Indagando i dannosi effetti di basso pressione sterilizzazione al Plasma sulla sopravvivenza di Bacillus subtilis spore utilizzando Live Cell microscopia

Questo protocollo illustra i passaggi consecutivi importanti necessari per valutare la pertinenza di monitoraggio parametri di vitalità e processi di riparazione del DNA nel rilancio di spore di Bacillus subtilis dopo il trattamento con plasma a bassa pressione di rilevamento proteine tramite microscopia confocale risolta in tempo e microscopia elettronica di esame di riparazione del DNA marcato con fluorescenza.

L'obiettivo generale di questa serie di metodi consecutivi è quello di visualizzare e monitorare i parametri di vitalità nella riparazione del DNA nel risveglio delle spore di Bacillus subtilis dopo il trattamento con plasma a bassa pressione utilizzando la microscopia a fluorescenza confocale risolta nel tempo e la microscopia elettronica a scansione. Il nostro metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'inattivazione microbica e della sterilizzazione. Ci aiuta ad analizzare l'effetto dannoso del trattamento con plasma a bassa pressione su indicatori biologici come le spore di Bacillus subtilis.

Il vantaggio principale della nostra tecnica è che combiniamo diversi metodi: la determinazione della vista, la microscopia elettronica a scansione e il monitoraggio della riparazione del DNA utilizzando la microscopia a fluorescenza con risultati temporali al fine di verificare l'effetto dannoso del trattamento al plasma a bassa pressione. Per effettuare la produzione di spore, trasferire una coltura notturna di cinque millilitri del rispettivo ceppo di B.subtilis integrata con antibiotici appropriati a 200 millilitri di terreno di sporulazione shafer liquido a doppia forza e coltivarla con un'aerazione vigorosa a 37 gradi Celsius per almeno 72 ore o più fino a quando non è stato sporulato più del 95% della coltura. Raccogliere le spore in provette da 15 millilitri mediante centrifugazione a 3000 G per 15 minuti e purificare i campioni utilizzando H2O distillato sterile in fasi di lavaggio ripetute.

Verificare la purezza e lo stato di germinazione mediante miscroscopia con contrasto facciale e assicurarsi che le sospensioni di spore siano costituite da oltre il 99% di spore luminose di fase e siano prive di cellule vegetative, spore germinate e detriti cellulari, altrimenti ulteriori esperimenti di microscopia possono essere disturbati. Determinare il titolo di spore impiattando 50 microlitri di diluizioni seriali dieci volte su agar LB per calcolare le CFU e incubare le piastre a 37 gradi Celsius durante la notte. Dopo la determinazione delle UFC, regolare il campione da 10 a 9 spore per millilitro concentrando o utilizzando acqua sterile per diluire i campioni.

Posizionare un supporto per campioni sotto forma di vetrini microscopici sterilizzati o vetrini coprioggetti rotondi da 25 millimetri all'interno dell'unità di spruzzatura di aerosol ad azionamento elettrico in allineamento con l'ugello. Trasferire la coltura di spore all'ingresso del fluido dell'ugello e iniziare la spruzzatura a 0,15 secondi con una pressione di 1,3 bar. La sospensione di spore spruzzata forma un film sottile sul vetrino microscopico che si asciuga rapidamente in pochi secondi per formare un monostrato di spore uniformemente distribuito.

Conservare i portacampioni trattati in un contenitore sterile a temperatura ambiente. Per pulire e riscaldare tutte le superfici del sistema al plasma, avviare il sistema a cinque Pascal con plasma Argon a 500 watt per cinque minuti. Il pretrattamento riduce l'adesione di molecole dall'aria ambiente come azoto, ossigeno e acqua durante lo sfiato della camera.

Dopo aver sfiatato la camera, posizionare con cura i campioni su rack di vetro al centro del contenitore del reattore. Chiudere la camera ed evacuarla. Successivamente, utilizzare il gas di processo desiderato per riempire la camera e regolare la pressione nel sistema a cinque Pascal.

Quindi, avvia il processo al plasma. Trascorso il tempo di processo definito, spegnere l'alimentazione e sfiatare accuratamente il sistema per evitare che i campioni vengano soffiati dal portacampioni. Dopo la ventilazione, rimuovere i campioni e conservarli in un contenitore sterile.

Per i controlli non trattati con plasma, esporre i campioni al vuoto solo in presenza del gas di processo equivalente al tempo di applicazione più lungo al plasma. Preparare una soluzione di acetato di polivinile o PVA al 10% sterilizzato in autoclave e utilizzarne 500 microlitri per coprire accuratamente i supporti del campione. Dopo averli lasciati asciugare all'aria per quattro ore, utilizzare una pinza sterile per rimuovere lo strato di PVA essiccato che ora contiene il campione di spore e trasferirlo in una provetta di reazione da 2 millilitri.

Aggiungere un millilitro di acqua sterile al tubo e agitarlo per sciogliere lo strato di PVA per recuperare più del 95% delle spore in grado di germinare. Utilizzare acqua sterile per diluire in serie il campione da uno a 10 in una piastra a 96 pozzetti. Dopo aver piastrato 50 microlitri di ciascuna diluizione su agar LB e aver incubato a 37 gradi Celsius per una notte, contare il numero di colonie e determinare le CFU per millilitro.

Per gli esperimenti di germinazione, preparare un tampone di agar da 1,5 libbre di spessore di un millimetro facendo bollire 700 microlitri di terreno e pipettarlo in una petridish sterile per microscopia. Dopo 10 minuti, utilizzare un bisturi sterile per ritagliare un tampone di agar LB da otto millimetri per otto millimetri per un millimetro e trasferire con cura l'agar sopra i monostrati di spore che poggiano su vetrini di vetro da 25 millimetri già montati in una camera di imaging. Il metodo dell'agar put combina due funzioni specifiche.

Stabilizza i campioni sul piano ottico durante la microscopia laser e limita il movimento laterale delle cellule. Oltre ad utilizzarlo per saggi di germinazione, questo metodo può essere applicato ad altri microrganismi e alle cellule eucariotiche. Dopo aver coperto il campione con l'agar, trasferire rapidamente il vetrino di vetro in una camera di imaging.

Conservare il campione a 37 gradi Celsius su un tavolino riscaldato durante l'intero processo di imaging. Utilizzare almeno tre repliche biologiche per ogni condizione. Dopo l'imaging dei campioni mediante scansione laser confocale automatizzata e microscopia a campo chiaro, registrare una serie di time lapse con una potenza laser del 2,6% e impostare l'apertura confocale su cinque unità aer e una frequenza di campionamento di un fotogramma ogni 30 secondi da zero a cinque ore a seconda dell'esperimento.

L'applicazione di alte dosi di luce monocromatica può inibire completamente la germinazione delle spore durante la microscopia laser. Pertanto, utilizzare l'intensità del laser e solo intervalli più lunghi ottenendo singoli fotogrammi. In caso di aggregazione delle spore, distribuzione di spore multistrato o contaminazione da particelle di polvere, potrebbe verificarsi il blocco del trattamento al plasma o l'ombreggiamento e consentire la germinazione delle spore ombreggiate.

Per eseguire la microscopia elettronica a scansione, una volta che i monostrati di spore sono stati codificati con oro palladio, è possibile visualizzare i campioni con il SEM a emissione di campo operato a una tensione di accelerazione di cinque kilovolt, incluso un rivelatore di elettroni secondari inlan per rivelare il contrasto topografico. Come mostrato in questo grafico, il trattamento al plasma delle spore di B.subtilis determina una diminuzione della sopravvivenza con l'aumentare della durata del trattamento con il plasma. Queste immagini SEM rivelano caratteristiche strutture longitudinali simili a creste, che sono costantemente visibili in tutte le spore trattate e non trattate.

Il trattamento al plasma fino a 30 secondi, non induce cambiamenti significativi della morfologia della superficie delle spore rispetto ai controlli. L'aumento della durata del trattamento al plasma porta a una superficie più granulare e si possono osservare piccole crepe e fessure nelle spore trattate per 120 o 240 secondi. In questi tempi risolti esperimenti di microscopia laser confocale a scansione, quasi tutte le spore trattate con vuoto come controllo germinano e sviluppano una morfologia cellulare a forma di bastoncello con una lunghezza piuttosto uniforme delle singole cellule.

Al contrario, le spore trattate per 15 secondi con plasma mostrano già una ridotta capacità di germinazione inferiore al 75 più o meno il quattro percento. Inoltre, le cellule crescono in bastoncelli molto lunghi o rimangono piccole e si attaccano al rivestimento delle spore. Dopo 30 secondi di trattamento al plasma, solo il 25% o meno del 6% delle spore germina e le cellule vegetative sono notevolmente ritardate nella crescita e variano in lunghezza.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante confermare la qualità dei monostrati di spore utilizzando la microscopia a contrasto di fase per garantire che non vi siano spore sovrapposte o germinanti. Dopo il suo sviluppo, il metodo dell'agar pad per la stabilizzazione dell'immagine, ha aperto la strada ai ricercatori nella sterilizzazione al plasma e nella microscopia su cellule vive. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una migliore comprensione di come preparare monostrati di spore su vetrini, determinazione dell'uso utilizzando trattamenti al plasma per l'inattivazione delle spore e condurre la microscopia elettronica a scansione e su cellule vive.

A differenza di altri metodi di decontaminazione, ad esempio l'ossido di etilene o le radiazioni gamma, la sterilizzazione al plasma è un approccio efficiente e sicuro per ridurre un numero di microrganismi indesiderati su quasi tutti i tipi di superficie.