Analisi di Imaging di complementazione di luciferase in foglie di Nicotiana benthamiana per transitoriamente determinare dinamiche di interazione proteina-proteina

Questo manoscritto descrive una facile e rapida procedura sperimentale per la determinazione di interazioni proteina-proteina basate sulla misurazione dell'attività luciferasica.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di rilevare quantitativamente le interazioni proteina-proteina in un sistema di espressione transitorio. Questa misura può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi delle transazioni quan-signal, come ad esempio come monitorare quantitativamente le direzioni delle nostre proteine proteiche dopo un trattamento chimico o ambientale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza un luminometro o una telecamera CCD per rilevare l'attività lucifera, che rappresenta l'intensità della direzione della proteina proteica in modo che i risultati siano più accurati.

Per iniziare questa procedura, aggiungere un millilitro di una soluzione contenente il cinque percento di ipoclorito di sodio e zero virgola uno percento di tritone x cento a una provetta per microcentrifuga da cinque millilitri contenente semi. Lasciate riposare la soluzione per cinque minuti per sterilizzare i semi. Quindi, lava i semi con acqua sterile cinque volte.

Sospendete i semi lavati in duecento microlitri di acqua sterile. Usando punte sottili, posizionare con cura i singoli semi sulla superficie del terreno di coltura in agar MS placcato. Conserva le piastre a quattro gradi Celsius per tre giorni per sincronizzare la germinazione.

Dopodiché, mantieni le piastre medie in condizioni di crescita normali per dieci giorni. Trasferisci le piantine in germinazione nel terreno, facendo attenzione a non danneggiare le radici. Coprire il vassoio con un coperchio di plastica trasparente durante la notte per mantenere l'umidità.

Coltiva le piante in una stanza di crescita controllata per sette settimane, quando saranno pronte per l'infiltrazione dell'agrobacterium tumefaciens. Per iniziare, somministrare centocinquanta nanogrammi di plasmidi nel ceppo cellulare competente a-tumefaciens GV3101. Posizionare le provette contenenti la coltura di a-tumefaciens in uno shaker e incubare per quattro ore.

Utilizzando una bacchetta di vetro, trasferire la coltura dalle provette ai terreni LB. Coltura a-tumefaciens e LB agar medium a 28 gradi Celsius per quattro giorni. Successivamente, preparati a inoculare una singola colonia di a-tumefaciens da ciascuna piastra nella sua provetta contenente tre millilitri di terreno liquido LB.

Agitare a 280 RBM a 28 gradi Celsius per 24 ore per propagare la coltura. Quindi, trasferire 75 microlitri di coltura batterica in 15 millilitri di terreno liquido LB fresco contenente 15 microgrammi per millilitro di kanamicina e 50 microgrammi per millilitro di rifampicina. Coltiva i batteri a 220 giri/min a 30 gradi Celsius per circa 8 ore fino a quando OD600 è compreso tra 0,5 e 1.

Successivamente, trasferire la coltura in provette da centrifuga da 15 millilitri. Centrifugare a 4000 volte la gravità e quattro gradi Celsius per 15 minuti. Scartare il surnatante e risospendere il pallet in 15 millilitri di soluzione di trasformazione.

Centrifugare a 4000 volte la gravità e 4 gradi Celsius per 15 minuti. Quindi, ripetere ancora una volta la fase di sospensione e centrifugazione. Scartare il surnatante e risospendere il pallet in 5 millilitri di soluzione di trasformazione.

Lasciare riposare il pallet risospeso per due ore a temperatura ambiente in condizioni di oscurità. Quindi, aggiungere la soluzione di trasformazione nell'OD600 è 0,5 o combinare due campioni con lo stesso volume per testare le interazioni proteiche accoppiate. Usando un ago da un millilitro di siringa, infiltrare le cellule sospese nella quarta-settima foglia.

Dopodiché, copri immediatamente le piante con una copertura di plastica nera per 12 ore. In primo luogo, le piante dovrebbero essere molto sane per garantire il successo. In secondo luogo, assicurati di non danneggiare le foglie durante il processo di infiltrazione.

Tenere il vassoio al buio per 12 ore. Quindi coltiva le piante in condizioni normali per 2-4 giorni prima di rilevare l'attività della luciferasi. Per iniziare il metodo di imaging, staccare una foglia infiltrata.

Posizionare l'intero foglietto illustrativo su un piatto di terreno di coltura MS agar. Utilizzando un flacone spray da 50 millilitri, spruzzare il tampone di lavoro luciferon sul lato adassiale delle foglie. Quindi, tenere al buio per 5 minuti per spegnere l'autofluorescenza della clorofilla.

Utilizzare un apparecchio CCD raffreddato a bassa luce raffreddato a 30 gradi Celsius negativi per acquisire immagini con un tempo di esposizione pieno di luce di 50 millisecondi e un tempo di rilevamento della luminescenza di 1 minuto. Successivamente, ritaglia i frammenti di foglie dall'area di infiltrazione delle foglie N-benthamiana. Immergere i frammenti in 100 microlitri di acqua deionizzata nei pozzetti della piastra bianca a 96 pozzetti.

Aggiungere dieci microlitri di tampone di lavoro luciferon. Lasciate riposare il piatto 5 minuti. Quindi, esegui qualsiasi trattamento specifico desiderato per studiare la dinamica dell'interazione proteica e misura la luminescenza direttamente con un luminometro commerciale.

Qui è mostrata la dimostrazione dell'attività lucifera per rappresentare le interazioni COP 1 SPA 1. L'attività lucifera, che viene rilevata dalla luminescenza, viene ripresa da una telecamera CCD. Si è visto che le interazioni COP 1 SPA 1 provocano la mutazione del rame della luciferasi funzionale.

Viene quindi determinata l'attività della luciferasi durante il trattamento con Jasmine 8 nel tempo. Si osserva che le interazioni COP 1 SPA 1 rappresentate dall'attività della luciferasi diminuiscono gradualmente nell'oscurità. Il trattamento con Jasmine 8 riduce ulteriormente queste interazioni.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 1 settimana, dopo che le piante sono pronte se viene eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere le piante sane. Infiltra le foglie con attenzione e includi correttamente i controlli.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo delle transazioni di segnale per esplorare le dinamiche di interazione proteina-proteina in modo rapido. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come coltivare le piante di tabacco, infiltrare gli agrobatteri nelle foglie di tabacco e rilevare attività lucifere.