Name: Immuno-fluorescenza etichettatura dei microtubuli e proteine centrosomali in tessuto intestinale Ex Vivo e 3D In Vitro intestinale Organoids (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Scopri come isolare, fissare e immunomarcare organoidi intestinali 3D con formaldeide e metanolo. Questo metodo preserva l'architettura tridimensionale e l'antigenicità per lo studio di microtubuli e proteine centrosomali.

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Gli autori ringraziano Paul Thomas per assistenza e consulenza di microscopio. Questo lavoro ha coinvolto qui è stato sostenuto dalla BBSRC (grant no. BB/J009040/1 a m.m.m. e T.W.).

<ol><li>Bacallao, R., Antony, C., Dotti, C., Karsenti, E., Stelzer, E. H., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+organization+of+Madin-Darby+canine+kidney+cells+during+the+formation+of+a+polarized+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The subcellular organization of Madin-Darby canine kidney cells during the formation of a polarized epithelium.</a> J Cell Biol. 109 (6 Pt 1), 2817-2832 (1989).</li>
<li>Bellett, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+plus-end+and+minus-end+capture+at+adherens+junctions+is+involved+in+the+assembly+of+apico-basal+arrays+in+polarised+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Microtubule plus-end and minus-end capture at adherens junctions is involved in the assembly of apico-basal arrays in polarised epithelial cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 893-908 (2009).</li>
<li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Mackie, J. B., Prescott, A. R., Nathke, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adenomatous+polyposis+coli+protein+unambiguously+localizes+to+microtubule+plus+ends+and+is+involved+in+establishing+parallel+arrays+of+microtubule+bundles+in+highly+polarized+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The adenomatous polyposis coli protein unambiguously localizes to microtubule plus ends and is involved in establishing parallel arrays of microtubule bundles in highly polarized epithelial cells.</a> J Cell Biol. 157 (6), 1041-1048 (2002).</li>
<li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Stebbings, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+polarities+indicate+that+nucleation+and+capture+of+microtubules+occurs+at+cell+surfaces+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule polarities indicate that nucleation and capture of microtubules occurs at cell surfaces in Drosophila.</a> J Cell Biol. 108 (4), 1445-1452 (1989).</li>
<li>Sanchez, A. D., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-organizing+centers%3A+from+the+centrosome+to+non-centrosomal+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites.</a> Curr Opin Cell Biol. , (2016).</li>
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<li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%2C+self-renewal%2C+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).</li>
<li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ninein+is+essential+for+apico-basal+microtubule+formation+and+CLIP-170+facilitates+its+redeployment+to+non-centrosomal+microtubule+organizing+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Ninein is essential for apico-basal microtubule formation and CLIP-170 facilitates its redeployment to non-centrosomal microtubule organizing centres.</a> Open Biol. 7 (2), (2017).</li>
<li>Verissimo, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+mutant+RAS+in+patient-derived+colorectal+cancer+organoids+by+combinatorial+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Young, M., Reed, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+a+Model+for+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Colorectal+Cancer+Rep%22%5BJournal%5D)">Organoids as a Model for Colorectal Cancer.</a> Curr Colorectal Cancer Rep. 12 (5), 281-287 (2016).</li>
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<li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR%2FCas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li>
<li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microtubule+end-binding+protein+EB2+is+a+central+regulator+of+microtubule+reorganisation+in+apico-basal+epithelial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The microtubule end-binding protein EB2 is a central regulator of microtubule reorganisation in apico-basal epithelial differentiation.</a> Journal of Cell Science. 126 (17), 4000-4014 (2013).</li>
<li>Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Device+to+Rapidly+Prepare+Whole+Mounts+of+the+Mouse+Intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine.</a> J Vis Exp. (105), e53042(2015).</li>
<li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765(2014).</li>
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<li>Belshaw, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+DNA+methylation+in+individual+colonic+crypts+reveal+aging+and+cancer-related+field+defects+in+the+morphologically+normal+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Patterns of DNA methylation in individual colonic crypts reveal aging and cancer-related field defects in the morphologically normal mucosa.</a> Carcinogenesis. 31 (6), 1158-1163 (2010).</li>
<li>Whitehead, R. H., VanEeden, P. E., Noble, M. D., Ataliotis, P., Jat, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li>
<li>Hamilton, K. L., Butt, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+transport+into+everted+sacs+of+the+small+intestine+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Physiol+Educ%22%5BJournal%5D)">Glucose transport into everted sacs of the small intestine of mice.</a> Adv Physiol Educ. 37 (4), 415-426 (2013).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly%2C+dynamics%2C+and+positioning+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Isolamento del tessuto intestinale Isolamento di piccole cripte intestinali e villi e cripte coliche prevede l'esposizione della superficie mucosa, trattamento con soluzione di EDTA per allentare la centrifugazione, frazionamento (agitazione) e contatti delle cellule. Il protocollo di isolamento presentato villi intestinali/cripta è stato modificato da Belshaw et al and Whitehead et al. 17 , 18
Esponendo la superficie mucosa Abbiamo sperimentato con una serie di approcci per esporre la superficie mucosa del tratto intestinale nello sviluppo di questa procedura. Un approccio classico è quello di evert (girare dentro e fuori) il tubo, solitamente in segmenti di circa 100 mm di lunghezza, con una bacchetta di metallo che viene catturata in una piega del tessuto a un'estremità e poi il tubo restante scivolò sopra il tubo19. Per il tessuto del mouse, una bacchetta di metallo (diametro 2,4 mm) con estremità arrotondate è ideale. Questo approccio ha il vantaggio di ampliare la superficie mucosa, permettendo di raggiungere meglio di PBS ed EDTA. Inizialmente abbiamo usato questo approccio ma spostato a tagliare il tubo in breve lunghezza (circa 5 cm) e l'apertura di ogni sezione con forbici di dissezione, come questo si è rivelato più facile. Questo approccio è appropriato se solo alcuni intestini sono necessari; ma se più animali dovevano essere utilizzati in un esperimento quindi un dispositivo costruito appositamente per taglio aperto il tubo longitudinalmente, come descritto da Yoneda et al. 14 sarebbe più efficiente.
Distacco dei villi e cripte dallo strato muscolare Inizialmente abbiamo usato 3 mM EDTA in PBS e tempi di incubazione relativamente lungo fino a 60 min per allentare la superficie mucosa dal sottostante tessuto17,18. A questa concentrazione di EDTA abbiamo trovato che un tempo di incubazione di 30 minuti era sufficiente per allentare cripte da colon del mouse. Tuttavia, per l'isolamento di cripta/villo di piccolo intestino abbiamo provato con EDTA più concentrata per un tempo più breve, che ha dimostrato di essere un approccio efficace. Tutti i lavori successivi è stata intrapresa con il tessuto estratto utilizzando la tecnica di EDTA 30mm generando relative frazioni per villi o cripte. Per cripte, abbiamo riunito normalmente frazioni 3-5 prima del fissaggio, ma è importante verificare se questi sono le frazioni appropriate come gli intervalli di tempo dipenderà da una serie di fattori quali la posizione lungo il tratto intestinale, l'età di mouse, infiammazione, dieta precedente , ecc allo stesso modo, può variare la lunghezza di tempo, il tessuto ha bisogno di essere scosso a seguito del trattamento di EDTA per essere efficace in condizioni diverse. Il risultato è frazioni di tessuto isolato contenente una miscela di villi e cripte o principalmente villi o cripte (Figura 2). Come non ci sono nessun villi nel colon, l'estrazione di cripta potrebbe essere realizzabile in un solo passaggio agitando il tessuto nel tubo per 30 s. Queste frazioni possono essere quindi fisso ed elaborate per l'immuno-etichettatura.
Isolamento dei organoids intestinali dalla matrice seminterrato Isolamento dei organoids da cupole di matrice seminterrato può essere ottenuto utilizzando la soluzione di recupero di cella. La soluzione funziona da depolymerizing la matrice gelificata seminterrato ma la temperatura deve essere 2-8 ° C. Una nota di cautela è che i microtubuli dinamici potrebbero non essere mantenuti. Così, per immuno-etichettatura dei microtubuli dinamici e + consigli come la cella di EBs, recupero dalla matrice di seminterrato prima della fissazione non è raccomandato. Tuttavia, la maggior parte dei microtubuli nelle celle della differenziazione organoid sono relativamente stabile e queste sono state conservate (Figura 6). Inoltre ha funzionato bene per immuno-etichettatura di proteine centrosomali e giunzionale, nonché gli indicatori delle cellule.
Protocolli di fissazione Formaldeide (preparata da PFA) è un fissativo relativamente ad azione rapida che forma reversibile reticola e 4% PFA funziona bene per esempio, in microtubuli immuno-etichettatura e gamma-tubulina e colorazione filamenti dell'actina con falloidina. Più diluire PFA soluzioni come 1% ha funzionato bene per immuno-etichettatura per esempio, con l'indicatore di cella di marcatori Lgr5 e Paneth CD24 cellule staminali all'interno della nicchia di cellule staminali di cripta, mentre le più alte concentrazioni di PFA non hanno funzionato.
L'aggiunta di glutaraldeide dà la migliore conservazione dei microtubuli e la fissazione di PHEMO così chiamata che consiste di una miscela di 3,7% PFA, 0,05% di glutaraldeide e 0,5% detergente in PHEMO tampone (tubi di 68 mM, 25 mM HEPES, 15 mM EGTA e 3 millimetri di MgCl2)2 dà ottima conservazione dei microtubuli senza compromettere l'antigenicità. Funziona anche bene per immuno-etichettatura gamma-tubulina, β-catenina e -caderina e colorazione filamenti dell'actina con falloidina. Tuttavia, in tessuto 3D e organoid culture, la fissazione di PHEMO prodotto risultati inconsistenti e pertanto non è stata utilizzata.
Il metanolo è un fissativo coagulante che dà relativamente buona penetrazione e tende a preservare l'antigenicità. Fissazione con 100% di metanolo (-20 ° C) introduce alcune restringimento, dà conservazione moderata morfologia e funziona per i microtubuli, + consigli e molti anticorpi centrosomali compreso ninein nelle colture cellulari 2D. Tuttavia, alcuni organoids crollò quando si utilizza questo metodo di fissazione. Inoltre, penetrazione degli anticorpi attraverso intero cripte, villi o organoids era inizialmente un problema, ma l'aggiunta di un detergente 0,1% per la soluzione di lavaggio e lavaggio prolungato raggiunto risultati migliori.
Una combinazione di formaldeide e metanolo precedentemente era stata utilizzata da Rogers et al. 20 a EB1 immuno-etichetta in Drosophila. Un protocollo di fissazione basato su una miscela di formaldeide e metanolo è stato quindi sviluppato per tessuto intestinale e organoids basato su 3% formaldeide e 97% metanolo refrigerati a-20 ° C, ma omettendo il carbonato di sodio di 5 mM dalla miscela che è stato utilizzato da Rogers et al. 20 inoltre, i campioni sono stati fissati nel congelatore a-20 ° C. Questo ha funzionato particolarmente bene per l'immuno-etichettatura + suggerimenti, ad esempio CLIP-170 e l'EBs, ma anche si è rivelato eccellente per fissaggio e immuno-etichettatura microtubuli e actina all'interno del tessuto e 3D organoids. Molto buona conservazione strutturale era evidente e antigenicità è stata conservata per diverse proteine del citoscheletro e associate, nonché le proteine centrosomali come gamma-tubulina e ninein, anche se l'etichettatura per ninein lavorato più costantemente con metanolo fissazione.

Formazione di epithelia con polarità apico-basale è un processo fondamentale nello sviluppo e comporta una riorganizzazione drammatica del microtubuli e proteine centrosomali. Una matrice radiale dei microtubuli che emana da un posizione centrale microtubule centrosomal organizzazione centro (MTOC) è prominente in molte cellule animali e questo è particolarmente adatto per cellule relativamente piatte. Al contrario, le cellule epiteliali colonnari, come quelli dell'intestino, assemblare matrici dei microtubuli non radiali transcellulare che meglio supportano la forma e le funzioni specializzate di queste cellule. Questa riorganizzazione drammatica dei microtubuli avviene mediante il centrosoma trasferirsi l'apice e MTOCs non centrosomal apicale (n-MTOCs) che formano, che diventa responsabile per l'ancoraggio dei microtubuli transcellulare1,2 , 3 , 4 , 5.
Molta della nostra conoscenza di differenziazione epiteliale e la riorganizzazione di associata ai microtubuli è venuto dalle indagini di 2D in vitro strati di cellule che non vengono visualizzati l'architettura tissutale in vivo . Sviluppo di 3D in vitro organoid culture, introdotta da Clevers e colleghi di lavoro6, rappresenta un importante progresso tecnologico come imitano lo sviluppo e l'architettura in vivo . Una gerarchia di differenziazione epiteliale è evidente nell'intestino; cellule staminali nella parte inferiore delle cripte danno origine al transito immaturo amplificando le cellule che proliferano e si differenziano gradualmente durante la loro migrazione fino alla cripta sul piccolo del villo intestinale o superficie colica, dove sono diventato completamente differenziati prima di essere capannone nel lumen7. D'importanza, questo è replicato in organoids intestinale dove le cellule dalla nicchia delle cellule staminali proliferano forma cisti che successivamente generano cripta-come germogli con cellule staminali nella parte inferiore e la differenziazione di progredendo gradualmente verso la regione di ciste, che diventa campione di villo-come8. Il organoid intestinale rappresenta quindi un potente modello per studiare non solo dei microtubuli e riorganizzazione centrosomal durante la differenziazione epiteliale, ma numerose altre proteine, come pure fornendo una piattaforma ideale per lo screening di farmaci e alimenti composti del potenziale terapeutico benefici9,10.
Organoids sono adatti per vivere-imaging delle proteine fluorescenti-etichettate ed entrambi knock-in e organoids knock-out può essere generato usando CRISPR/Cas9 gene editing11,12. Tuttavia, stabilire l'espressione e la localizzazione delle proteine endogene da studiare è importante, soprattutto per verificare il comportamento delle proteine con tag. Immuno-etichettatura 3D organoids coltivate in seminterrato matrix o ex vivo isolato il tessuto è più complesso di cellule coltivate in piastre di coltura in 2D. Il protocollo di fissazione deve preservare la delicata architettura 3D dei organoids pur conservando l'antigenicità di anticorpo (cioè, gli epitopi per l'associazione di anticorpi). Ad esempio, paraformaldeide al 4% (PFA) è comunemente usato come fissativo ma mentre è un fissativo di azione relativamente rapida e dà buona conservazione morfologica, nella nostra esperienza spesso si traduce in perdita di antigenicità e non è adatto a molti centrosomali anticorpi. La capacità del fissativo e anticorpi di penetrare i tessuti e strutture 3D dovrebbe anche essere considerata. A tal fine, abbiamo modificato e sviluppati protocolli di isolamento del tessuto e indiretta immuno-etichettatura dei organoids 3D in vitro ed ex vivo isolato tessuto intestinale. Descriviamo come isolare piccole cripte intestinali e villi e tessuto colico e includere un protocollo per l'isolamento dei organoids 3D come alternativa al fissaggio e immuno-etichettatura all'interno della matrice di seminterrato. Presentiamo tre protocolli di fissazione alternativi per immuno-etichettatura dei microtubuli e proteine centrosomali, ad esempio ninein e dei microtubuli plus-fine rilevamento proteine (+ puntali), quali le proteine EB e CLIP-170 (veda inoltre riferimenti8, 13). Inoltre discutiamo i pro ei contro associato ogni protocollo.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537-500ML</td><td>soluzione di lavaggio e</td></tr><tr><td>recupero cellulare</td><td>PFA Corning</td><td>354253</td><td>isolare gli organoidi</td></tr><tr><td>Lobind Provette per microcentrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>30108116</td><td>prevenire l'adesione delle cellule</td></tr><tr><td>0,5 M Soluzione EDTA, pH 8,0</td><td>Sigma</td><td>03690-100ML</td><td>Isolamento della cripta</td></tr><tr><td>70 &mu; filtro cellulare m</td><td>Fisher Scientific</td><td>11517532</td><td>Isolare le cripte dai villi</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>siero di</td></tr><tr><td>capra</td> detergente <td>Sigma</td><td>G6767</td><td>agente bloccante</td></tr><tr><td>Siero bovino fetale (FBS)</td><td>Sigma</td><td></td><td>usato come agente antiaderente</td></tr><tr><td>Paraformaldeide, 4% in PBS</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61899</td><td>fissativo</td></tr><tr><td>Soluzione di formaldeide (36,5&ndash; 38% in H2O)</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>utilizzato come fissativo</td></tr><tr><td>Metanolo 99,9% Grado analitico</td><td>Fisher</td><td>M/4000/17</td><td>utilizzato come fissativo</td></tr><tr><td>MaxFluor Mouse su topo Kit di rilevamento dell'immunofluorescenza</td><td>Maxvision Biosciences</td><td>MF01-S</td><td>kit di immunofluorescenza commerciale; per ridurre la marcatura non specifica</td></tr><tr><td>Rotatore SB2 o SB3</td><td>Stuart</td><td></td><td>rotatore per provette per microcentrifuga</td></tr><tr><td>Recupero dell'antigene</td>del<td>citrato</td><td></td><td></td> di sodio</tr><tr><td>Hydromount</td><td>National Diagnostics</td><td>HS-106</td><td>mountant</td></tr><tr><td>DABCO - 1,4-diazabiciclo[2.2.2]ottano</td><td>Sigma</td><td>D27802</td><td>agente anti-sbiadimento</td></tr><tr><td>Permanente positivo caricato, prelavato, a 90 gradi Bordi rettificati</td><td>Chiarezza</td><td>N/C366</td><td>vetrini</td></tr> - <tr><td>Vetrino coprioggetti - spessore n. 1, 22 x 50 mm</td><td>Clarity</td><td>NQS13/2250</td><td>vetrini coprioggetti</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Matrice basale per coltura 3D di organoidi</td></tr><tr><td>Provette coniche da 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>per la lavorazione di tessuti/organoidi</td></tr><tr><td>Provette coniche da 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td>per la lavorazione di tessuti/organoidi</td></tr><tr><td>Provette LoBind da 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td>per organoidi isolati</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale anti-E caderina di topo</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td>anticorpo primario 1:500</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale di ratto anti-tubulina YL1/2 Anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab6160</td><td>anticorpo primario 1:100</td></tr><tr><td>Anticorpo alfa-tubulina di coniglio</td><td>Abcam</td><td>ab15246</td><td>anticorpo primario 1:100</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-beta-actina di coniglio</td><td>Abcam</td><td>ab8227</td><td>anticorpo primario 1:100</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale di ratto anti-p150 incollato</td><td>BD Bioscience</td><td>610473/4</td><td>anticorpo primario 1:100</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale di EB3KT36 di ratto</td><td>Abcam</td><td>ab53360</td><td>anticorpo primario 1:200</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale di topo EB1</td><td>BD Bioscience</td><td>610535</td><td>anticorpo primario 1:200</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Lgr5 di coniglio</td><td>Abgent</td><td>AP2745d</td><td>anticorpo primario 1:100</td></tr><tr><td>Dylight anti-ratto 488</td><td>Jackson</td><td>112545167</td><td>anticorpo secondario 1:400</td></tr><tr><td>Dylight anti-topo 488</td><td>Jackson</td><td>ST115545166</td><td>anticorpo secondario 1:400</td></tr><tr><td>Dylight anti-coniglio 647</td><td>Jackson</td><td></td><td>111605144 anticorpo secondario 1:400</td></tr></tbody></table>

immuno-fluorescenza etichettatura dei microtubuli e proteine centrosomali in tessuto intestinale ex vivo e 3d in vitro intestinale organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

L'avvento del 3D in vitro organoids che imitano l'in vivo del tessuto architettura e morfogenesi ha avanzato notevolmente la capacità di studiare questioni chiave biologiche in biologia cellulare e dello sviluppo. Inoltre, organoids insieme ai recenti progressi tecnici nel gene editing e consegna del gene virale promette di far avanzare la ricerca medica e sviluppo di nuovi farmaci per il trattamento di malattie. Organoids coltivato in vitro in matrice seminterrato forniscono sistemi potente modello per studiare il comportamento e la funzione delle varie proteine e sono adatti per vivere-imaging delle proteine fluorescenti-etichettate. Tuttavia, stabilire l'espressione e la localizzazione delle proteine endogene in tessuto ex vivo e in vitro organoids è importante per verificare il comportamento delle proteine con tag. A tal fine abbiamo sviluppato e modificato isolamento del tessuto, fissazione e protocolli di immuno-etichettatura per la localizzazione delle proteine centrosomali e associato di microtubuli, nel tessuto intestinale ex vivo e in vitro organoids intestinale. Lo scopo era per il fissativo di conservare l'architettura 3D del organoids/tessuto anche preservando l'antigenicità dell'anticorpo e abilitazione buona penetrazione e clearance di fissativo e anticorpi. L'esposizione al freddo depolymerizes tutti, ma i microtubuli stabili e questo è stato un fattore chiave quando si modificano i vari protocolli. Abbiamo trovato che aumentando la concentrazione di acido etilendiamminotetraacetico acido (EDTA) da 3 mM a 30 mM ha dato efficiente separazione dei villi e cripte nel piccolo intestino, mentre 3 mM EDTA era sufficiente per le cripte coliche. Il protocollo di fissazione sviluppati Formaldeide/metanolo ha dato strutturale molto buona conservazione preservando anche antigenicità per etichettatura efficace dei microtubuli, actina e le proteine che legano il fine (EB). Ha funzionato anche per la proteina centrosomal ninein anche se il protocollo di metanolo lavorato più coerente. Abbiamo inoltre stabilito che la fissazione e l'immuno-etichettatura dei microtubuli e proteine associate potrebbe essere raggiunto con organoids isolato o rimanendo all'interno della matrice di seminterrato.

Vi presentiamo i protocolli per l'isolamento di strutture 3D intestinale dal tessuto in vivo e in vitro matrice seminterrato embedded organoids e dettaglio diversi fissazione e che macchia i protocolli ottimizzati per immuno-etichettatura dei microtubuli, proteine centrosomali e giunzionale pure delle cellule indicatori compreso le proteine delle cellule staminali Lgr5.

Immuno-fluorescenza etichettatura dei microtubuli e proteine centrosomali in tessuto intestinale Ex Vivo e 3D In Vitro intestinale Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare organoidi intestinali incorporati in matrice basale 3D in vitro e successivamente fissare e immunomarcare i microtubuli e proteins. 3D centrosomica gli organoidi in vitro sono modelli ideali per lo studio di questioni biologiche chiave nella biologia cellulare e dello sviluppo. Ma localizzare le proteine e le strutture endogene nei modelli 3D è più complesso che nelle colture 2D.È importante sottolineare che il fissativo deve preservare la delicata architettura 3D preservando anche l'antigenicità degli anticorpi. I metodi presentati includono l'isolamento, la fissazione e l'immunomarcatura di organoidi intestinali in vitro 3D. Ma i protocolli di fissazione e immunomarcatura possono essere utilizzati anche in tessuti isolati ex vivo.Il vantaggio principale del protocollo di fissazione con formaldeide-metanolo presentato è che preserva le strutture 3D preservando anche l'antigenicità. Consente una buona penetrazione e clearance degli anticorpi tevel post-fissati per un'efficace marcatura dei microtubuli, dei filamenti di actina e delle proteine leganti e di diverse proteine centrosomiali, tra cui la nineina. A dimostrare la procedura saranno la dottoressa Deborah Goldspink, un postdoc formale nel mio laboratorio, e la dottoressa Zoe Matthews, co-autrice.Dopo l'isolamento delle cripte intestinali e dei villi, le strutture epiteliali isolate possono essere fissate per l'immunocolorazione. Le cripte isolate possono essere alternativamente inserite in cupole a matrice che poi formeranno organoidi. Dopo circa cinque-sette giorni di incubazione, si saranno formati gli organoidi.Utilizzare 500 microlitri di RT-PBS per lavare i pozzetti contenenti le cupole della matrice basamentale con organoidi. Quindi, aggiungere 250 microlitri di soluzione per il recupero delle celle fredde in ogni pozzetto. Successivamente, utilizzando una micropipetta P1000, raschiare le cupole della matrice del basamento e pipettare accuratamente su e giù in tutto il pozzetto per rompere e rimuovere la matrice del seminterrato dalla plastica.Assicurati che la soluzione di recupero sia fredda per aiutare a scomporre la matrice. Durante la raschiatura, utilizzare solo una micropipetta P1000 in modo da non rompere gli organoidi e che rimangano intatti. Raccogliere il surnatante in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri a basso legame.Quindi, capovolgere la provetta più volte e controllare al microscopio a volte a 50 ingrandimenti che gli organoidi siano stati isolati, si muovano liberamente e non siano in grumi. Pellettare gli organoidi mediante centrifugazione a 1.000 g e temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, rimuovere il reagente di recupero e procedere immediatamente al fissaggio.Per fissare gli organoidi precedentemente isolati con formaldeide e metanolo, risospendere gli organoidi in una soluzione fissativa di formaldeide metanolo a 20 gradi Celsius negativi. Incubare gli organoidi a meno 20 gradi Celsius in congelatore per 15 minuti, capovolgendo la provetta ogni cinque minuti. Quindi, pellettare gli organoidi mediante centrifugazione a 1.000 g per cinque minuti.Rimuovere il fissativo e quindi aggiungere la soluzione di lavaggio composta da PBS con siero di specie anticorpali secondarie all'1% o PBS con detergente allo 0,1% e siero all'1%. Dopo aver pellettato il campione come prima, rimuovere la soluzione di lavaggio e risospendere il campione in una soluzione di lavaggio fresca. Utilizzare un rotatore di tubi per lavare le celle per un totale di un'ora, pellettando gli organoidi mediante centrifugazione ogni 15 minuti e sostituendo la soluzione di lavaggio.Per bloccare i campioni di organoidi intestinali, aggiungere il 10% di siero di specie anticorpali secondarie al PBS. Pellettare gli organoidi a 1.000 g per cinque minuti e rimuovere il surnatante. Aggiungere un millilitro di soluzione bloccante a ciascun campione da incubare nei diversi anticorpi.Quindi, incubare i campioni e la soluzione bloccante su un rotatore di provette a temperatura ambiente per un'ora. Successivamente, diluire gli anticorpi primari in PBS contenenti il 10% di siero e lo 0,1% di detergente. Quindi, dopo aver centrifugato i campioni e rimosso la soluzione bloccante, utilizzare la soluzione di anticorpi primari per risospendere il pellet di organoide.Ruotare i tubi a 20 giri/min e quattro gradi Celsius durante la notte per mantenere gli organoidi in sospensione. Il giorno seguente, riportare i campioni a temperatura ambiente sul rotatore di provette per un'ora. Dopo aver centrifugato il campione, rimuovere la soluzione di anticorpi primari, aggiungere un millilitro di soluzione di lavaggio a ciascuna provetta e risospendere i pellet di organoide.Quindi, rimuovere immediatamente la soluzione mediante centrifugazione. Aggiungere un millilitro di soluzione di lavaggio fresca e mescolare le celle su un rotatore di tubi a 20 giri/min per due ore. Successivamente, diluire gli anticorpi secondari in PBS con l'1% di siero e lo 0,1% di detergente.Quindi, dopo aver pellettato il tessuto, risospendere i pellet in 200 microlitri di soluzione di anticorpi secondari. Incubare le provette su un rotatore di provette a temperatura ambiente per un'ora. Dopo la centrifuga e la rimozione del surnatante, risospendere il pellet in soluzione di lavaggio e centrifugare immediatamente i campioni per pellettare gli organoidi.Quindi, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di soluzione di lavaggio fresca. Miscelare i campioni su un rotatore di provette a temperatura ambiente per 1,5-2 ore, cambiando la soluzione di lavaggio ogni 20-30 minuti come descritto in precedenza. Per montare gli organoidi, dopo aver centrifugato e rimosso tutta la soluzione di lavaggio, aggiungere al pellet due gocce di terreno di montaggio a presa dura con reagente antisbiadimento.Tagliare l'estremità di una micropipetta P200 e risospendere con cura il pellet nel mezzo di montaggio. Quando si risolubilizzano organoidi fissati e colorati nel mezzo di montaggio, fare attenzione a non introdurre bolle. Se sono presenti bolle, lasciarle galleggiare in superficie ed evitare di trasferirle sul vetrino.Utilizzare la micropipetta per erogare gli organoidi con il mezzo di montaggio in linea lungo il centro di un vetrino da microscopio. Quindi, posizionare con cura un bicchiere di copertura sopra ed evitare di generare bolle. Posizionare il vetrino in un book di diapositive e conservarlo in frigorifero per una notte affinché il mezzo di montaggio si solidifichi prima di analizzarlo su un microscopio confocale.Qui sono mostrate le immagini della frazione due di tessuto isolato dell'intestino tenue contenente sia villi che cripte e un campione della frazione tre contenente principalmente cripte. Come si vede in queste immagini, una buona conservazione e marcatura dei microtubuli e dell'actina sia nei villi che nelle cripte è stata ottenuta con il protocollo di fissazione e immunomarcatura con formaldeide-metanolo descritto in questo video. Gli organoidi dell'intestino tenue sono stati generati e cresciuti nella matrice basale per tre settimane o più, quindi isolati come dimostrato in questo video.Le cellule differenziate all'interno dei domini dei villi organoidi contengono microtubuli apicobasali stabili che sono stati ben marcati nella maggior parte dei casi. EB1 può anche essere visto lungo il reticolo dei microtubuli. Qui è mostrato un organoide allo stadio di cisti e in una fase iniziale di sviluppo delle cripte.Entrambi i campioni sono stati fissati in formaldeide metanolo e immunomarcati per microtubuli e nineina, il che dimostra una buona conservazione e marcatura dei microtubuli nei centri di organizzazione dei microtubuli apicali non centrosomici. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita con più campioni e nell'arco di due giorni. Durante il tentativo di questa procedura, è importante raschiare accuratamente i pozzetti durante la raccolta degli organoidi per evitare di interrompere la loro struttura 3D.Inoltre, prestare attenzione quando si aggiungono o si rimuovono soluzioni per evitare la perdita di organoidi durante la procedura di colorazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come riparare, immunomarcare e montare organoidi isolati e altre strutture epiteliali come le cripte intestinali. Non dimenticare che l'utilizzo di reagenti fissativi in questa procedura può essere estremamente pericoloso.Durante l'esecuzione di questa procedura devono essere eseguite valutazioni dei rischi e devono essere sempre adottate misure di contenimento e DPI appropriate.

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Immuno-fluorescenza etichettatura dei microtubuli e proteine centrosomali in tessuto intestinale Ex Vivo e 3D In Vitro intestinale Organoids (Video) | JoVE Journal

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