Name: Metodologia per la neuromodulazione Biomimetic chimico di retine del ratto con il neurotrasmettitore glutammato In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 56 s
Description: Scopri la neuromodulazione chimica biomimetica di retine di ratto usando il glutammato come neurotrasmettitore. Questo metodo offre visione più naturale rispetto alla stimolazione elettrica per trattare cecità da degenerazione fotorecettoriale.

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Il lavoro presentato nel libro è stato sostenuto dalla National Science Foundation, frontiere emergenti nella ricerca e innovazione (NSF-EFRI) programma concede numero 0938072. Il contenuto di questa carta è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale della NSF. Gli autori desiderano anche ringraziare il Dr. Samsoon Inayat per il suo lavoro di progettazione e collaudo il setup sperimentale iniziale per stimolazione chimica e Mr. Ashwin Raghunathan per il suo lavoro di progettazione, fabbricazione e valutazione del dispositivo microfluidico multiporta utilizzato in Questo studio.

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il metodo presentato qui di seguito viene illustrato un paradigma di stimolazione neurale unico, in cui i neuroni retinici sono chimicamente stimolati iniettando sostanze chimiche nativo neurotrasmettitore nel sottosuolo della retina in vitro. Questa tecnica di stimolazione chimica offre diversi vantaggi rispetto la tecnica di stimolazione elettrica convenzionale, tra cui selettività e focale elevata specificità dei neuroni bersaglio. Il protocollo sopra dettagli come piccole iniezioni pneumatiche volume del neu...

Malattie degenerative del fotoricettore, come la retinite pigmentosa e degenerazione maculare senile, stanno conducendo ereditabili cause di perdita della visione e sono attualmente incurabile1,2. Anche se queste malattie derivano da una varietà di specifiche mutazioni genetiche, malattie degenerative del fotoricettore sono caratterizzate come gruppo dalla perdita progressiva delle cellule fotorecettrici nella retina, causando eventualmente cecità. La perdita di trigger di fotorecettori diffusa che ritocca in tutta la retina, ma sopravvivere neuroni retinici, tra cui le cellule bipolari e RGCs, rimangono intatti e relativamente funzionale anche negli stadi avanzati di fotorecettore degenerazione3 ,4,5,6,7.
I meccanismi e le patologie di queste malattie sono state ben caratterizzate3,4,5,6,7 , ma un efficace trattamento resta sfuggente. Negli ultimi tre decenni, i ricercatori in tutto il mondo hanno studiato una varietà di trattamenti terapeutici per ripristinare la visione a persone affette da malattie degenerative dei fotorecettori, tra cui gene terapia8, cellule staminali trattamento9, trapianto retinico10e stimolazione artificiale11,12 dei neuroni della retina superstiti. Di questi, il più clinicamente disponibili sono protesi retiniche, che sono dispositivi di neurostimolazione artificiale che tradizionalmente hanno utilizzato un array di elettrodi per stimolare elettricamente le cellule bipolari o RGCs secondo schemi specifici con l'obiettivo di creazione di percezioni visive artificiali in pazienti11. Protesi elettrica attuale generazione, come l'Argus II13 e Alpha-IMS14 dispositivi, hanno ottenuto approvazione clinica e studi preliminari hanno indicato che può migliorare la qualità della vita per i pazienti ripristinando un misura della visione utilizzando sia epiretinica (anteriore della retina) e subretinal (dietro la retina) impiantato dispositivi15,16. Gruppi di ricerca intorno al mondo stanno lavorando su avanzando protesi retiniche dopo i successi di questi dispositivi prima generazione17,18,19,20 ma hanno affrontato Difficoltà progettare una protesi elettrica in grado di ripristinare la visione alta acuità inferiore al livello di cecità legale ai pazienti. Recenti studi hanno dimostrato che raggiungere la maggiore risoluzione spaziale di quella attivata per la generazione di corrente elettrica basato su protesi è impegnativo a causa del limite di iniezione di carica, che richiede l'uso di elettrodi grandi per stimolare in modo sicuro neuroni retinici a costo di risoluzione spaziale, cioè l'acuità visiva11,21. Inoltre, la stimolazione elettrica è ulteriormente limitato perché in genere stimola tutte le cellule vicine e quindi suscita percezioni innaturale e confusione nei pazienti, in gran parte perché è un paradigma di stimolazione intrinsecamente innaturale21. Tuttavia, i primi successi di stimolazione elettrica hanno dimostrato che la neurostimolazione artificiale può essere un efficace trattamento per le malattie degenerative del fotoricettore. Questo porta a ipotizzare che un trattamento ancora più efficace potrebbe essere realizzabile stimolando la retina con prodotti chimici di neurotrasmettitore, gli agenti naturali di comunicazione alle sinapsi chimiche. Lo scopo del metodo presentato in questa carta è quello di esplorare la fattibilità terapeutica della stimolazione chimica, che cerca di imitare il sistema naturale di comunicazione sinaptica tra neuroni retinici, come una stimolazione alternativa elettrica biomimetici per una protesi retinica.
Traduzione del concetto di stimolazione terapeutica chimica ad una protesi retinica chimica si basa su chimicamente attivazione di neuroni retinici di destinazione con piccole quantità di neurotrasmettitori nativi, come il glutammato, rilasciato attraverso un microfluidica dispositivo costituito da una vasta gamma di microporta in risposta alla stimolazione visiva. In questo modo, una protesi retinica chimica sarebbe essenzialmente uno strato di fotorecettori artificiali biomimetici che traduce fotoni naturalmente raggiunge la retina a segnali chimici. Poiché questi segnali chimici utilizzano gli stessi neurotrasmettitori utilizzati nella segnalazione della retina normale e stimolano i neuroni retinici superstiti di un degenerato retina attraverso le stesse vie sinaptiche utilizzato da vie di visione normale, il visual risultante percezione attraverso una protesi retinica chimica potrebbe essere più naturale e comprensibile rispetto a una evocata attraverso una protesi elettrica. Inoltre, poiché il microporta attraverso il quale vengono rilasciati i neurotrasmettitori possa essere fatte estremamente piccolo e raggruppate in alta densità, a differenza degli elettrodi, un potenziale chimico protesico potrebbe essere in grado di raggiungere più stimolo focale e superiore spaziale risoluzione rispetto a una protesi elettrica. Così, una protesi retinica chimica basato su questi potenziali vantaggi, offre un'alternativa altamente promettente per protesi elettriche.
Stimolazione chimica della retina, tuttavia, è stato relativamente poco esplorata fino a poco tempo. Mentre la stimolazione elettrica della retina è stata caratterizzata bene in decenni di lavoro attraverso in vitro22,23, in vivo23,24e studi clinici13 ,14, studi sulla stimolazione chimica sono stati limitati esclusivamente a pochi in vitro opere25,26,27,28. Iezzi e Finlayson26 e Inayat et al. 27 ha dimostrato epiretinal stimolazione chimica del retina in vitro utilizzando un singolo elettrodo e una matrice multielettrodo (MEA), rispettivamente, per registrare le risposte di glutammato evocato dei neuroni retinici. Più recentemente, Rountree et al. 28 ha dimostrato la stimolazione differenziale delle vie e spegnendo retiniche con glutammato dal lato subretinal e un MEA per registrare le risposte di un neurone da più siti sulla retina.Anche se questi lavori hanno stabilito preliminarmente la fattibilità di stimolazione chimica, ulteriori studi sono essenziali per studiare molti aspetti di questo approccio di là di quelli affrontati finora25,26,27 , 28e ottimizzare i parametri di stimolazione terapeutica in modelli animali sia in vitro che in vivo prima di tradurre questo concetto ad una protesi retinica chimica come discusso in precedenza. Tuttavia, attualmente non c'è nessuna metodologia consolidata per l'effettuazione di stimolazione chimica della retina nella letteratura e i metodi utilizzati in lavori precedenti non sono stati descritti in dettaglio quanto sarebbe essenziale per gli studi replicativi. Pertanto, la spiegazione razionale per questa carta di metodi è quello di fornire un quadro ben definito per lo svolgimento in vitro stimolazione chimica della retina per quei ricercatori interessati a entrambi la replica di nostri precedenti studi27, 28 o avanzando ulteriormente questo concetto nascente di neurostimolazione chimica.
Qui dimostriamo un metodo per lo svolgimento in vitro stimolazione chimica dei neuroni retinici in wholemount retine dei ratti di selvaggio-tipo e un modello di ratto degenerato del fotoricettore che imita molto attentamente la progressione del fotorecettore degenerativa malattie in esseri umani. La spiegazione razionale dietro lo sviluppo di questo metodo di stimolazione in modelli in vitro è quello di valutare le gamme terapeutiche di vari parametri di stimolazione e studiare le caratteristiche di risposta neurale che sarebbero impossibile o difficile da osservare in in vivo modelli, soprattutto durante gli studi iniziali incentrata su valutare la fattibilità di questo approccio. In questa procedura, indichiamo sia singolo sito e simultanee multi-sito stimolazioni chimiche delle retine fornendo piccole quantità di 1 millimetro di glutammato nei pressi di neuroni retinici di destinazione via commercialmente disponibili singola porta vetro Micropipette e una consuetudine dispositivo di silicio microlavorato microfluidici multi-porta, rispettivamente. Mentre stimolazioni sia sito singolo e multi-sito compire l'obiettivo fondamentale di studiare la fattibilità terapeutica di neuromodulazione chimica, ciascuna ha uno scopo distinto con un vantaggio unico. La stimolazione di singolo sito, che può essere realizzata con Micropipette di vetro pre-stirato commercialmente disponibile, può essere usata per iniettare sostanze chimiche direttamente nel sottosuolo della retina in un unico sito e serve a indagare se osservabile RGC spike tasso le risposte che sono simili alle risposte luce visivamente evocate possono essere suscitate focale nel sito di iniezione. D'altra parte, la stimolazione multisita, che richiede un dispositivo microfluidico multiporta appositamente fabbricati, può essere usata per iniettare sostanze chimiche nello spazio a più siti sopra la superficie della retina e serve per indagare quanto bene evocato da glutammato RCG modelli di risposta corrispondono ai modelli iniezione glutammato negli studi di stimolazione del reticolo.

<table><tbody><tr><td>Array di microelettrodi, layout perforato</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>60pMEA200/30iR-Ti-pr</td><td>http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti</td></tr><tr><td>Amplificatore MEA</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>MEA1060-Inv</td><td>http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv</td></tr><tr><td>Piastra di messa a terra per perfusione inferiore pMEA</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>MEA1060-Inv-(BC)-PGP</td><td>http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp</td></tr><tr><td>Micromanipolatore motorizzato a 3 assi</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>MP-285</td><td>https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html</td></tr><tr><td>Sistema di controllo del micromanipolatore</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>MPC-200</td><td>https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html</td></tr><tr><td>Gantry supporto per micromanipolatore con slitta lineare</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>MT-75/LS</td><td>https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html</td></tr><tr><td>iniettore di pressione multicanale programmabile a 8 canali</td><td>OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ Fornitore: Harvard Apparatus UK</td><td>PM-8000 o PM-8</td><td>OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm Fornitore: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1 _HAUK_ProductDetail</td></tr><tr><td>Axopatch 200A Integrating Patch Clamp Amplifier</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td>Axopatch 200A</td><td>Axopatch 200A è stato sostituito con un modello più recente Axopatch 200B: https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier</td></tr><tr><td>Patch clamp headstage</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td>CV 201A</td><td>http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage</td></tr><tr><td>Kit per rifiuti sottovuoto</td><td>ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY</td><td>VMK</td><td></td></tr> <tr><td>http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/ Porta pipetta</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT</td><td>QSW-A10P</td><td>https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915</td></tr><tr><td>Pre-tirato 10 &mu; micropipette in vetro con diametro punta m World</td><td>Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>TIP10TW1</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/</td></tr> <tr><td>Zoom stereomicroscopio</td><td>Nikon, Tokyo, Giappone</td><td>SMZ-745T</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745</td></tr><tr><td>Supporto per microscopio con doppia sfera lineare </td><td>Old School Industries, Inc., Dacono, CO</td><td>OS1010H-16BB</td><td>http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm</td></tr><tr><td>Zoom Stereomicroscopio con supporto LED ibrido C-LEDS</td><td>Nikon, Tokyo, Giappone</td><td>SMZ-445</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445</td></tr><tr><td>Sistema di microscopio invertito</td><td>Nikon, Tokyo, Giappone</td><td>Eclipse Ti-E</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E</td></tr><tr><td>Ames medium</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A1420</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420</td></tr><tr><td>Acido L-glutammico (glutammato)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G5667</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S8761</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761</td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 60 mm (altezza 10 mm)</td><td>Fischer Scientific, Waltham, MA</td><td>FB0875713A</td><td>Piastra di Petri trasparente da 60 mm; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a</td></tr><tr><td>Jewelers #5 Forceps</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>555227F</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/</td></tr> <tr><td>Lama per bisturi standard #24</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>500247</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/</td></tr> <tr><td>Manico per bisturi #4</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>500237</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/</td></tr> <tr><td>Vannas Tubingen Forbici da dissezione</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>503378 Kit rete</td><td>in nylon https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/</td></tr> <tr><td></td><td>Warner Instruments, Hamden, CT</td><td>NYL/MESH</td><td>https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173</td></tr><tr><td>Griglia per fette per arpa ALA</td><td>Scientific Instruments, Farmingdale, NY</td><td>HSG-5AD</td><td>Pellet</td></tr> di <tr><td>elettrodi di riferimento http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/ Ag/AgCl</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>P1060</td><td>http://www.multichannelsystems.com/products/p1060</td></tr><tr><td>Sistema di perfusione a gravità controllata da valvola a 4 canali</td><td>ALA Strumenti scientifici, Farmingdale, NY</td><td>VC3-4xG</td><td>http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/</td></tr> <tr><td>Zyla 5.5 sCMOS fotocamera per microscopio</td><td>Andor Technology, Belfast, Regno Unito</td><td>Zyla 5.5 sCMOS</td><td>http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos</td></tr><tr><td>filo d'argento (50 &mu; Tubo</td> microforo <td>Fischer Scientific, Waltham, MA</td><td>AA44461G5</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5</td></tr><tr><td>Tygon (diametro 1,6 mm)</td><td>Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td><td>EW-06419-01</td><td>https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901</td></tr><tr><td>Portautensili inclinabile con cannula</td> <td>in acciaioALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY</td><td>TILTPORT</td><td>Uno di questi è stato utilizzato per la perfusione e l'aspirazione superiori; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/</td></tr> <tr><td>Roscolux #26 Foglio filtrante rosso chiaro</td><td>Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT</td><td>R2611</td><td>Produttore: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux Venditore: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html</td></tr><tr><td>Smith & Wesson Galaxy Torcia Rossa</td><td>Smith & Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA</td><td>4588</td><td>Produttore: https://www.smith-wesson.com/ Fornitore: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588</td></tr><tr><td>MC_Rack Software</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>MC_Rack</td><td></td></tr><tr><td>http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack Labview Software</td><td>National Instruments, Austin, TX</td><td>LabVIEW</td><td>http://www.ni.com/labview/</td></tr> <tr><td>NIS-Elements: Basic Research Software</td><td>Nikon, Tokyo, Giappone</td><td>NIS-Elements BR</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research</td></tr></tbody></table>

metodologia per la neuromodulazione biomimetic chimico di retine del ratto con il neurotrasmettitore glutammato in vitro

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

Malattie degenerative dei fotorecettori causano cecità irreparabili attraverso la progressiva perdita di cellule fotorecettrici della retina. Le protesi retiniche sono un trattamento emergente per le malattie degenerative dei fotorecettori che cercano di ripristinare la visione stimolando artificialmente i neuroni retinici superstiti nella speranza di suscitare comprensibile percezione visiva in pazienti. Corrente protesi retiniche hanno dimostrato successo nel ripristinare la visione limitata ai pazienti utilizzando una matrice di elettrodi per elettricamente stimolano la retina ma affrontare notevoli ostacoli in ripristino alta acuità, visione naturale ai pazienti. Neurostimolazione chimica usando neurotrasmettitori nativi è una stimolazione alternativa elettrica biomimetici e potrebbe bypassare le limitazioni fondamentali connesse con protesi retiniche con neurostimolazione elettrica. In particolare, neurostimolazione chimica ha il potenziale per ripristinare la visione più naturale con le acuità visiva paragonabile o migliore ai pazienti iniettando piccole quantità di neurotrasmettitori, gli stessi agenti naturali di comunicazione utilizzati da Retina prodotto chimico sinapsi, a risoluzione molto più fine rispetto a protesi elettriche corrente. Tuttavia, come un paradigma di stimolazione relativamente inesplorato, non c'è nessun protocollo stabilito per raggiungere stimolazione chimica della retina in vitro. Lo scopo di questo lavoro è quello di fornire un quadro dettagliato per l'effettuazione di stimolazione chimica della retina per i ricercatori che desiderano studiare il potenziale di neuromodulazione chimica della retina o simili tessuti neurali in vitro. In questo lavoro descriviamo la messa a punto sperimentale e la metodologia per suscitare retiniche del ganglio (RGC) spike risposte simili a visual luce le risposte delle cellule nel selvaggio-tipo e controllato retine del ratto del fotoricettore-degenerato wholemount iniettando volumi di il glutammato, un neurotrasmettitore nello spazio subretinal usando vetro Micropipette e un dispositivo microfluidico multiporta personalizzato. Questa metodologia e il protocollo sono abbastanza generale per essere adattato per neuromodulazione con altri neurotrasmettitori o anche altri tessuti neurali.

Questo protocollo può essere utilizzato per stimolare chimicamente retine normali, selvaggio-tipo così come il fotorecettore degenerato retine, nonostante il notevole rimodellamento cellulare causata dalla perdita dei fotorecettori. Prima di iniziare gli esperimenti con entrambi del fotoricettore degenerato o retine di selvaggio-tipo, la necessità di attrezzature (Figura 1 e Figura 2) registrazione e stimolazione di essere prepar...

Questo protocollo descrive un nuovo metodo per lo studio di una forma di neurostimolazione chimica del wholemount ratto retine in vitro con il glutammato, un neurotrasmettitore. Neurostimolazione chimica è un'alternativa promettente per la neurostimolazione elettrica convenzionale dei neuroni retinici per il trattamento di cecità irreversibile causata da malattie degenerative dei fotorecettori.

Metodologia per la neuromodulazione Biomimetic chimico di retine del ratto con il neurotrasmettitore glutammato In Vitro

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are ...

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di consentire una nuova neuromodulazione chimica dei neuroni retinici utilizzando neurotrasmettitori, che potrebbe potenzialmente sostituire la funzionalità delle cellule retiniche difettose nei pazienti con cecità neurodegenerativa per ripristinare la vista. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della visione artificiale. Ad esempio, il glutammato, un neurotrasmettitore retinico primario, può essere utilizzato per stimolare terapeuticamente una retina degenerata da un fotorecettore?Il vantaggio principale della nostra tecnica è che è biomimetica, la stimolazione della retina in questo modo offre il potenziale per una maggiore acuità visiva e una visione più naturalistica di quanto sia possibile con la stimolazione elettrica. Le implicazioni di questa tecnica si estendono al trattamento della cecità, dovuta a malattie degenerative dei fotorecettori, perché un intervento terapeutico precoce di una retina degenerata potrebbe ripristinare la sensibilità al glutammato nei neuroni retinici. Per iniziare questa procedura, posizionare entrambi gli occhi enucleati in una capsula di Petri di 60 millimetri di diametro con una soluzione di Ames'medium fresca ossigenata.Utilizzando uno stereomicroscopio da dissezione, praticare una piccola incisione nel viso corneale utilizzando un bisturi o un paio di forbici affilate. Quindi, fai un taglio da questa piccola incisione fino al bordo della cornea. Ed estenderlo in una sezione circonferenziale attorno all'intero bordo della cornea.Quindi, rimuovere la cornea staccata insieme al cristallino, l'umore acqueo traslucido e l'umor vitreo. Tenendo delicatamente l'oculare con un paio di pinze, praticare con cura due piccole incisioni sui lati opposti dell'oculare. Quindi, usa due paia di pinze per separare delicatamente la conchiglia oculare in ciascuna delle incisioni.E separare la retina dalla sclera. Sollevare lentamente l'intera retina dalla sclera e dall'oculare e tagliare il nervo ottico se è ancora attaccato. Successivamente, eseguire tagli longitudinali nella retina per ottenere sezioni a metà o a un quarto.E poi stendere delicatamente una sezione retinica su una rete di nylon con le cellule gangliari rivolte lontano dalla rete. Posizionare la rete e la retina su un array multielettrodo perforato con le cellule gangliari a contatto con una superficie PMEA. E poi metti un peso sopra la rete per mantenere la retina in posizione.In questa procedura, in condizioni di scarsa illuminazione rossa, posizionare PMEA nell'amplificatore MEA e chiudere i fermi dell'amplificatore. Posizionare l'uscita di perfusione superiore all'interno della camera PMEA e aprire la valvola di perfusione superiore per ottenere una velocità di perfusione di circa tre millilitri al minuto. Quindi, posizionare l'ingresso di aspirazione superiore al livello otto desiderato.Assicurati che funzioni. Successivamente, apri il software di acquisizione dati e fai clic sul pulsante di riproduzione per iniziare a ricevere i dati. Assicurarsi che tutti i canali PMEA siano privi di rumore e registrino neuro-segnali.In caso contrario, riposizionare il PMEA all'interno dell'amplificatore per ottenere un migliore contatto tra i pin dell'amplificatore e i contatti del PMEA. Quindi, assicurarsi che la linea di perfusione inferiore sia priva di bolle d'aria. Aprire la valvola di perfusione inferiore per assicurarsi che la retina sia rifornita di ossigeno e sostanze nutritive.Successivamente, accendere la fotocamera ad alta velocità collegata al microscopio ottico invertito e aprire il software di imaging. Una volta confermato che la perfusione inferiore sta scorrendo, aumentare lentamente l'aspirazione inferiore ruotando manualmente la manopola della pressione del vuoto sul kit di scarico sottovuoto mentre si osserva la retina attraverso il microscopio invertito. Una volta osservata una forza di aspirazione che agisce sulla retina, smettere di aumentare l'aspirazione.Dopo esserti assicurato che la retina sia stata tenuta in posizione dall'aspirazione inferiore, rimuovi il peso dalla retina usando una pinza e rimuovi delicatamente la rete di nylon staccando con cura un angolo dalla retina. Mantenere la perfusione in funzione per circa 30 minuti per consentire alla retina di stabilizzarsi dal trauma chirurgico. In questa fase, inserire con cautela una micropipetta pre-estratta di 10 micrometri di diametro in un portapipette standard contenente un elettrodo a filo di cloruro d'argento-argento di 50 micrometri di diametro.Se invece si utilizza un dispositivo microfluidico multiporta, inserire l'asta in acciaio inossidabile collegata al dispositivo in un portapipette standard senza elettrodo a filo. Se si utilizza una micropipetta in vetro, interfacciare il supporto della pipetta con un testatavola patch clamp e collegare la connessione inferiore della porta di pressione del supporto della pipetta al canale di uno dei sistemi di iniezione a pressione. Oppure, se si utilizza il dispositivo multiporta, collegare le connessioni luer della porta di pressione di ciascuna delle otto porte di iniezione, con il canale da uno a otto del sistema di iniezione a pressione.Quindi, accendere manualmente il sistema di iniezione a pressione e accendere il canale uno. Assicurarsi che il sistema sia ventilato nell'atmosfera e impostare la pressione di iniezione su 0.1 libbre per pollice quadrato. Successivamente, accendere il micromanipolatore e calibrarlo premendo il pulsante di calibrazione sul controller del manipolatore.Posizionare il micromanipolatore in modo che la punta della micropipetta si trovi a circa 30 millimetri sopra l'amplificatore MEA. Quindi, riempi una piccola capsula di Petri con una soluzione di glutammato e posizionala sotto il micromanipolatore. Immergere la punta della micropipetta nella soluzione e riempire la micropipetta di vetro o il tubo del dispositivo multiporta con circa 20 millimetri di soluzione.Successivamente, sollevare la punta della micropipetta, o il dispositivo, dalla soluzione. Rimuovere la piastra di Petri e posizionare il micromanipolatore sopra la camera PMEA. Utilizzando uno stereomicroscopio montato su un supporto a braccio, allineare la punta della micropipetta o gli angoli del dispositivo con un segno di riferimento inciso nell'anello della camera PMEA.Quindi, memorizzare le posizioni del manipolatore nella superficie di controllo utilizzando i pulsanti di memorizzazione del riferimento A e del riferimento di memorizzazione B per mappare il sistema di coordinate del manipolatore degli elettrodi PMEA. Successivamente, utilizzare il software di controllo del manipolatore. Selezionare un elettrodo PMEA target con una robusta attività spontanea e fare clic sul pulsante Sposta al canale per allineare la micropipetta di vetro con l'elettrodo target.Se si utilizza il dispositivo multiporta, allineare le microporte del dispositivo con gli elettrodi PMEA target con una robusta attività spontanea utilizzando lo stesso processo. Se è disponibile la misurazione dell'impedenza, attivare l'amplificatore patch clamp e avviare il software di visualizzazione dell'impedenza facendo clic sul pulsante di avvio per visualizzare l'impedenza dell'elettrodo di cloruro argento-argento all'interno del supporto della pipetta. Mentre si osservano i segnali di impedenza in tempo reale, abbassare lentamente la micropipetta, o il dispositivo, fino a quando non tocca la superficie retinica come indicato da un rapido aumento del segnale di impedenza.Per la stimolazione sotterranea, abbassare ulteriormente la pipetta di 40 micrometri per le retine S334 tera tre o di 70 micrometri per le retine wild-type. Eseguire alcune iniezioni di breve durata utilizzando il sistema di iniezione a pressione. Per determinare se le cellule vicino alla punta della micropipetta, o le microporte del dispositivo, sono ricettive alla stimolazione del glutammato osservando i neurosegnali.Ora, orienta il LED verde verso la superficie superiore della retina. Iniziare la registrazione utilizzando il software di acquisizione dati digitando il nome del file e facendo clic sul pulsante di registrazione. Una volta avviata la registrazione, aprire il programma di controllo dello stimolo e caricare il file di stimolo predefinito facendo clic sul pulsante Leggi file di stimolo.Quindi, fai clic sul pulsante Esegui file di stimolo per avviare il file di stimolo predefinito. Dopo che il file di stimolo è stato completato, interrompere la registrazione per salvare il file per l'ordinamento dei picchi e l'analisi dei dati futuri. Di seguito sono riportate le registrazioni rappresentative di nove elettrodi PMEA, che mostrano i dati dell'elettrodo filtrato passa-alto durante la stimolazione visiva con luce con un LED verde, dove ogni rettangolo mostra i dati neurali di un elettrodo unico.Ogni registrazione dell'elettrodo illustra i dati raccolti nel primo secondo dopo l'accensione del LED verde. I picchi sono stati identificati utilizzando una tensione di soglia di 18 microvolt negativa. La stimolazione visiva ha causato una raffica di picchi in tutti gli elettrodi tranne quello centrale in alto, che possedeva una risposta inibitoria alla luce.Un grafico simile per gli stessi elettrodi, che mostra l'attività neurale spontanea senza stimolazione visiva o iniettiva. Sebbene fossero presenti esplosioni più piccole, i modelli di picchi erano molto diversi da quelli registrati in risposta alla stimolazione visiva. Ecco le registrazioni rappresentative dello stesso sottoinsieme di elettrodi registrate immediatamente dopo un'iniezione di glutammato all'elettrodo centrale.Il glutammato iniettato ha suscitato una raffica di picchi nell'elettrodo centrale che era molto simile alle esplosioni di picchi evocate visivamente. Tutti gli altri elettrodi non sono stati influenzati dall'iniezione di glutammato, il che dimostra la fine risoluzione spaziale della tecnica di stimolazione chimica. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro-sei ore se eseguita correttamente.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di monitorare la perfusione per garantire che la retina sia continuamente rifornita di ossigeno e sostanze nutritive durante l'intero esperimento. Questa tecnica potrebbe aprire la strada ai ricercatori nel campo della visione artificiale e dello sviluppo di protesi visive per esplorare la neuromodulazione su base chimica per il trattamento della cecità da malattie degenerative dei fotorecettori. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come realizzare la neuromodulazione dei neuroni retinici utilizzando i neurotrasmettitori.

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Metodologia per la neuromodulazione Biomimetic chimico di retine del ratto con il neurotrasmettitore glutammato In Vitro

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