Raccolta di post-accoppiamento sperma dal tratto riproduttivo femminile e la misurazione della liquefazione dello sperma nei topi

L'obiettivo di questo studio è determinare come raccogliere lo sperma post-accoppiamento dal tratto riproduttivo femminile e come misurare la liquefazione dello sperma nei topi. Gli animali utilizzati in questo studio sono stati gestiti secondo le linee guida del Comitato per la cura e l'uso degli animali della Washington State University e in conformità con i protocolli animali approvati dalla WSU 4702 e 4735. Nell'uomo, lo sperma eiaculato si deposita sulla parete anteriore della vagina adiacente all'ectocervice.

Nei topi, tuttavia, lo sperma viene spazzato nell'utero pochi minuti dopo l'accoppiamento. Lo sperma contiene gel seminale che si solidifica entro pochi secondi dall'eiaculazione provocando l'immobilizzazione dello sperma. Il processo di liquefazione cambia lo sperma da gelatinoso a una consistenza acquosa.

Questo processo è essenziale per la motilità degli spermatozoi e la riproduzione dei mammiferi. L'attività enzimatica dell'antigene prostatico specifico o PSA è il principale contributore alla liquefazione attraverso l'idrolisi del gel seminale o della proteina gelificante presente nel liquido seminale. La degradazione della proteina gelificante libera gli spermatozoi dal coagulo seminale, aumentando la mobilità degli spermatozoi in modo che gli spermatozoi nuotino verso il tratto riproduttivo femminile superiore per fecondare l'ovulo nelle tube di Falloppio.

Il metodo per la raccolta dello sperma dal tratto riproduttivo femminile e la misurazione del tempo di liquefazione presenti in questo studio forniranno ai ricercatori un nuovo strumento diagnostico per determinare se la liquefazione potrebbe essere una delle cause di infertilità nell'organismo modello di interesse. Successivamente ci sono le procedure in cui i topi vengono accoppiati e viene determinato il tappo vaginale. Possono essere utilizzati topi maschi adulti standard C57BL/6 o altri ceppi di interesse.

Sono state utilizzate solo femmine nella fase di estro del ciclo. Per il metodo dettagliato per lo striscio vaginale e l'analisi citologica, fare riferimento alle procedure precedentemente pubblicate. Alle quattro del pomeriggio.

Il giorno dell'estro, la femmina veniva alloggiata nella gabbia del maschio. La mattina dopo, alle otto, la femmina viene separata dalla gabbia del maschio. Utilizzando uno stuzzicadenti piatto sterile, la presenza o l'assenza di una deposizione di un tappo vaginale o copulatorio è stata valutata come indicazione di accoppiamento utilizzando una procedura adattata da un metodo precedentemente pubblicato.

La successiva è la procedura per la preparazione prima della raccolta dei tessuti. Preparare 10 millilitri di terreno L-15 di Leibovitz integrato con l'1% di siero fetale bovino o terreno L-15 più l'1% di FBS in una provetta da 15 millilitri. Riscaldare il supporto a 37 gradi Celsius per 15 minuti.

Al fine di preservare la vitalità del tessuto e dello sperma per le applicazioni a valle, aliquotare due millilitri di terreno in una provetta da due millilitri per la raccolta dei tessuti. Riscaldare il tavolino dello stereomicroscopio a 37 gradi Celsius. Imposta il blocco termico a 37 gradi Celsius.

Posizionare un tubo vuoto nel blocco termico. Riscaldare anche il vetrino a 37 gradi Celsius se l'applicazione a valle richiede l'imaging della motilità degli spermatozoi. Seguono le procedure per la raccolta dei tessuti.

Ecco gli strumenti che verranno utilizzati per la raccolta dei tessuti. Eutanasia della femmina immediatamente dopo il controllo del tappo utilizzando l'asfissia da anidride carbonica seguita da lussazione cervicale. Posizionare l'animale in posizione supina per esporre la zona addominale.

Spruzzare etanolo al 70% sull'addome. Fai un piccolo taglio di circa un centimetro sulla pelle del basso ventre. Tirare la coda e la pelle in direzioni opposte per esporre il muscolo addominale.

Tagliare il muscolo addominale a forma di V alla base dell'addome. Sposta l'intestino e il grasso addominale di lato per esporre il tratto riproduttivo. Taglia la vescica e gli altri tessuti sopra l'area vaginale.

Tagliare la sinfisi pubica per accedere ai tessuti vaginali. Tirare la parte legata alla sinfisi pubica utilizzando una pinza tubolare per esporre il canale vaginale. Sollevare il tessuto vaginale dall'apertura vaginale e utilizzare le forbici per separare il canale vaginale dal tessuto rettale sottostante.

Taglia con cura il grasso mesenterico da entrambi i lati dell'utero usando le forbici a molla. L'utero è molto fragile con lo sperma all'interno. Pertanto, l'investigatore dovrebbe fare attenzione a non perforare l'utero, altrimenti lo sperma andrà perso.

Taglia il cuscinetto adiposo ovarico da entrambi i lati delle ovaie. Trasferire l'intero tratto riproduttivo nel tubo di terreno preriscaldato. Il prossimo è il metodo per la misurazione della liquefazione dello sperma.

Ecco gli strumenti per la raccolta del seme. Trasferire tre millilitri di supporto caldo in un piatto da 3,5 centimetri. Trasferisci il fazzoletto nel piatto.

Lavare il fazzoletto più volte afferrando il cuscinetto adiposo. A questo punto, lo sperma dovrebbe essere ancora intatto all'interno dell'utero. Tampona il fazzoletto su Kimwipes per eliminare i terreni in eccesso.

Tenere il fazzoletto all'estremità vaginale e inserire il fazzoletto nel tubo preriscaldato sollevando le estremità dell'ovaio all'interno di un tubo vuoto. Taglia entrambe le corna uterine tra la vagina e l'utero. Lascia che lo sperma fuoriesca dalle corna uterine nel tubo.

Usa una pinza senza denti per spremere ed espellere delicatamente lo sperma rimasto nelle corna uterine. Far girare brevemente lo sperma per uno o due secondi. Posare il tubo parallelamente al tavolino riscaldato.

Inserire un tubo capillare da 25 microlitri nel campione di sperma con un angolo di 180 gradi. Questo per ridurre al minimo la variabilità tra ciascun investigatore che tiene il tubo capillare ad angoli diversi. Registrare il tempo impiegato dal liquido seminale per raggiungere la linea da 25 microlitri.

Il tempo di liquefazione è quantificato dal tempo impiegato per riempire il tubo capillare da 25 microlitri con lo sperma. Lo sperma raccolto dall'utero di controllo ha impiegato circa due minuti per riempire il tubo capillare. Tuttavia, lo sperma raccolto dall'utero knockout ha richiesto più di 60 minuti di tempo sperimentale.

Questi dati suggeriscono che lo sperma è significativamente più liquefatto nel controllo rispetto all'utero knockout. Ecco uno degli esempi di applicazione a valle utilizzando l'imaging video della motilità degli spermatozoi. Utilizzare un puntale per pipetta per pipettare 25 microlitri di sperma rimanente sul vetrino di vetro preriscaldato mentre il vetrino è posizionato sul tavolino di riscaldamento.

Applicare il vetrino coprioggetti con un vetrino coprioggetti. Trasferire il vetrino al microscopio posizionando il vetrino coprivetrino verso il basso. Usa l'obiettivo 20X per trovare lo sperma.

Quindi passare all'obiettivo 100X per l'imaging video. Registra il video a 12 fotogrammi al secondo per 30 secondi. Lo sperma raccolto dagli uteri di controllo mostra spermatozoi che nuotano liberamente all'interno del campo microscopico.

Tuttavia, lo sperma raccolto dall'utero knockout ha mostrato che la maggior parte degli spermatozoi erano raggruppati insieme con una mobilità minima. Questi risultati suggeriscono che lo sperma raccolto dal tratto riproduttivo femminile otto ore dopo l'accoppiamento può essere utilizzato per ulteriori analisi. Oltre a queste applicazioni a valle, i ricercatori possono anche valutare l'effetto degli inibitori o dei composti di interesse che interferiscono in diversi processi del trasporto degli spermatozoi, processi come la liquefazione degli spermatozoi, il numero di spermatozoi nel tratto, la motilità degli spermatozoi o la migrazione degli spermatozoi in diverse aree del tratto riproduttivo femminile.

I composti possono essere applicati nel tratto riproduttivo femminile prima dell'accoppiamento. Quindi, l'impatto di tali inibitori o composti può essere valutato dal campione di sperma dopo l'accoppiamento. Questo metodo può essere utile per testare la praticità dei farmaci contraccettivi che inibiscono il trasporto degli spermatozoi.