Che istituisce un modello murino di una neuropatia pura piccola fibra con l'agonista Ultrapotent di Transient Receptor potenziali vanilloidi tipo 1

L'obiettivo generale di questa procedura di somministrazione di neurotossine specifica per i topi è stabilire un modello di neuropatia sensoriale su piccoli animali. Questa tecnica aiuta a esporre le leggi delle lesioni piccole fibre sensoriali nella neuropatia sensoriale. Il suo principale vantaggio è che è facile e veloce.

Questi topi possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo neuropatico sensoriale, come ad esempio quale percorso è un contributo cruciale per le grandi fibre sensoriali. Per iniziare, indossare i dispositivi di protezione individuale e prendere le dovute precauzioni durante la preparazione della soluzione madre di resiniferatossina, o RTX. Diluire un'aliquota di 600 microlitri in soluzione salina per l'esperimento e dividere il resto in aliquote da 12 microlitri per la conservazione.

Per i topi di prova, utilizzare topi ICR maschi adulti di otto settimane, di peso compreso tra 35 e 40 grammi. Somministrare una singola dose di soluzione RTX per via intraperitoneale con una siringa per microiniezione. Successivamente, iniettare un secondo gruppo di topi con un volume uguale di veicolo che funga da controllo.

Dopo aver fatto tutte le iniezioni, ospita i topi nelle loro gabbie domestiche e assicurati che abbiano accesso a cibo e acqua. Dopo sette giorni, inizia a condurre test comportamentali una volta alla settimana. Esegui entrambi i test lo stesso giorno in una sala prove silenziosa, con un ambiente stabile.

Inizia con la misurazione delle latenze termiche degli animali con il test della piastra calda. Impostare una piastra riscaldante in metallo a 52 gradi Celsius. Quindi, posiziona delicatamente un animale in una gabbia di plexiglass trasparente sulla piastra riscaldante.

Avvia un timer non appena le zampe posteriori dell'animale toccano la gabbia calda. Se l'animale inizia a tremare, a leccarsi le zampe posteriori o a saltare, rimuovilo e registra per quanto tempo ha resistito alla piastra riscaldante con l'approssimazione di un decimo di secondo. Se l'animale non mostra alcuna risposta sulla piastra, interrompere la sessione dopo 25 secondi per evitare potenziali danni ai tessuti.

Esegui tre prove per animale, con un tempo di riposo di 30 minuti tra le prove. Successivamente, utilizza il tempo medio delle tre prove come punteggio finale dell'animale. Quindi, misura la soglia di sensibilità meccanica dell'animale.

Metti l'animale in una gabbia rotonda trasparente, con una rete metallica per pavimento. Dopo l'acclimatazione, applicare i diversi calibri dei filamenti di peli di von Frey sulla regione plantare della zampa posteriore, utilizzando il metodo su e giù. Per la prima stimolazione, applicare un filamento a forza media per 5-8 secondi.

Dopo ogni stimolazione, attendere due minuti, quindi applicare la forza successiva in base alla risposta precedente dell'animale. Se la zampa posteriore si è ritirata, usa il filamento di calibro inferiore successivo. E se la zampa posteriore non si è ritirata, usa il filamento più grande successivo.

Continua questo processo fino a quando il mouse non è stato colpito sei volte. Quindi, calcola la soglia meccanica utilizzando una formula stabilita. In ogni giorno di test, esegui tre prove su ciascuna zampa posteriore.

Esprimi la media di queste sei soglie meccaniche come la soglia meccanica media di ciascun animale. Per l'eutanasia, utilizzare isoflurano al 5%, seguito da una perfusione intracardiaca. Quindi, rimuovere i primi cuscinetti dei piedi delle due zampe posteriori e fissarli in PFA al 4% per sei ore.

Dopo la fissazione, trasferirli in tampone fosfato molare 0,1 a 4 gradi Celsius. Questo serve come soluzione di archiviazione a lungo termine. Prima della criosezione, immergere i cuscinetti dei piedi nel 30% di saccarosio in PBS durante la notte.

Il giorno successivo, utilizzare un criostato per creare fette di tessuto da 30 micron tagliando verticalmente la superficie plantare. Etichettare le sezioni del poggiapiedi in sequenza e poi conservarle in una soluzione anti-feeze a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius. Quando si campionano le sezioni, selezionare una sezione su tre e trasferirla su un vetrino rivestito per farla asciugare all'aria.

Quindi, coprire ogni lato con una piastra di copertura e lavorarli con una procedura standard di immunocolorazione. Per prima cosa, spegnere le sezioni del cuscinetto del piede con perossido di idrogeno all'1% in metanolo per 30 minuti. Quindi, lavare i fazzoletti tre volte utilizzando un tampone Tris 0,5 Molar a temperatura ambiente.

Quindi, incubare i tessuti in soluzione a blocchi per un'ora. Quindi, incubare le sezioni con un anti-siero contro il marcatore pan-assonale durante la notte a 4 gradi Celsius. Il giorno successivo, lavare le sezioni con Tris buffer tre volte e quindi incubare le sezioni in IgG biotinilate anti-coniglio a temperatura ambiente per un'ora.

Successivamente, utilizzare tre lavaggi con tampone Tris per rimuovere gli anticorpi non legati. Quindi, incubare i tessuti con il complesso avidina biotina a temperatura ambiente per 45 minuti. Per colorare il prodotto di reazione, applicare brevemente la soluzione DAB per 45 secondi, quindi lavare le sezioni del poggiapiedi con acqua distillata e asciugarle all'aria prima del montaggio.

Dopo aver rimosso i cuscinetti dei piedi dall'animale soppresso, sezionare il quarto e il quinto DRG lombare. Quindi, post-fissare i tessuti DRG sezionati per due ore in PFA al quattro percento a temperatura ambiente. Successivamente, crioproteggere i tessuti DRG con il 30% di saccarosio in PBS durante la notte.

Il giorno seguente, tagliateli in sezioni da otto micron. Posizionali sulle diapositive ed etichettali. Conservare queste sezioni a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius.

Utilizzare lo stesso metodo utilizzato per le sezioni del cuscinetto del piede, tranne quando si esegue l'etichettatura, includere ATF-3, un marcatore di lesione, e periferina, un marcatore neuronale di piccolo diametro nell'anti-siero primario, ed eseguire tale reazione durante la notte. Dopo aver lavato le sezioni, incubarle con l'apposito antisiero secondario. Quindi, dopo un'altra serie di lavaggi, montare le sezioni per la quantificazione.

Questo protocollo descrive un nuovo modello murino di neuropatia da resiniferatossina, che colpisce specificamente i neuroni di piccolo diametro, inclusa la degenerazione IENF associata a disturbi sensoriali. La dose di 50 microgrammi per chilogrammo era considerata critica e una dose più elevata era spesso letale. Sette giorni dopo l'iniezione di RTX, gli animali presentavano ipoalgesia termica e allodinia meccanica.

Alla dose critica, c'era degenerazione IENF e marcata induzione di ATF-3. I neuroni danneggiati erano neuroni positivi alla periferina, di piccolo diametro. Al contrario, la bassa dose di RTX non ha stabilito la neuropatia delle piccole fibre e non ha mostrato cambiamenti nell'innervazione.

Né la bassa dose ha mostrato alcuna induzione di ATF-3, un marcatore di danno neuronale. Pertanto, per l'applicazione del metodo descritto si suggerisce la dose critica di 50 microgrammi di RTX per chilogrammo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come stabilire un modello di neuropatia sensoriale pura.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada alla ricerca nel campo della piccola neuropatia sensoriale, al suo contributo prodotto di lesione dei piccoli nervi sensoriali, nello sviluppo del dolore neuropatico. Non dimenticare che RTX è neurotossico e pericoloso e può agire come irritante per gli occhi, le mucose, le vie respiratorie superiori. Evitare l'inalazione e indossare occhiali da laboratorio e camice durante la manipolazione di RTX.

Sciacquare abbondantemente con acqua in caso di contatto con la pelle e dopo la manipolazione.