Name: Approccio del canale semicircolare posteriore per consegna del Gene dellorecchio interno in Mouse neonatale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 52 s
Description: Scopri l'approccio del canale semicircolare posteriore per la consegna di geni nell'orecchio interno di topi neonati. Questa tecnica chirurgica affidabile permette di perfondere l'intero orecchio interno in circa dieci minuti con pratica.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal NIDCD divisione di intramurale ricerca /NIH (DC000082-02 al W.W.C.), così come DC000081 al nucleo di imaging avanzata. Siamo grati per il personale della struttura animale NIDCD per la cura per i nostri animali.

Tutte le procedure di animali sono state approvate dal comitato di utilizzo presso il National Institute on Deafness and Other Communication Disorders (NIDCD ASP1378-15) e cura degli animali.
1. procedura installazione e preparazione
<ol><li>Sterilizzare tutti gli strumenti di ossido di etilene all'inizio dell'esperimento. Tra gli animali, pulire gli strumenti utilizzando la sterilizzazione della perla.</li>
	<li>Caricare la soluzione contenente la terapia genica virale in una micropipetta su micro-iniettore. Il vettore virale utilizzato in questo studio è stato AAV2/8-whirlin (1 x 1013 genoma copie per millilitro, vedere la tabella dei materiali). Nota: In genere, il volume totale di 1,1 µ l viene caricato nella micropipetta.</li>
</ol>2. anestesia
Nota: Il ceppo del mouse utilizzato in questo studio è il mouse whirler. Entrambi omozigoti mutanti (Whrnwi/wi) e littermates eterozigoti (Whrn+ wi) sono stati usati.
<ol><li>Posto la madre in una gabbia separata (separata dalla lettiera).</li>
	<li>Posto dalla gabbia contenente la lettiera (P0 - P5 cuccioli) su un pad termico a ricircolo (insieme a 37,5 ° C) per mantenere caldi i topi.</li>
	<li>Tagliare la parte di pollice di un guanto di lattice e inserire un cucciolo in esso.</li>
	<li>Collocare il cucciolo nel guanto di lattice pollice in un secchio di ghiaccio per ~ 2 min.</li>
	<li>Posizionare il pup anestetizzato su una confezione di grande gelata di plastica quadrato commerciale con una garza 4 "x 4" tra il cucciolo e superficie del pack.</li>
	<li>Riempire un guanto di lattice per impieghi gravosi con ghiaccio tritato e il guanto di ghiaccio intorno il pup.</li>
	<li>Controllare per vedere se il cucciolo è adeguatamente anestetizzato dalla completa mancanza di qualsiasi risposta a vari stimoli (tra cui un pizzico di punta costante). Lasciare il cucciolo sull'impacco di ghiaccio per tutta la durata dell'intervento chirurgico (circa 5-10 min). Nota: Si consiglia di lasciare i cuccioli sull'impacco di ghiaccio per non più di 15 min durante l'intervento chirurgico.</li>
</ol>3. chirurgico approccio (Figura 1)
<ol><li>Una volta che l'animale è anestetizzato, pulire la pelle dietro l'orecchio con un batuffolo imbevuto di iodio e un batuffolo imbevuto di alcool.</li>
	<li>Fare un'incisione postauricular ~ 2 mm dietro l'orecchio utilizzando micro-forbici e dividere il muscolo sternocleidomastoid con micro-forbici.</li>
	<li>Identificare il nervo facciale e la bulla. La bulla è cartilaginoso e semi-trasparente a questa età e si trova mediale al nervo facciale. L'arteria stapediali può essere visto attraverso la bulla a questa età, che è un utile punto di riferimento.</li>
	<li>Seguire il nervo facciale superiormente e posteriormente per individuare il canale semicircolare posteriore (PSCC). Rimuovere le fibre muscolari e del tessuto molle che ricopre il canale semicircolare posteriore utilizzando micro-forbici. Nota: Il PSCC è cartilaginoso a questa età.</li>
	<li>Penetrare il PSCC utilizzando una micropipetta di vetro (~ 10 μm di diametro) su micro-iniettore.</li>
	<li>Iniettare la terapia genica virale nell'orecchio interno. Nota: In genere, un totale di 20 iniezioni di 49 nL della terapia genica sono consegnati nel canale semicircolare posteriore oltre 40 ~ s (volume totale ~ 1 µ l). Il titolo virale utilizzato era 1 x 1013 genoma copie / mL.</li>
	<li>Chiudere l'incisione della pelle utilizzando una sutura in polyglactin 5-0.</li>
</ol>4. postoperatoria
<ol><li>Posto il cucciolo su un tappetino riscaldante per ripristinare una normale temperatura corporea durante il recupero dall'anestesia con costante manuale stimolazione/rolling con le dita guantate umane.</li>
	<li>Una volta che il cucciolo è sveglio, posizionarlo nella sua gabbia a casa.</li>
	<li>Accarezzano ogni cucciolo con un tampone di cotone che è stato esposto per la biancheria da letto di gabbia a casa. Nota: Lo scopo di questo è di avere i topi odore come hanno fatto prima dell'intervento, che aumenta la probabilità della madre ri-accettando la sua post-chirurgia cucciolata. Se possibile, urina dalla madre possa essere raccolti e strofinato sui cuccioli con un batuffolo di cotone per ridurre ulteriormente il rischio di rigetto.</li>
	<li>Applicare olio minerale al naso della madre per desensibilizzare la sua8e reintrodurre la madre dalla gabbia.</li>
</ol>

<ol><li>Chien, W. W., Monzack, E. L., McDougald, D. S., Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+sensorineural+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Ear+Hear%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for sensorineural hearing loss.</a> Ear Hear. 36, 1-7 (2015).</li>
<li>Askew, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tmc+gene+therapy+restores+auditory+function+in+deaf+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Tmc gene therapy restores auditory function in deaf mice.</a> Sci Transl Med. 7, 295(2015).</li>
<li>Akil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+hearing+in+the+VGLUT3+knockout+mouse+using+virally+mediated+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy.</a> Neuron. 75, 283-293 (2012).</li>
<li>Pan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+restores+auditory+and+vestibular+function+in+a+mouse+model+of+Usher+syndrome+type+1c%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Gene therapy restores auditory and vestibular function in a mouse model of Usher syndrome type 1c.</a> Nat Biotechnol. 35, 264-272 (2017).</li>
<li>Isgrig, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+Restores+Balance+and+Auditory+Functions+in+a+Mouse+Model+of+Usher+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy Restores Balance and Auditory Functions in a Mouse Model of Usher Syndrome.</a> Mol Ther. 25, 780-791 (2017).</li>
<li>Lentz, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+hearing+and+vestibular+function+by+antisense+oligonucleotides+in+a+mouse+model+of+human+deafness%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness.</a> Nat Med. 19, 345-350 (2013).</li>
<li>Shibata, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+Prevents+Autosomal-Dominant+Hearing+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA Interference Prevents Autosomal-Dominant Hearing Loss.</a> Am J Hum Genet. 98, 1101-1113 (2016).</li>
<li>Van Sluyters, R. C., Obernier, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+care+and+use+of+mammals+in+neuroscience+and+behavioral+research%5BTitle%5D)+AND+%22Contemp+Top+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the care and use of mammals in neuroscience and behavioral research.</a> Contemp Top Lab Anim. 43, 48(2004).</li>
<li>Chien, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+Restores+Hair+Cell+Stereocilia+Morphology+in+Inner+Ears+of+Deaf+Whirler+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy Restores Hair Cell Stereocilia Morphology in Inner Ears of Deaf Whirler Mice.</a> Mol Ther. 24, 17-25 (2016).</li>
<li>Hirose, K., Hartsock, J. J., Johnson, S., Santi, P., Salt, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+lipopolysaccharide+compromises+the+blood-labyrinth+barrier+and+increases+entry+of+serum+fluorescein+into+the+perilymph%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Systemic lipopolysaccharide compromises the blood-labyrinth barrier and increases entry of serum fluorescein into the perilymph.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 15, 707-719 (2014).</li>
<li>Okada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+targeting+mouse+vestibule+using+adenovirus+and+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adeno-associated virus vectors.</a> Otol Neurotol. 33, 655-659 (2012).</li>
<li>Suzuki, J., Hashimoto, K., Xiao, R., Vandenberghe, L. H., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+gene+therapy+with+ancestral+AAV+in+adult+mice%3A+complete+transduction+of+inner+hair+cells+without+cochlear+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction.</a> Sci Rep. 7, 45524(2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nessun pertinenti informazioni integrative per fare.

Diversi approcci chirurgici sono stati descritti per accedere roditore orecchi interni. Cochleostomy e finestra rotonda approcci sono più comunemente utilizzati per accedere alla coclea, mentre il canale semicircolare posteriore e il sacco endolinfatico approcci vengono in genere utilizzati per accedere gli organi vestibolari1. In uno studio recente, abbiamo mostrato quel canale semicircolare posteriore iniezioni di terapia genica virale ha provocate ad alta efficienza di trasduzione delle cellule...

Terapia genica dell'orecchio interno è un settore in rapida evoluzione dell'indagine. È stato applicato in vari modelli animali di combattimento ototossicità, il trauma di rumore e di perdita dell'udito ereditario1. Parecchi studi recenti hanno dimostrato il recupero funzionale dell'udito e funzioni della bilancia in topi mutanti dopo orecchio interno gene terapia consegna2,3,4,5,6, 7. uno dei principali fattori nel determinare il successo della terapia genica dell'orecchio interno è il metodo chirurgico utilizzato per accedere l'orecchio interno. Idealmente, l'approccio chirurgico sarebbe facile da eseguire, i limiti anatomici sarebbe coerente e facile da identificare, e la trasduzione risultante di tipi cellulari mirata sarebbe elevata.
In un recente studio, abbiamo dimostrato che quando la terapia genica virale è stata iniettata attraverso il canale semicircolare posteriore del mouse mutante whirler (un modello di perdita dell'udito e disfunzione vestibolare), trasduzione efficiente di cellule ciliate sensoriali è stato visto nella vestibolare organi, così come la coclea5. L'alta efficienza di trasduzione sensoriale della cellula ciliata ha provocato il miglioramento delle funzioni uditive e vestibolari in questi topi mutanti.
In questo articolo, descriviamo in dettaglio l'approccio del canale semicircolare posteriore per accedere l'orecchio interno neonatale del mouse.

<table><tbody><tr><td>Microscopio operatorio</td><td>Zeiss</td><td></td><td>OPMI Pico ORL. Funzionerebbero anche altri microscopi di dissezione.</td></tr><tr><td>Micro-forcettori Strumenti per le</td><td>scienze</td><td>11251-10, 11295-51#</td><td>5 e #55</td></tr><tr><td>Dumont Microforbici</td><td>Strumenti per le scienze fini</td><td>15002-08</td><td></td></tr><tr><td>Microiniettore Nanoliter2000</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cuscinetto riscaldante</td><td>Mastex</td><td>Modello 500/600</td><td></td></tr><tr><td>5-0 suture in vicryl</td><td>Ethicon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV8-vortice</td><td>Vector Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetta in vetro</td><td>Sutter Instruments</td><td>B100-75-10</td><td>Vetro borosilicato</td></tr></tbody></table>

approccio del canale semicircolare posteriore per consegna del gene dell'orecchio interno in mouse neonatale

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

Terapia genica dell'orecchio interno offre grande promessa come un potenziale trattamento per la perdita dell'udito e vertigini. Uno dei fattori critici del successo della terapia genica dell'orecchio interno è quello di trovare un metodo di consegna che si traduce in efficienza di trasduzione coerente di tipi cellulari mirate, riducendo al minimo la perdita dell'udito. In questo studio, descriviamo l'approccio del canale semicircolare posteriore come un metodo praticabile per la consegna del gene dell'orecchio interno in topi neonatali. Indichiamo che consegna del gene attraverso il canale semicircolare posteriore è in grado di irrorare l'intero orecchio interno. La facile individuazione anatomica del canale semicircolare posteriore, così come manipolazione minima dell'osso temporale richiesto, rendono questo chirurgico approccio un'opzione attraente per consegna del gene dell'orecchio interno.

Iniezione di AAV8-whirlin terapia genica nei topi whirler neonatale attraverso il canale semicircolare posteriore ha provocato whirlin espressione (verde) in cellule ciliate utricular (Figura 2), con l'efficienza di infezione generale di 53,1% (SD 38,1, n = 28)5 . Cellule trasdotte capelli aveva allungato stereocilia (rosso) rispetto alle cellule ciliate dalle orecchie non iniettato controlaterale (5,35 µm ± 2.11 vs 3.20 ± 0.34 µm, ris...

In questo studio, descriviamo l'approccio del canale semicircolare posteriore come un metodo affidabile per la consegna del gene dell'orecchio interno in topi neonatali. Indichiamo che consegna del gene attraverso il canale semicircolare posteriore è in grado di irrorare l'intero orecchio interno.

Approccio del canale semicircolare posteriore per consegna del Gene dell'orecchio interno in Mouse neonatale

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di accedere all'orecchio interno del topo per la consegna del gene. Questo metodo può aiutare a somministrare la terapia genica all'orecchio interno del topo in modo efficiente. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è affidabile e facile da imparare.Generalmente le persone nuove a questo metodo avranno difficoltà a causa delle piccole dimensioni dell'orecchio interno del topo. Tuttavia, con la pratica, la maggior parte delle persone può completare una dissezione chirurgica entro dieci minuti. Iniziare la procedura con strumenti sterili e accendere lo sterilizzatore a microsfere per pulire gli strumenti tra gli animali.Caricare il virus terapeutico in una micropipetta di dieci micron di diametro collegata a un microiniettore. Il vettore virale utilizzato nei nostri esperimenti è AAV28-whirlin con un titolo di una volta dieci per 13 copie del genoma per millilitro. Per questo video, è stato utilizzato il colorante blu di metilene per facilitare la visualizzazione.Pulisci la pelle dietro l'orecchio con tre scrub betadine seguiti da una salvietta imbevuta di alcol. Quindi, usa le micro forbici per fare un postauricolare a circa due millimetri dietro l'orecchio e dividere i tessuti molli sottostanti. Identificare il nervo facciale e la bolla.Il muscolo sternocleidomastoideo si trova perpendicolarmente al nervo facciale. L'arteria stapediale può essere vista attraverso la bulla, che è un utile punto di riferimento. Seguire il nervo facciale superiormente e posteriormente per individuare il canale semicircolare posteriore.Utilizzare le micro forbici per rimuovere le fibre muscolari e i tessuti molli sovrastanti il canale semicircolare posteriore. Quindi, penetrare nel canale semicircolare posteriore con la micropipetta di vetro caricata sul microiniettore e iniettare il colorante nell'orecchio interno. In genere, un totale di 20 iniezioni da 49 nano litri vengono erogate nel canale semicircolare posteriore in 40 secondi per un volume totale di circa un microlitro.Estrarre la pipetta immediatamente dopo aver somministrato l'ultimo volume. Quindi, chiudere l'incisione cutanea utilizzando una sutura in poliglactina 5-0. L'iniezione di AAV8-whirlin in topi whirler neonatali, come mostrato in questo video, ha provocato l'espressione di whirlin mostrata in verde nelle cellule ciliate utricolari.Le cellule ciliate trasdotte presentavano stereociglia allungate mostrate in rosso rispetto alle cellule ciliate provenienti da orecchie controlaterali, non iniettate. L'iniezione posteriore del canale semicircolare di AAV8-whirlin ha anche provocato la trasduzione delle cellule ciliate cocleari nei topi whirler. Le cellule ciliate trasdotte esprimevano vortice alle punte delle stereociglia e avevano stereociglia allungate rispetto alle cellule ciliate delle orecchie controlaterali, non iniettate.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'ABI e il test stereo per rispondere a domande aggiuntive come se la consegna genica dell'orecchio interno abbia un effetto sulle funzioni uditive e vestibolari. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della consegna genica dell'orecchio interno per esplorare i difetti della consegna genica nell'orecchio interno del topo.

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L'orecchio interno è un topo placode derivato il cui organo sensoriale per lo sviluppo del programma è elaborato durante la gestazione. Definiamo...

Gene Transfer per l&#39;orecchio del mouse Sviluppo Inner<em&gt; In Vivo</em&gt; Elettroporazione

Fonte: Kozin, E. D., et.al. Visualizzazione diretta del nucleo cocleare dorsale murino per la stimolazione optogenetica della via uditiva. J. Vis. Exp. (2015)Questo video mostra il trasferimento genico mediato da virus nel nucleo cocleare dorsale del topo (DCN) per consentire la stimolazione uditiva indotta dalla luce. Un vettore virale che codifica per l'opsina, un canale ionico sensibile alla luce, viene iniettato nel DCN dopo una craniotomia e un'aspirazione cerebellare per l'accesso diretto.

Trasferimento genico mediato da virus nel nucleo cocleare dorsale del topo per la stimolazione uditiva indotta dalla luce

Questo video mostra la canalostomia, una procedura che consente la somministrazione locale di farmaci nell'orecchio interno di un topo attraverso il canale semicircolare con danni minimi all'udito e alla funzione vestibolare. Questo metodo consente l'inoculazione di vettori virali, prodotti farmaceutici e piccole molecole nell'orecchio interno del topo.

Canalostomia per la somministrazione locale di farmaci nell'orecchio interno di un topo adulto

Fonte: Akil, O., et al., Metodo chirurgico per la consegna genica mediata da virus all'orecchio interno del topo attraverso la membrana della finestra rotonda. J. Vis. Exp. (2015)Questo video mostra la procedura di somministrazione di un gene terapeutico nell'orecchio interno di un cucciolo di topo con perdita dell'udito indotta geneticamente. Utilizzando un vettore virale adeno-associato (AAV), il gene viene iniettato attraverso la membrana rotonda della finestra, consentendo alle particelle...

Terapia genica basata su vettori virali per il ripristino dell'udito in un modello murino

L'approccio chirurgico post-auricolare descritto consente una somministrazione rapida e diretta nel timpano della scala cocleare del topo, riducendo al minimo la perdita di sangue e la mortalità animale. Questo metodo può essere utilizzato per la terapia cocleare utilizzando la somministrazione molecolare, farmacologica e virale a topi postnatali attraverso la membrana rotonda della finestra.

Metodo chirurgico per Virally Mediated Gene consegna all&#39;orecchio mouse interno attraverso la finestra rotonda a membrana

Presentiamo un metodo che descrive l'isolamento e la coltura di espianti cocleari dall'orecchio interno di topo embrionale.  Dimostriamo anche un metodo per il trasferimento genico in espianti cocleari tramite elettroporazione a onda quadra. La coltura di espianti in vitro abbinata alla tecnica di trasferimento genico consente ai ricercatori di studiare gli effetti dell'alterazione dell'espressione genica durante lo sviluppo.

Cultura della embrionali di topo cocleari espianti e Gene Transfer con elettroporazione

Due approcci microchirurgici per la somministrazione locale di farmaci all'orecchio interno sono descritti e confrontati in termini di impatto sui parametri uditivi, citoarchitettura cocleare ed espressione di marcatori infiammatori.

Uno studio comparato Drug metodi di consegna mirate per l'orecchio interno mouse: Bullostomy Versus Iniezione transtimpanica

L'obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare la preparazione, la cultura, il trattamento e l'immunostaining di esplosivi cochleari murine neonatali. La tecnica può essere utilizzata come uno strumento di screening in vitro nella ricerca uditiva.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique come un<em&gt; In vitro</em&gt; Strumento di screening nella ricerca acustica

Segnaliamo un metodo chirurgico per amministrare le droghe all'interno dell'orecchio di un primate non umano, il comune uistitì (Callithrix jacchus), tramite la membrana della finestra rotonda.

Una procedura chirurgica per l'amministrazione delle droghe all'interno dell'orecchio in un Non umano primati comune uistitì (Callithrix jacchus)

Qui descriviamo la procedura canalostomy che permette la consegna di droga locale nelle orecchie interno dei topi adulti e neonati attraverso il canale semicircolare con minimo danno alla funzione uditiva e vestibolare. Questo metodo può essere utilizzato per inoculare vettori virali, prodotti farmaceutici e le piccole molecole nell'orecchio interno del mouse.

Canalostomy come un approccio chirurgico alla consegna di droga locale nelle orecchie interno dei topi adulti e neonati

Scopri l'approccio del canale semicircolare posteriore per la consegna di geni nell'orecchio interno di topi neonati. Questa tecnica chirurgica affidabile permette di perfondere l'intero orecchio interno in circa dieci minuti con pratica.

Approccio del canale semicircolare posteriore per consegna del Gene dell'orecchio interno in Mouse neonatale

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