Immuno-fluorescenza etichettatura dei microtubuli e proteine centrosomali in tessuto intestinale Ex Vivo e 3D In Vitro intestinale Organoids

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare organoidi intestinali incorporati in matrice basale 3D in vitro e successivamente fissare e immunomarcare i microtubuli e proteins. 3D centrosomica gli organoidi in vitro sono modelli ideali per lo studio di questioni biologiche chiave nella biologia cellulare e dello sviluppo. Ma localizzare le proteine e le strutture endogene nei modelli 3D è più complesso che nelle colture 2D.

È importante sottolineare che il fissativo deve preservare la delicata architettura 3D preservando anche l'antigenicità degli anticorpi. I metodi presentati includono l'isolamento, la fissazione e l'immunomarcatura di organoidi intestinali in vitro 3D. Ma i protocolli di fissazione e immunomarcatura possono essere utilizzati anche in tessuti isolati ex vivo.

Il vantaggio principale del protocollo di fissazione con formaldeide-metanolo presentato è che preserva le strutture 3D preservando anche l'antigenicità. Consente una buona penetrazione e clearance degli anticorpi tevel post-fissati per un'efficace marcatura dei microtubuli, dei filamenti di actina e delle proteine leganti e di diverse proteine centrosomiali, tra cui la nineina. A dimostrare la procedura saranno la dottoressa Deborah Goldspink, un postdoc formale nel mio laboratorio, e la dottoressa Zoe Matthews, co-autrice.

Dopo l'isolamento delle cripte intestinali e dei villi, le strutture epiteliali isolate possono essere fissate per l'immunocolorazione. Le cripte isolate possono essere alternativamente inserite in cupole a matrice che poi formeranno organoidi. Dopo circa cinque-sette giorni di incubazione, si saranno formati gli organoidi.

Utilizzare 500 microlitri di RT-PBS per lavare i pozzetti contenenti le cupole della matrice basamentale con organoidi. Quindi, aggiungere 250 microlitri di soluzione per il recupero delle celle fredde in ogni pozzetto. Successivamente, utilizzando una micropipetta P1000, raschiare le cupole della matrice del basamento e pipettare accuratamente su e giù in tutto il pozzetto per rompere e rimuovere la matrice del seminterrato dalla plastica.

Assicurati che la soluzione di recupero sia fredda per aiutare a scomporre la matrice. Durante la raschiatura, utilizzare solo una micropipetta P1000 in modo da non rompere gli organoidi e che rimangano intatti. Raccogliere il surnatante in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri a basso legame.

Quindi, capovolgere la provetta più volte e controllare al microscopio a volte a 50 ingrandimenti che gli organoidi siano stati isolati, si muovano liberamente e non siano in grumi. Pellettare gli organoidi mediante centrifugazione a 1.000 g e temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, rimuovere il reagente di recupero e procedere immediatamente al fissaggio.

Per fissare gli organoidi precedentemente isolati con formaldeide e metanolo, risospendere gli organoidi in una soluzione fissativa di formaldeide metanolo a 20 gradi Celsius negativi. Incubare gli organoidi a meno 20 gradi Celsius in congelatore per 15 minuti, capovolgendo la provetta ogni cinque minuti. Quindi, pellettare gli organoidi mediante centrifugazione a 1.000 g per cinque minuti.

Rimuovere il fissativo e quindi aggiungere la soluzione di lavaggio composta da PBS con siero di specie anticorpali secondarie all'1% o PBS con detergente allo 0,1% e siero all'1%. Dopo aver pellettato il campione come prima, rimuovere la soluzione di lavaggio e risospendere il campione in una soluzione di lavaggio fresca. Utilizzare un rotatore di tubi per lavare le celle per un totale di un'ora, pellettando gli organoidi mediante centrifugazione ogni 15 minuti e sostituendo la soluzione di lavaggio.

Per bloccare i campioni di organoidi intestinali, aggiungere il 10% di siero di specie anticorpali secondarie al PBS. Pellettare gli organoidi a 1.000 g per cinque minuti e rimuovere il surnatante. Aggiungere un millilitro di soluzione bloccante a ciascun campione da incubare nei diversi anticorpi.

Quindi, incubare i campioni e la soluzione bloccante su un rotatore di provette a temperatura ambiente per un'ora. Successivamente, diluire gli anticorpi primari in PBS contenenti il 10% di siero e lo 0,1% di detergente. Quindi, dopo aver centrifugato i campioni e rimosso la soluzione bloccante, utilizzare la soluzione di anticorpi primari per risospendere il pellet di organoide.

Ruotare i tubi a 20 giri/min e quattro gradi Celsius durante la notte per mantenere gli organoidi in sospensione. Il giorno seguente, riportare i campioni a temperatura ambiente sul rotatore di provette per un'ora. Dopo aver centrifugato il campione, rimuovere la soluzione di anticorpi primari, aggiungere un millilitro di soluzione di lavaggio a ciascuna provetta e risospendere i pellet di organoide.

Quindi, rimuovere immediatamente la soluzione mediante centrifugazione. Aggiungere un millilitro di soluzione di lavaggio fresca e mescolare le celle su un rotatore di tubi a 20 giri/min per due ore. Successivamente, diluire gli anticorpi secondari in PBS con l'1% di siero e lo 0,1% di detergente.

Quindi, dopo aver pellettato il tessuto, risospendere i pellet in 200 microlitri di soluzione di anticorpi secondari. Incubare le provette su un rotatore di provette a temperatura ambiente per un'ora. Dopo la centrifuga e la rimozione del surnatante, risospendere il pellet in soluzione di lavaggio e centrifugare immediatamente i campioni per pellettare gli organoidi.

Quindi, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di soluzione di lavaggio fresca. Miscelare i campioni su un rotatore di provette a temperatura ambiente per 1,5-2 ore, cambiando la soluzione di lavaggio ogni 20-30 minuti come descritto in precedenza. Per montare gli organoidi, dopo aver centrifugato e rimosso tutta la soluzione di lavaggio, aggiungere al pellet due gocce di terreno di montaggio a presa dura con reagente antisbiadimento.

Tagliare l'estremità di una micropipetta P200 e risospendere con cura il pellet nel mezzo di montaggio. Quando si risolubilizzano organoidi fissati e colorati nel mezzo di montaggio, fare attenzione a non introdurre bolle. Se sono presenti bolle, lasciarle galleggiare in superficie ed evitare di trasferirle sul vetrino.

Utilizzare la micropipetta per erogare gli organoidi con il mezzo di montaggio in linea lungo il centro di un vetrino da microscopio. Quindi, posizionare con cura un bicchiere di copertura sopra ed evitare di generare bolle. Posizionare il vetrino in un book di diapositive e conservarlo in frigorifero per una notte affinché il mezzo di montaggio si solidifichi prima di analizzarlo su un microscopio confocale.

Qui sono mostrate le immagini della frazione due di tessuto isolato dell'intestino tenue contenente sia villi che cripte e un campione della frazione tre contenente principalmente cripte. Come si vede in queste immagini, una buona conservazione e marcatura dei microtubuli e dell'actina sia nei villi che nelle cripte è stata ottenuta con il protocollo di fissazione e immunomarcatura con formaldeide-metanolo descritto in questo video. Gli organoidi dell'intestino tenue sono stati generati e cresciuti nella matrice basale per tre settimane o più, quindi isolati come dimostrato in questo video.

Le cellule differenziate all'interno dei domini dei villi organoidi contengono microtubuli apicobasali stabili che sono stati ben marcati nella maggior parte dei casi. EB1 può anche essere visto lungo il reticolo dei microtubuli. Qui è mostrato un organoide allo stadio di cisti e in una fase iniziale di sviluppo delle cripte.

Entrambi i campioni sono stati fissati in formaldeide metanolo e immunomarcati per microtubuli e nineina, il che dimostra una buona conservazione e marcatura dei microtubuli nei centri di organizzazione dei microtubuli apicali non centrosomici. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita con più campioni e nell'arco di due giorni. Durante il tentativo di questa procedura, è importante raschiare accuratamente i pozzetti durante la raccolta degli organoidi per evitare di interrompere la loro struttura 3D.

Inoltre, prestare attenzione quando si aggiungono o si rimuovono soluzioni per evitare la perdita di organoidi durante la procedura di colorazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come riparare, immunomarcare e montare organoidi isolati e altre strutture epiteliali come le cripte intestinali. Non dimenticare che l'utilizzo di reagenti fissativi in questa procedura può essere estremamente pericoloso.

Durante l'esecuzione di questa procedura devono essere eseguite valutazioni dei rischi e devono essere sempre adottate misure di contenimento e DPI appropriate.