Pre-condizionamento delle vie aeree dei topi con bleomicina aumenta l'efficienza di Orthotopic del polmone cancro Engraftment delle cellule

L'obiettivo generale di questa procedura è aumentare l'efficienza del trapianto di cellule tumorali del cancro del polmone nelle vie aeree dei topi. Questo metodo può aiutare a stabilire nuovi modelli preclinici al fine di rispondere a domande chiave nella biologia del cancro, comprese le cause della resistenza ai farmaci e la relazione tra fibrosi e cancro del polmone. Il vantaggio principale di questa tecnica è che aumenta l'efficienza del trapianto di cellule che iniziano il tumore nei polmoni di una varietà di ceppi di topi.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia, perché ci consente di modellare una maggiore varietà di sottotipi di cancro del polmone umano, noti per avere diverse risposte cliniche al trattamento. Per questo protocollo, i topi devono prima essere iniettati con bleomicina. Quindi, dopo 14 giorni, le cellule tumorali vengono iniettate.

La procedura per entrambe le iniezioni è molto simile e descritta qui. Due ore prima dell'iniezione, scongelare il brodo di bleomicina con ghiaccio e diluirlo alla concentrazione di lavoro. Tienilo in ghiaccio.

Per un bolo cellulare, preparare una sospensione cellulare come descritto nel protocollo di testo. Il tempo di procedura per ogni mouse è di circa 10 minuti in tutto. Assicurati di confermare la corretta anestesia usando un pizzico per le dita dei piedi e applica un unguento veterinario sugli occhi.

A questo punto, se il topo ha i peli scuri, radere l'intera area delle costole sia ventralmente che dorsalmente in modo che possa essere visualizzata correttamente. Quindi, posiziona il mouse sulla piattaforma di intubazione fissandolo per i denti anteriori con la parte posteriore contro la piattaforma. Se deve essere iniettato un bolo cellulare, risospenderlo ora con una leggera triturazione.

Ora illumina la regione superiore del torace, apri la bocca ed estrai delicatamente la lingua usando una pinza piatta. Preparare un catetere IV per la trachea rimuovendo l'ago, quindi posizionarlo sopra l'apertura tracheale. Quindi, inserire il catetere nella trachea fino a quando la parte superiore del catetere non si trova vicino ai denti anteriori e illuminare l'interno del catetere per confermarne il posizionamento.

Quindi, erogare i 50 microlitri di bleomicina appena preparata, o sospensione cellulare, direttamente nel catetere. Attendere alcuni secondi affinché l'intero volume scorra lungo il catetere. Quindi, rimuovere il catetere e smaltirlo in candeggina al 10%.

Se il mouse non inala il liquido, monitorare attentamente la sua respirazione e regolare la posizione del catetere. Se il topo smette di respirare, rimuovere immediatamente il catetere e lasciare che il topo respiri prima di reinserire il catetere. Dopo aver rimosso il catetere, continuare a eseguire la procedura per avere cinque topi trattati, ancora anestetizzati e pronti per l'immagine.

Per il recupero, posizionare il mouse supino su un termoforo approvato IACUC in una gabbia di recupero e monitorarlo fino a quando non si è completamente ripreso. Due o tre minuti dopo l'iniezione delle cellule, iniettare 100 microlitri di luciferina per via retro-orbitale, utilizzando un ago da insulina. Alternare l'occhio utilizzato per l'iniezione ad ogni sessione di imaging.

Dopo aver atteso almeno due minuti, posizionare fino a cinque topi in un imager a bioluminescenza animale, in posizione di decubito sternale e acquisire un'immagine dorsale utilizzando le impostazioni di luminescenza. Sotto il pannello di controllo, regolare le impostazioni di risoluzione e sensibilità, per misurare la luminescenza delle celle. Per la maggior parte delle applicazioni, iniziare con tre minuti, impostare il binning su medio, impostare f/stop su uno, impostare il campo visivo su d e impostare l'altezza del soggetto su 1,5.

Se l'iniezione ha avuto successo, viene rilevato un segnale nella parte superiore del torace in un polmone o in entrambi i polmoni. Se le cellule sono raggruppate all'ingresso della trachea, l'iniezione non ha avuto successo. Dopo aver scattato l'immagine dorsale, capovolgere i topi e acquisire un'immagine ventrale e regolare l'impostazione secondo necessità.

Dopo l'imaging, procedere con l'assistenza postoperatoria come descritto nel protocollo di testo. Quindi, ripetere questo protocollo di imaging tre giorni dopo l'attecchimento e successivamente settimanalmente. Per analizzare le immagini, utilizzare un software di analisi della bioluminescenza.

Innanzitutto, carica tutte le immagini appropriate della serie. Questa sezione è descritta in dettaglio in un pacchetto software. Successivamente, per ogni topo, nella prima immagine della serie, crea una regione quadrata di interesse e posizionala sopra l'area superiore del torace coprendo l'intera regione polmonare.

Quindi, facendo clic con il pulsante destro del mouse, accedi alla funzione copia tutte le regioni di interesse e utilizza questo strumento per applicare le stesse regioni di interesse a ciascuna immagine del gruppo. Quindi, all'interno di ogni immagine, modifica le posizioni dei quadrati per coprire la parte superiore del torace di ciascun mouse. Fallo sia per la vista ventrale che per quella dorsale.

Ora, nell'angolo in alto a sinistra della finestra dell'immagine, seleziona la funzione fotoni. Quindi selezionare l'opzione di misurazione. I dati delle regioni di interesse vengono quindi visualizzati in una tabella di output come flusso totale.

Analizzare questi dati in base alle esigenze. Quando il sistema immunitario era compromesso, i topi atimici sono stati trattati con bleomicina. Prima dell'attecchimento in bolo cellulare, la fibrosi transitoria è stata osservata entro il giorno 14 nei topi trattati con bleomicina, ma non nei topi trattati con veicolo.

Successivamente, le cellule della linea cellulare di cancro al polmone umano stabilita, H2030, sono state consegnate per via intratracheale nei polmoni di questi topi. Dopo 35 giorni, i topi trattati con bleomicina avevano un elevato carico di tumore polmonare. Tuttavia, negli animali trattati con veicolo, non sono stati rilevati tumori.

Il carico del tumore polmonare è stato confermato mediante istologia. I polmoni pretrattati con veicolo non avevano evidenza di noduli tumorali, mentre i polmoni pretrattati con bleomicina presentavano noduli tumorali di grandi dimensioni. Dopo il trapianto di una linea cellulare metastatica H2030 BrM 3, da 39 a 57 giorni, la bioluminescenza era troppo intensa per l'imaging, quindi le metastasi sono state analizzate in organi distanti ex vivo.

Piccole lesioni potrebbero essere rilevate in vari tessuti, suggerendo che questo metodo è promettente, per studiare la malattia spontaneamente disseminata. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 10 minuti per gabbia di cinque topi senza imaging e 20 minuti per gabbia quando si esegue anche l'imaging dei topi. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di garantire il corretto inserimento del catetere e di monitorare la respirazione dell'animale.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come studi farmacologici o chimica aminoacetica del tessuto raccolto per rispondere a ulteriori domande, come il modo in cui i tumori trapiantati rispondono ai farmaci o la caratterizzazione delle interazioni stromali tumorali specifiche per i polmoni. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica può essere applicata a diversi ceppi murini e modelli tumorali, compresi xenotrapianti derivati da pazienti in un contesto fisiologicamente rilevante. Non dimenticare che lavorare con la bleomicina può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come la manipolazione in una cappa a rischio biologico e il corretto smaltimento.