Name: Sintesi e analisi di spettrometria di massa di Oligo-peptoids (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Impara la sintesi manuale di oligo-peptoidi e l'analisi della sequenza monomerica mediante spettrometria di massa. Questo protocollo guida i principianti nella caratterizzazione strutturale di questi polimeri sintetici.

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Gli autori vorrei ringraziare il signor Michael Connolly e Dr. Ronald Zuckermann (The Molecular Foundry, Lawrence Berkeley National Laboratory) per l'assistenza tecnica in sintesi peptoid. Riconosciamo il sostegno della National Science Foundation (-1301505). Tutti gli esperimenti di spettrometria di massa sono stati condotti presso l'impianto di spettrometria di massa di chimica presso l'Università del Pacifico.

1. sintesi di Peptoid
Nota: La sintesi inizia con la resina di attivazione gonfiore la resina e rimuovendo il gruppo di protezione. Questa è seguita da una crescente della catena di peptoid sulla resina attraverso ripetuti cicli di aggiunta del monomero. Il primo monomero accoppiato alla resina è il residuo del C-terminale. Il peptoid è allungata da C-terminale a N-terminale. Una volta ottenuta la sequenza desiderata peptoid, la resina viene clivata off e il prodotto peptoid è purificato.
<ol><li>Preparazione dei reagenti Nota: I reagenti liquidi sono misurati utilizzando una micropipetta e i reagenti solidi vengono misurati utilizzando una bilancia analitica.<ol>
<li>Mescolare 6,2 mL di N, n' '-diisopropylcarbodiimide (DIC) e 43,8 mL di N, N-dimetilformammide (DMF) per preparare un 0,8 M della soluzione DIC/DMF.</li>
		<li>Sciogliere g 5,56 di BMA in 50,0 mL di DMF per preparare una soluzione di 0,8 M BMA/DMF.</li>
		<li>Mescolare 2 mL di piperidina (Pip) e 8 mL di DMF per ottenere 20% soluzione di Pip/DMF.</li>
		<li>Sciogliere 1,9 mL di Npe in 13,1 mL di DMF per raggiungere 1.0 M Npe/DMF.</li>
		<li>Sciogliere 1,3 mL di Nme in 13,7 mL DMF per raggiungere 1.0 M Nme/DMF.</li>
		<li>Sciogliere 0,32 mL di Nae in 2 mL di DMF per raggiungere 1.0 M Nae/DMF. Attenzione: la maggior parte delle sostanze chimiche utilizzate nella sintesi sono pericolosa. Acido trifluoroacetico (TFA), DIC, Pip e BMA sono pericolosi per la pelle, occhi e vie respiratorie. DMF e diclorometano (DCM) sono sospetti cancerogeni. Tutte le reazioni devono essere eseguite in una cappa aspirante e appropriati dispositivi di protezione individuale devono essere utilizzato. Si prega di controllare il foglio di dati materiale di sicurezza (MSDS) di tutte le sostanze chimiche utilizzate nella sintesi.</li>
	</ol></li>
	<li>Attivazione di resina
	<ol>
<li>Misurare 84 mg di resina di ammide Rink (resina, 0.047 mmol, caricamento 0,56 mmol/g) e aggiungerlo ad un vaso di reazione di fase solida in polipropilene da 10 mL. Inserire lo stantuffo nel recipiente.</li>
		<li>Aggiungere 2 mL di DMF per il recipiente di reazione e tappo il recipiente con un tappo a pressione. Posizionare il vaso su uno shaker e agitare il recipiente a temperatura ambiente con un angolo di movimento di circa 12 gradi e 385 oscillazioni/min per 30 min. scarico la soluzione a un contenitore per rifiuti rimuovendo il tappo e lo stantuffo del recipiente di reazione.</li>
		<li>Aggiungere 2 mL di soluzione di Pip/DMF 20% alla nave e la nave di cap. Agitare su agitatore per 2 min e svuotare la soluzione nel contenitore dei rifiuti.</li>
		<li>Aggiungere 2 mL di soluzione di Pip/DMF 20% alla nave, tappo serbatoio e agitare a temperatura ambiente per 12 min. Rimuovi il tappo e svuotare la soluzione nel contenitore dei rifiuti.</li>
		<li>Lavare la resina aggiungendo 1 mL di DMF, tappatura della nave e agitando il vaso per un minimo di 1 Togliere il tappo e svuotare la soluzione premendo lo stantuffo. Lavare la resina con DMF per altre 4 volte.</li>
	</ol></li>
	<li>Aggiunta del monomero e acetilazione del N-terminale Nota: Ogni ciclo di aggiunta del monomero comporta lo spostamento, bromoacetylation e reazione a due passi.<ol>
<li>Eseguire il primo ciclo di aggiunta del monomero a forma Nme-resina.</li>
		<li>Eseguire una reazione di bromoacetylation. Mescolare 1 mL di soluzione di 0,8 M BMA/DMF e 1 mL di soluzione di 0,8 M DIC/DMF in un becher. Trasferire il composto in un recipiente di reazione contenente la resina e la nave di cap. Posizionare il vaso su shaker e agitare a temperatura ambiente per 20 min. Rimuovi il tappo e svuotare la soluzione nel contenitore dei rifiuti.</li>
		<li>Lavare la resina aggiungendo 1 mL di DMF, tappatura della nave, d'agitazione per 1 min e drenante la soluzione premendo lo stantuffo. Lavare la resina aggiungendo 1 mL di DCM, agitando il vaso per 1 min, e la soluzione di drenaggio. Lavare la resina con DCM ancora una volta e poi lavare con DMF due volte.</li>
		<li>Eseguire una reazione di spostamento. Aggiungere 1 mL di soluzione di 1,0 M Nme/DMF, la nave di cap, agitare il recipiente a temperatura ambiente per 60 min. Rimuovi il tappo e drenare la soluzione premendo lo stantuffo.</li>
		<li>Lavare la resina aggiungendo 1 mL di DMF, agitando il vaso per 1 min e drenante la soluzione premendo lo stantuffo. Lavare la resina disegnando in 1 mL di Diclorometano, agitare per 1 min, e la soluzione di drenaggio. Lavare DCM una volta di più, seguita da lavaggio con DMF due volte.</li>
		<li>Ripetere i cicli di aggiunta del monomero da passaggi 1.3.2 a 1.3.5 per formare Nae-(Npe-Nme)4-resina. Quando si ripete il passaggio della reazione di spostamento (1.3.4), utilizzare una soluzione di ammina specifico in base alla sequenza di peptoid. Nota: La catena peptoid è allungata da C-terminale a N-terminale con il residuo del C-terminale associato alla resina.</li>
		<li>Eseguire acetilazione del N-terminale per formare Ac-Nae-(Npe-Nme)4-resina.</li>
		<li>Anidride acetica mix 92 µ l della, 43,5 µ l di N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) e 2 mL di DMF in un becher per fare cocktail circa 2 mL di acetilazione.</li>
		<li>Aggiungere 2 mL di acetilazione cocktail al recipiente contenente la resina, la nave di cap e agitare a temperatura ambiente per 60 min. Togliere il tappo e svuotare la soluzione premendo lo stantuffo.</li>
		<li>Lavare la resina aggiungendo 1 mL di DMF, agitando il vaso per 1 min e drenante la soluzione premendo lo stantuffo. Lavare la resina aggiungendo 1 mL di DCM, agitando il vaso per 1 min, e la soluzione di drenaggio. Ripetere il lavaggio della resina con DCM ancora una volta, quindi lavare con DMF altre due volte.</li>
		<li>Lavare la resina aggiungendo 1 mL di DCM, agitando il vaso per 1 min e drenante la soluzione premendo lo stantuffo. Ripetere il lavaggio due volte con DCM. Rimuovere il tappo e lasciare che la resina asciugare all'aria nel vaso di reazione per 10 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Clivaggio e purificazione
	<ol>
<li>Mescolare 3,8 mL di TFA, 100 µ l di triisopropylsilane (suggerimenti) e 100 µ l di grado HPLC H2O in un becher per fare cocktail 4 mL di clivaggio.</li>
		<li>Aggiungere 4 mL di preparata clivaggio cocktail al recipiente contenente la resina, la nave di cap e agitare a temperatura ambiente per 2 h.</li>
		<li>Rimuovere il tappo e raccogliere la soluzione filtrato in una provetta da centrifuga polipropilene 50 mL. Aggiungere 1 mL di TFA al vaso, tappo e agitare per 1 minuto raccogliere la soluzione filtrato nella stessa provetta da centrifuga.</li>
		<li>Evaporare TFA soffiando delicatamente in un flusso di gas di azoto fino a circa 1 mL soluzione viscosa è a sinistra.</li>
		<li>Aggiungere 15 mL di etere etilico per la soluzione rimanente, tappo della provetta da centrifuga e viene quindi incubato in un congelatore a-20 ° C per 2 h per una notte. Il greggio peptoid precipita come solido bianco.</li>
		<li>A pellet il solido utilizzando una centrifuga a 4.427 x g per 10 min. Rimuovi il tappo della provetta centrifugo e decantare etere etilico in un becher con attenzione senza perdere il solido. Attenzione: l'etere dietilico è un solvente organico infiammabile. Si prega di utilizzare una centrifuga di sicuro di etere etilico.</li>
		<li>Lavare il solido con l'aggiunta di 10 mL di etere etilico ghiacciata nella centrifuga tubo contenente il solido, tappatura del tubo e l'immissione nella centrifuga. Eseguire centrifugazione a 4.427 x g per 10 min. Rimuovi la centrifuga tubo da centrifuga e decantare etere etilico in un becher con attenzione senza perdere il solido.</li>
		<li>Asciugare il solido soffiando delicatamente in un flusso di gas azoto.</li>
		<li>Aggiungere 10 mL di grado HPLC H2O per sciogliere il solido essiccato. Filtrare la soluzione attraverso un filtro di siringa in nylon con dimensione dei pori di 0.45 µm e raccogliere il filtrato in una provetta da centrifuga polipropilene pre-pesata 50 mL.</li>
		<li>Shell congelare la soluzione immissione e ruotando la centrifuga provetta contenente la soluzione di peptoid in un 12-ounce, a doppio strato tazza polistirolo espanso 1/3 riempita con azoto liquido. Lyophilize la soluzione congelata durante la notte per produrre peptoid solido.</li>
		<li>Ripetere ancora una volta di liofilizzazione dissolvendo il solido peptoid in 10 mL di grado HPLC H2O, shell congelamento in azoto liquido e liofilizzazione durante la notte. Il peptoid risultante è sufficientemente puro per analisi di sequenza mediante spettrometria di massa.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Sig. ra misure e analisi di sequenza
Nota: L'esperimento di MS/MS viene effettuata in uno spettrometro di massa quadrupole triplice accoppiato ad una sorgente di ionizzazione (ESI) di electrospray. Raccolta dei dati viene controllata tramite il software di acquisizione dati accompagnato con lo strumento. La procedura generale include 1) effettua l'esperimento di spettrometria di massa di scansione completa e registrare lo spettro di massa, 2) eseguire il CID MS/MS sperimentare e registrazione dello spettro MS/MS e 3) confrontando i dati spettrali di MS/MS con teorica schema di frammentazione predetto in base alla funzionalità strutturale della peptoid.
<ol><li>Preparazione della soluzione campione
	<ol>
<li>Pesare 1,0-2,0 mg peptoid solido in un flaconcino di vetro di 3-5 mL. Aggiungere 1 mL miscelati di solvente di acetonitrile e acqua (ACN/H2O, 1:1, v/v) per sciogliere il peptoid. Questo dà la soluzione di riserva campione con una concentrazione di circa 10-3 M.</li>
		<li>Trasferimento di 20 µ l di soluzione madre in una provetta da centrifuga da 1,5 mL e aggiungere 1 mL miscelati di solvente di ACN/H2O per produrre una soluzione di campione diluito di circa 10-5 M.</li>
		<li>Rimuovi qualsiasi eventuali particelle insolubili nella soluzione campione diluito eseguendo centrifugazione a 4.427 x g per 3 min circa 700 µ l della parte superiore della soluzione di trasferimento in un'altra centrifuga di 1,5 mL tubo per rendere il peptoid MS soluzione di lavoro con concentrazione di circa 10-5 M.</li>
		<li>Regolare la concentrazione della soluzione di lavoro di MS basata sull'intensità di segnale osservato durante le misurazioni di spettrometria di massa.</li>
		<li>Un modo alternativo per rimuovere eventuali particelle insolubili possibili nella soluzione del campione diluito è passare la soluzione di campione attraverso una siringa filtro 0,20 µm e raccogliere il filtrato in una provetta da centrifuga da 1,5 mL per rendere il peptoid MS soluzione di lavoro di circa 10-5 M.</li>
	</ol></li>
	<li>Registrazione di spettri di massa
	<ol>
<li>Eseguire miscela di solventi di ACN/H2O (1:1, v/v) con la fonte electrospray di ionizzazione (ESI) e impostare lo strumento in uno standard agli ioni positivi, scansione completa modalità di spettrometria di massa con una gamma di rapporto massa / carica (m/z) di 100-1500. Nota: Parametri di funzionamento tipici: Tensione dell'ago di ESI, 5 kV Tensione capillare, 40 V Essiccazione di temperatura del gas (azoto), 200 ° C.</li>
		<li>Aggiungere circa 300 µ l di soluzione di lavoro di peptoid MS (circa 10-5 M) in una 500 µ l o una siringa da 1 mL e collegare la siringa all'entrata del ESI utilizzando della tubazione capillare polietere etere chetone (PEEK). Posizionare la siringa nella pompa a siringa e impostare la portata a 10 µ l/min per infondere la soluzione di esempio nell'ingresso dell'ESI.</li>
		<li>Accendere la tensione dell'ago ESI per attivare il processo ESI e poi accendere il rivelatore. Impostare la visualizzazione in modalità profilo e la gamma di m/z di 100-1.500. Mostra un profilo di spettro di massa mostrato nella finestra del profilo. Il picco a m/z 1.265 (visualizzato come m/z di 1,264.6) corrisponde alla peptoid peptoid ione o protonata.</li>
		<li>Registrare lo spettro di MS per 2 min. Nella finestra"metodo", utilizzare 2 min come la "fase di esecuzione." Aprire la finestra di registrazione e inserire un nome di file corretto e iniziare a registrare lo spettro. Nota: Lo spettro di massa risultante è illustrato nella Figura 3.</li>
		<li>Ottimizzare l'intensità del picco a m/z di 1.265. Impostare l'intervallo di m/z di 1.150-1.350 e regolare la tensione capillare durante la visualizzazione dell'intensità di picco in mV mostrato nella finestra del profilo. Ad esempio, aumentare la tensione capillare a 50 V o superiore e Mostra la variazione dell'intensità di picco. L'intensità di picco ottimale è intorno a 150-200 mV. Nota: Regolazione della tensione capillare può cambiare significativamente l'abbondanza di determinati ioni. Aumentando la tensione capillare può migliorare l'intensità dello ione peptoid. Tuttavia, un'alta tensione capillare può anche indurre la dissociazione dello ione peptoid alla sorgente di ioni e diminuire l'intensità osservata. Regolazione della temperatura del gas di essiccazione può migliorare l'intensità del picco a m/z 1.265, ma è meno efficace di regolazione della tensione capillare. Se il picco a m/z 1.265 non raggiunge l'intensità ottima, regolare la concentrazione di campione (o esempio, doppia la concentrazione della soluzione di lavoro di MS).</li>
		<li>Accendere lo strumento nella modalità di MS/MS. Impostare lo ione precursore a 1.265 m/z e il MS/MS range a m/z di 100-1.400 di massa. Nella finestra"metodo" utilizzare 1.265 m/z come la "prima messa Q1" e lasciare vuoto il "Ultima messa Q1". Utilizzare m/z 100 come "Q3 prima messa" e m/z 1.400 Mass "Q3 ultimo." Nota: In modalità MS/MS, le prime funzioni di quadrupolo unità (Q1) come un filtro di massa per isolare lo ione peptoid come lo ione precursore, la seconda unità di quadrupolo (Q2) è una cella di collisione e il terzo quadrupolo unità (Q3) funzioni come un analizzatore di massa.</li>
		<li>Insieme l'energia di collisione a 40 eV e il gas di collisione (argon, in questo caso) della pressione a 1,5 mTorr.</li>
		<li>Mostra un profilo di spettro totale visualizzato nella finestra del profilo. Il picco a m/z di 1.265 corrisponde allo ione peptoid, e i picchi con valori inferiori a m/z rappresentano i frammenti dallo ione peptoid.</li>
		<li>Regolare l'energia di collisione per ottimizzare la visualizzazione dello spettro di frammentazione. Ad esempio, aumentare l'energia di collisione a 45 eV e Mostra il cambiamento del profilo dello spettro. Nota: In generale, aumentando l'energia di collisione migliorerà l'abbondanza degli ioni frammento e ridurre l'abbondanza dello ione peptoid. Aumentando la pressione del gas di collisione consentirà inoltre di migliorare l'abbondanza degli ioni frammento. Attenzione: Non aumentare la pressione del gas di collisione oltre 2 mTorr.</li>
		<li>Registrare lo spettro MS/MS per 2 min. Nella finestra"metodo" utilizzare 2 min come la "fase di esecuzione." Aprire la finestra di registrazione e inserire un nome di file corretto e iniziare a registrare lo spettro.</li>
		<li>Ripetere 1 - 2 tempi di registrazione.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi di sequenza di peptoid Nota: Nella circostanza di CID, lo ione di peptoid sarebbe frammento presso i legami ammidici lungo la spina dorsale di peptoid per produrre una serie di frammenti N-terminali chiamati B-ioni e una serie di frammenti C-terminale chiamato Y-ioni<ol>
<li>Disegnare la struttura chimica della peptoid acetilato inserendo l'estremità N-terminale sul lato sinistro e C-terminale sul lato destro e una linea tratteggiata a ogni legame dell'ammide per generare uno schema di frammentazione, come mostrato nella Figura 2a. Disegnare un protone con un cerchio tratteggiato per indicare l'elemento portante della carica. A partire dal lato sinistro della struttura, posizionare le etichette sulle linee tratteggiate per indicare i frammenti N-terminali come B1, B2, B8. A partire dal lato destro, posizionare le etichette sulle linee tratteggiate per indicare i frammenti C-terminale come Y1, Y2, a Y8. Nota: Un software di disegno chimico può essere utilizzato per disegnare la struttura di peptoid.</li>
		<li>Immaginate di frammentazione presso il legame di ammideth 4 dal lato sinistro e disegnare le strutture del frammento N-terminale e il frammento C-terminale con accuse formali corretto, come mostrato nella Figura 2b. Inserire l'etichetta di B4 sul frammento N-terminale e inserire l'etichetta di Y5 sul frammento C-terminale. Calcolare il valore m/z B4 sommando le masse nominale degli elementi nella struttura per produrre un valore di 580 e posto m/z 580 sul frammento N-terminale. Calcolare il valore m/z Y5 e posto m/z 685 sul frammento C-terminale.</li>
		<li>Calcolare i valori di m/z per tutti e otto gli ioni B e tutti e otto gli ioni Y e assemblarli in una tabella, come mostrato nella tabella 1. Nota: I valori m/z dei frammenti possono essere calcolati utilizzando un prodotto chimico software di disegno.</li>
		<li>Aprire lo spettro MS/MS registrato di peptoid utilizzando il software di modifica di dati accompagnato con lo strumento. Impostare le preferenze di etichettatura "Visualizza etichette di ioni" ed etichetta soglia al 3%. Questo genera uno spettro MS/MS con valori m/z etichettati sulle cime.</li>
		<li>Esportare il MS/MS dati spettrali come file di testo nel file CSV formattare e ricostruire lo spettro utilizzando software di elaborazione dati. Inserire i valori m/z sulle cime. Lo spettro di MS/MS risultante è mostrato in Figura 4. Nota: Alcuni spettrometri di massa sono dotati di software di elaborazione dati in grado di generare lo spettro MS/MS. In questo caso, non è necessario esportare i dati spettrali di MS/MS.</li>
		<li>Assegnare i valori m/z mostrati sullo spettro MS/MS a quelli mostrati nella tabella 1 per identificare il corrispondenti B - e Y-ioni. Ad esempio, il picco a m/z 580 è identificato come la B4-ione e m/z 685 viene identificato come il Y5-ioni. Etichettare le cime con i corrispondenti simboli B e Y sullo spettro, come mostrato nella Figura 4.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Un peptoid nonamer, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, è stato sintetizzato utilizzando il protocollo presentato. L'apparecchio per la sintesi coinvolge un vaso di siringa-come reazione di fase solida in polipropilene e un agitatore meccanico. I vasi di reazione sono commercialmente disponibili e a basso costo. Agitatore meccanico è un apparato comune nei laboratori di chimica. Con l'uso di un recipiente di reazione simil-siringa, soluzioni possono essere trascinati e spinto fuori la nave spostando manualmente ...

Peptoids sono una classe di polimeri sequenza controllata con strutture di spina dorsale che imita la struttura dei peptidi. Peptoids possono essere sintetizzati da diverse ammine, che permette di peptoids ad esporre proprietà altamente sintonizzabile1,2. Peptoids sono stati utilizzati come modelli molecolari per la ricerca biofisica, considerati come agenti terapeutici e progettato come leganti per proteine3,4,5,6. Peptoids sono stati sviluppati in una varietà di composti biologicamente attivi, quali materiali anti-incrostazione e anticorpo-mimetici, agenti antimicrobici e degli enzimi inibitori7,8,9. Con una natura altamente ordinata e sintonizzabile, peptoids hanno anche stato pensato come un tipo di informazioni molecolari deposito10. La scoperta di queste chiamate di diverse applicazioni per lo sviluppo di efficienti metodi analitici per caratterizzare la sequenza e la struttura di peptoids. Tecniche basate sulla spettrometria di massa tandem hanno indicato la promessa come il metodo di scelta per analizzare le proprietà di sequenza di sequenza controllata polimeri, tra cui peptoids11,12,13, 14,15. Tuttavia, gli studi sistematici correlando i pattern di frammentazione di ioni peptoid derivanti da studi di spettrometria di massa e le informazioni strutturali di peptoids sono molto limitati.
Peptoids possono essere facilmente sintetizzati utilizzando un metodo di fase solida. Il metodo ben sviluppato coinvolge un'iterazione di un ciclo di16,di due fasi monomero aggiunta17. In ogni ciclo di aggiunta, un'ammina associato a resina è acetilata da un acido di aloacetici (in genere acido bromoacetico, BMA), e questa è seguita da una reazione di spostamento con un'ammina primaria. Anche se i protocolli di sintesi automatizzata sono stati applicati ordinariamente per la sintesi di peptoid, peptoids possono essere sintetizzati manualmente con ottimi rendimenti in un standard chimica laboratorio16,18,19, 20.
Il nostro laboratorio ha adottato il metodo della sintesi di peptoid manuale e semplificato la strumentazione utilizzata per i metodi esistenti. In precedenza abbiamo studiato i modelli di frammentazione di una serie di peptoids utilizzando tecniche di MS/MS21,22,23. I nostri risultati indicano che peptoids producono caratteristici frammentazioni quando essi sono sottoposti alla dissociazione indotta da collisione (CID)21,23 o cattura elettronica esperimenti22 dissociazione (ECD). In questo articolo, dimostriamo come oligo-peptoids può essere sintetizzato in un laboratorio di chimica standard, come eseguire gli esperimenti di CID utilizzando uno spettrometro di massa triplo quadrupolo e come analizzare i dati spettrali. Il peptoid essere sintetizzato e caratterizzato è un nonamer con acetilazione del N-terminale e C-terminale amidazione, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. La struttura del peptoid è illustrata nella Figura 1.

<table><tbody><tr><td>Spettrometro di massa quadrupolo triplo ESI, Varian 320L</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td></td><td>Lo spettrometro di massa è stato acquisito da Varian, Inc.</td></tr><tr><td>Varian MS workstation, Versione 6.9.2, un software per acquisizione e revisione dati</td><td>Varian Inc.</td><td></td><td>Il software fa parte del pacchetto Varian 320L</td></tr><tr><td>Shaker da polso Burrell Scientific, Modello 75 DD</td><td>Fisher Scientific International Inc.</td><td>14-400-126</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga Hermle, Modello Z 206 A</td><td>Hermle Labortechnik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recipiente di reazione in fase solida, 10 mL</td><td>Torviq</td><td>SF-1000</td><td></td></tr><tr><td>Cappucci di pressione per recipienti di reazione</td><td>Torviq</td><td>PC-SF</td><td></td></tr><tr><td>Filtri a siringa, dimensione pori 0,2 e mu; m</td><td>Fisher Scientific Inc.</td><td>03-391-3B</td><td></td></tr><tr><td>Filtri a siringa, dimensione dei pori 0,45 e mu; m</td><td>Fisher Scientific Inc.</td><td>03-391-3A</td><td></td></tr><tr><td>Rimorchi centrifughe in polipropilene, 50 mL</td><td>VWR International, LLC.</td><td>490001-626</td><td></td></tr><tr><td>Rimorchi centrifughe in polipropilene, 15 mL</td><td>VWR International, LLC.</td><td>490001-620</td><td></td></tr><tr><td>ChemBioDraw, Ultra, Versione 12.0</td><td>CambridgeSoft Corporation</td><td></td><td>CambridgeSoft fa ora parte di PerkinElmer Inc.</td></tr><tr><td>Bicchiere in polistirolo, 12 oz</td><td>Supermercato Comune</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resina amide di pista</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>10619</td><td></td></tr><tr><td>Piperidina</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>02351</td><td>Altamente tossico</td></tr><tr><td>N, N'-diisopropilcarbodiimide</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00110</td><td>Altamente tossico</td></tr><tr><td>Acido bromoacetico</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>26843</td><td>Altamente tossico</td></tr><tr><td>2-Feniletilamina</td><td>VWR International, LLC.</td><td>EM8.07334.0250</td><td></td></tr><tr><td>2-Metiossietilamina</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>241067</td><td></td></tr><tr><td>N-Boc-etilenediamina</td><td>VWR International, LLC.</td><td>AAAL19947-06</td><td></td></tr><tr><td>Anidride acetica</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>252845</td><td></td></tr><tr><td>N, N-dimetilformamide</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1117-4LG</td><td>Ulteriore distillazione prima dell'uso</td></tr><tr><td>N, N-diisopropiletilamina</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00141</td><td></td></tr><tr><td>Triisopropilsilano</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>01966</td><td></td></tr><tr><td>Acido trifluoroacetico</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00289</td><td>Altamente tossico</td></tr><tr><td>Sistema accademico di purificazione dell'acqua Millipore MILLI-Q</td><td>Millipore Corporation</td><td>ZMQP60001</td><td>Per generare acqua di grado HPLC</td></tr><tr><td>Acqua di grado HPLC</td><td></td><td></td><td>Prodotto da Millipore MILLI-Q&reg; Sistema Accademico di Purificazione dell'Acqua</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>339USP/NF</td><td>Grado HPLC</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher Scientific International, Inc.</td><td>A998-4</td><td>Grado HPLC</td></tr><tr><td>Etere dietilico</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1121-19L</td><td>Ulteriore distillazione prima dell'uso</td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1113-19L</td><td>Ulteriore distillazione prima dell'uso</td></tr><tr><td>Gas azoto</td><td>Fresno Oxygen/Barnes Supply</td><td>NIT 50-C-F</td><td>Purezza ultra alta, 99,9995%</td></tr><tr><td>Gas argon</td><td>Fresno Oxygen/Barnes Supply</td><td>ARG 50-C-F</td><td>Purezza ultra alta, 99,9995%</td></tr></tbody></table>

sintesi e analisi di spettrometria di massa di oligo-peptoids

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoids sono sequenza controllata oligomeri che imita il peptide che consiste in unità di glicina N-alchilati. Tra le molte applicazioni potenziali, peptoids sono stato pensato come un tipo di archiviazione di informazioni molecolari. Analisi di spettrometria di massa sono stato considerato il metodo di scelta per peptoids di sequenziamento. Peptoids possono essere sintetizzati tramite chimica in fase solida utilizzando un ciclo di reazione ripetuta in due fasi. Qui presentiamo un metodo per sintetizzare manualmente oligo-peptoids e per analizzare la sequenza della peptoids utilizzando tecniche di spettrometria di massa (MS/MS) tandem. L'esempio peptoid è un nonamer composto alternando glicina di N (2-methyloxyethyl) (Nme) e glicina di N (2-phenylethyl) (Npe), come pure una N-(2-amminoetil) glicina (Nae) al N-terminale. La formula di sequenza del peptoid è Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, dove Ac è il gruppo acetile. La sintesi avviene in un recipiente di reazione di fase solida disponibile in commercio. La resina di ammide pista è utilizzato come supporto solido per produrre il peptoid con un gruppo di ammide al C-terminale. Il prodotto peptoid risultante è sottoposto ad analisi di sequenza utilizzando uno spettrometro di massa quadrupole triplice accoppiato ad una sorgente di ionizzazione electrospray. La misurazione di MS/MS produce uno spettro di ioni frammento derivanti dalla dissociazione della carica peptoid. Gli ioni frammento vengono ordinati in base ai valori del loro rapporto massa / carica (m/z). I valori m/z degli ioni frammento vengono confrontati con le masse nominali degli ioni frammento teoricamente prevista, secondo lo schema di peptoid frammentazione. L'analisi genera un pattern di frammentazione della carica peptoid. Il modello di frammentazione è correlato alla sequenza di monomero della peptoid neutro. A questo proposito, analisi MS legge le informazioni di sequenza della peptoids.

La struttura di un peptoid 9-mer con acetilazione del N-terminale, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, è mostrata nella Figura 1. Il peptoid è stato sintetizzato manualmente in un recipiente di reazione in polipropilene sinterizzato tramite approccio in fase solida. Pista di pattinaggio ammide resina (0,047 mmol, 84 mg con caricamento 0,56 mmol/g) è usata come supporto solido per produrre il peptoid con un poi amidato C-terminus. La catena peptoid è ...

Un protocollo è descritto per la sintesi manuale di oligo-peptoids seguita da analisi di sequenza mediante spettrometria di massa.

Sintesi e analisi di spettrometria di massa di Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come sintetizzare manualmente gli oligo-peptoidi e come analizzare la loro sequenza di monomeri utilizzando tecniche di spettrometria di massa. Il metodo può aiutare i principianti a rispondere a domande chiave nel campo dei peptoidi, come come creare i peptoidi e come caratterizzare la loro sequenza di monomeri. Il principale vantaggio di questa tecnica è che i peptoidi con residui monomeri speciali possono essere sintetizzati e analizzati nel laboratorio standard di chimica analitica.Anche se questo metodo si concentra sugli oligo-peptoidi, può essere applicato anche ad altri sistemi come peptidi e oligo-nucleotidi. Generalmente, le persone nuove a questa tecnica avranno difficoltà perché raggiungere condizioni ottimali di spettrometria di massa è difficile senza dimostrazione visiva. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando volevamo caratterizzare le caratteristiche strutturali dei peptoidi tramite metodi di spettrometria di massa tandem.Prima pesa 84 milligrammi di resina amide di Rink e aggiungili a un recipiente di reazione in fase solida di polipropilene da 10 millilitri. Poi inserisci uno sturalavandini nel recipient

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