interesse per rivelare come le piante rispondono ai fattori ambientali e/o segnali inerente allo sviluppo. Una pletora di approcci sono stati sviluppati per esaminare le interazioni proteina-proteina, sia in vitro che in vivo. Tra questi, la complementazione di luciferase recentemente stabilito imaging (LCI) analisi è il metodo più semplice e veloce per la dimostrazione in vivo interazioni proteina-proteina. In questo test, proteina A o proteina B si fonde con la metà amino-terminale o carbossi-terminale della luciferasi, rispettivamente. Quando la proteina A interagisce con la proteina B, le due metà della luciferasi verrà ricostituita per formare un enzima luciferasi funzionale e attivo. L'attività luciferasica può essere registrato con un luminometro o la telecamera CCD. Rispetto ad altri approcci, il dosaggio LCI Mostra interazioni proteina-proteina sia qualitativamente che quantitativamente. L'infiltrazione di Agrobacterium in foglie di Nicotiana benthamiana è un sistema ampiamente utilizzato per l'espressione della proteina transitoria. Con la combinazione di LCI ed espressione transiente, questi approcci mostrano che l'interazione fisica tra COP1 e SPA1 è stata gradualmente ridotta dopo il trattamento jasmonato.

Tre passaggi principali possono essere individuati in questo protocollo di complementazione di luciferase per lo studio delle proteine interazioni in vivo, tra cui la crescita delle piante, l'infiltrazione di tabacco e l'analisi di luciferase. Il passaggio più importante in questo protocollo è infiltrazione del liquido a. tumefaciens in N. benthamiana foglie (Figura 1).
Ec...

Questo manoscritto descrive una facile e rapida procedura sperimentale per la determinazione di interazioni proteina-proteina basate sulla misurazione dell'attività luciferasica.

Analisi di Imaging di complementazione di luciferase in foglie di Nicotiana benthamiana per transitoriamente determinare dinamiche di interazione proteina-proteina

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di rilevare quantitativamente le interazioni proteina-proteina in un sistema di espressione transitorio. Questa misura può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi delle transazioni quan-signal, come ad esempio come monitorare quantitativamente le direzioni delle nostre proteine proteiche dopo un trattamento chimico o ambientale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza un luminometro o una telecamera CCD per rilevare l'attività lucifera, che rappresenta l'intensità della direzione della proteina proteica in modo che i risultati siano più accurati.Per iniziare questa procedura, aggiungere un millilitro di una soluzione contenente il cinque percento di ipoclorito di sodio e zero virgola uno percento di tritone x cento a una provetta per microcentrifuga da cinque millilitri contenente semi. Lasciate riposare la soluzione per cinque minuti per sterilizzare i semi. Quindi, lava i semi con acqua sterile cinque volte.Sospendete i semi lavati in duecento microlitri di acqua sterile. Usando punte sottili, posizionare con cura i singoli semi sulla superficie del terreno di coltura in agar MS placcato. Conserva le piastre a quattro gradi Celsius per tre giorni per sincronizzare la germinazione.Dopodiché, mantieni le piastre medie in condizioni di crescita normali per dieci giorni. Trasferisci le piantine in germinazione nel terreno, facendo attenzione a non danneggiare le radici. Coprire il vassoio con un coperchio di plastica trasparente durante la notte per mantenere l'umidità.Coltiva le piante in una stanza di crescita controllata per sette settimane, quando saranno pronte per l'infiltrazione dell'agrobacterium tumefaciens. Per iniziare, somministrare centocinquanta nanogrammi di plasmidi nel ceppo cellulare competente a-tumefaciens GV3101. Posizionare le provette contenenti la coltura di a-tumefaciens in uno shaker e incubare per quattro ore.Utilizzando una bacchetta di vetro, trasferire la coltura dalle provette ai terreni LB. Coltura a-tumefaciens e LB agar medium a 28 gradi Celsius per quattro giorni. Successivamente, preparati a inoculare una singola colonia di a-tumefaciens da ciascuna piastra nella sua provetta contenente tre millilitri di terreno liquido LB.Agitare a 280 RBM a 28 gradi Celsius per 24 ore per propagare la coltura. Quindi, trasferire 75 microlitri di coltura batterica in 15 millilitri di terreno liquido LB fresco contenente 15 microgrammi per millilitro di kanamicina e 50 microgrammi per millilitro di rifampicina. Coltiva i batteri a 220 giri/min a 30 gradi Celsius per circa 8 ore fino a quando OD600 è compreso tra 0,5 e 1.Successivamente, trasferire la coltura in provette da centrifuga da 15 millilitri. Centrifugare a 4000 volte la gravità e quattro gradi Celsius per 15 minuti. Scartare il surnatante e risospendere il pallet in 15 millilitri di soluzione di trasformazione.Centrifugare a 4000 volte la gravità e 4 gradi Celsius per 15 minuti. Quindi, ripetere ancora una volta la fase di sospensione e centrifugazione. Scartare il surnatante e risospendere il pallet in 5 millilitri di soluzione di trasformazione.Lasciare riposare il pallet risospeso per due ore a temperatura ambiente in condizioni di oscurità. Quindi, aggiungere la soluzione di trasformazione nell'OD600 è 0,5 o combinare due campioni con lo stesso volume per testare le interazioni proteiche accoppiate. Usando un ago da un millilitro di siringa, infiltrare le cellule sospese nella quarta-settima foglia.Dopodiché, copri immediatamente le piante con una copertura di plastica nera per 12 ore. In primo luogo, le piante dovrebbero essere molto sane per garantire il successo. In secondo luogo, assicurati di non danneggiare le foglie durante il processo di infiltrazione.Tenere il vassoio al buio per 12 ore. Quindi coltiva le piante in condizioni normali per 2-4 giorni prima di rilevare l'attività della luciferasi. Per iniziare il metodo di imaging, staccare una foglia infiltrata.Posizionare l'intero foglietto illustrativo su un piatto di terreno di coltura MS agar. Utilizzando un flacone spray da 50 millilitri, spruzzare il tampone di lavoro luciferon sul lato adassiale delle foglie. Quindi, tenere al buio per 5 minuti per spegnere l'autofluorescenza della clorofilla.Utilizzare un apparecchio CCD raffreddato a bassa luce raffreddato a 30 gradi Celsius negativi per acquisire immagini con un tempo di esposizione pieno di luce di 50 millisecondi e un tempo di rilevamento della luminescenza di 1 minuto. Successivamente, ritaglia i frammenti di foglie dall'area di infiltrazione delle foglie N-benthamiana. Immergere i frammenti in 100 microlitri di acqua deionizzata nei pozzetti della piastra bianca a 96 pozzetti.Aggiungere dieci microlitri di tampone di lavoro luciferon. Lasciate riposare il piatto 5 minuti. Quindi, esegui qualsiasi trattamento specifico desiderato per studiare la dinamica dell'interazione proteica e misura la luminescenza direttamente con un luminometro commerciale.Qui è mostrata la dimostrazione dell'attività lucifera per rappresentare le interazioni COP 1 SPA 1. L'attività lucifera, che viene rilevata dalla luminescenza, viene ripresa da una telecamera CCD. Si è visto che le interazioni COP 1 SPA 1 provocano la mutazione del rame della luciferasi funzionale.Viene quindi determinata l'attività della luciferasi durante il trattamento con Jasmine 8 nel tempo. Si osserva che le interazioni COP 1 SPA 1 rappresentate dall'attività della luciferasi diminuiscono gradualmente nell'oscurità. Il trattamento con Jasmine 8 riduce ulteriormente queste interazioni.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 1 settimana, dopo che le piante sono pronte se viene eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere le piante sane. Infiltra le foglie con attenzione e includi correttamente i controlli.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo delle transazioni di segnale per esplorare le dinamiche di interazione proteina-proteina in modo rapido. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come coltivare le piante di tabacco, infiltrare gli agrobatteri nelle foglie di tabacco e rilevare attività lucifere.

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In questo articolo viene illustrato come utilizzare correttamente il BioRad Helios Gene Gun per introdurre DNA plasmidico in cellule epidermiche di cipolla e come test per interazioni proteina-proteina in cellule di cipolla in base al principio della complementazione bimolecolare fluorescenza...

Biomolecolare fluorescenza complementazione (BiFC) Assay per interazione proteina-proteina nelle cellule Cipolla Utilizzando la Helios Gun Gene

Abbiamo sviluppato una tecnica per testare interazioni proteina-proteina in pianta. Una proteina fluorescente gialla (YFP) è divisa in due frammenti non si sovrappongono. Ogni frammento viene clonato in-frame ad un gene di interesse attraverso il sistema Gateway, consentendo l'espressione di proteine ​​di fusione. Ricostituzione del segnale YFP si verifica solo quando le proteine ​​interagiscono inchiesta.

Rilevamento delle interazioni proteiche in pianta utilizzando un gateway compatibile complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC) Sistema

Questo video mostra il test di complementazione della luciferasi divisa per rilevare le interazioni proteina-proteina. In questo saggio, le proteine di interesse sono etichettate con frammenti piccoli e grandi dell'enzima luciferasi. Quando le proteine interagiscono, i frammenti grandi e piccoli si combinano per formare un complesso enzimatico attivo, che in presenza di un substrato specifico, rilascia una luminescenza brillante che può essere misurata.

Saggio di complementazione della luciferasi divisa per identificare specifiche interazioni proteina-proteina

Produzione di proteine ​​transitoria nelle piante di Nicotiana sulla base di infiltrazione sottovuoto con Agrobacteria trasportando i vettori di lancio (Tobacco Mosaic Virus-based) è un approccio rapido ed economico per la produzione di antigeni e proteine ​​terapeutiche. Abbiamo semplificato la procedura e migliorato l'accumulo di destinazione ottimizzando le condizioni di coltivazione batteri, selezionando specie ospite e co-introduzione di silenziamento dell'RNA soppressori.

Ottimizzazione e utilizzo di<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Mediata transitoria produzione di proteine ​​in<em&gt; Nicotiana</em

Formazione di complessi proteici in vivo può essere visualizzato da bimolecular fluorescenza complementazione. Partner di interazione sono fusi a parti complementari tag fluorescenti e transitoriamente espressi in foglie di tabacco, risultando in un segnale fluorescente ricostituito upon vicinanza delle due proteine.

Interazioni proteina-proteina visualizzati tramite bimolecular complementazione fluorescenza in protoplasti di tabacco e foglie

A livello subcellulare, gli eventi di segnalazione sono modulati dinamicamente da segnali di sviluppo e ambientali. Qui descriviamo un protocollo che impiega il sistema di espressione transitoria del tabacco per monitorare l'interazione dinamica proteina-proteina e per rivelare l'organizzazione spaziale della trasduzione del segnale nelle cellule vegetali.

Imaging Riorganizzazione spaziale di una via di segnalazione MAPK Utilizzando il sistema transitorio Expression Tabacco

Il protocollo qui presentato ha lo scopo di dimostrare la presenza di interazioni eterologhe tra proteine di membrana di tipo III residenti a Golgi con N- e/o C-termini esposti citoplasmaticamente in cellule di mammifero vive utilizzando la variante più recente del test di complementazione della luciferasi divisa.

Dimostrazione di complessi eterologhi formati da proteine di membrana di tipo III residenti in Golgi utilizzando il test di complementazione della luciferasi divisa

Descriviamo qui un metodo semplice per l'espressione, l'estrazione e la purificazione dell'IgG umano ricombinante fuso a GFP a Nicotiana benthamiana. Questo protocollo può essere esteso alla purificazione e visualizzazione di numerose proteine che utilizzano la cromatografia delle colonne. Inoltre, il protocollo è adattabile al laboratorio di insegnamento universitario di persona e virtuale, fornendo esplorazione basata su progetti.

Produzione di proteine di fusione IgG espresse transitoriamente in Nicotiana benthamiana

Qui presentiamo un metodo per visualizzare la formazione di complessi ternari tra tre partner proteici utilizzando proteine fluorescenti marcate dal test FRET-FLIM basato su BiFC. Questo metodo è prezioso per studiare i complessi di interazione proteina-proteina in vivo.

Determinazione dell'interazione tripartita tra due monomeri di un fattore di trascrizione MADS-box e una proteina sensore di calcio mediante saggio BiFC-FRET-FLIM

Il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) è una tecnica di imaging per rilevare le interazioni proteiche nelle cellule viventi. Qui viene presentato un protocollo FRET per studiare l'associazione di enzimi modificanti gli istoni con fattori di trascrizione che li reclutano nei promotori bersaglio per la regolazione epigenetica dell'espressione genica nei tessuti vegetali.

Studio delle interazioni tra enzimi modificanti gli istoni e fattori di trascrizione in vivo mediante trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza

Questo protocollo descrive la selezione di marcatori plasmodesmici ottimali per analisi basate su microscopia confocale del targeting proteico dei plasmodesmi durante le interazioni virus-plasmodesmi o il trasporto plasmodesmico.

Analisi al microscopio confocale dello smistamento delle proteine in Plasmodesmata in Nicotiana benthamiana

Impara a rilevare interazioni proteina-proteina in foglie di Nicotiana benthamiana mediante complementazione di luciferasi. Questo metodo quantitativo utilizza luminometro o camera CCD per studiare dinamiche di segnalazione cellulare.

Analisi di Imaging di complementazione di luciferase in foglie di Nicotiana benthamiana per transitoriamente determinare dinamiche di interazione proteina-proteina (Video) | JoVE Journal

Analisi di Imaging di complementazione di luciferase in foglie di Nicotiana benthamiana per transitoriamente determinare dinamiche di interazione proteina-proteina

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