Name: Raccolta di post-accoppiamento sperma dal tratto riproduttivo femminile e la misurazione della liquefazione dello sperma nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Impara a raccogliere lo sperma post-accoppiamento dal tratto riproduttivo femminile nei topi e a misurare il tempo di liquefazione dello sperma. Questo metodo fornisce uno strumento diagnostico per studiare la fertilità.

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Questo lavoro è sostenuto dal fondo di Start-up di College di medicina veterinaria (WSU) a WW. Gli autori ringraziano Sierra Olsen (WSU) per la lettura critica di questo manoscritto.

Tutti gli animali e le procedure utilizzate in questo studio sono state gestite secondo orientamenti Comitato di uso e cura degli animali di Washington State University (WSU) e in conformità a protocolli animale WSU-approvato 4702 # e #4735.
1. topi
<ol><li>
Utilizzare standard topi del maschio adulto C57BL/6J o altri ceppi di interesse. Mantenere gli animali in un ambiente di temperatura e umidità controllata, con accesso ad libitum di acqua e cibo.
	<ol>
<li>Utilizzare riproduttori maschi che vanno da 8 settimane a 10 mesi di età. Utilizzare solo gli allevatori provati negli esperimenti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Utilizzare topi adulti femminili con un'omissione selettiva dei tessuti del tratto riproduttivo dell'estrogeno recettore α (codificata dal gene Esr1 ) in cellule epiteliali10 (Wnt7aCre / +; Esr1f/f, chiamato KO o "KO") e controllare littermates (Esr1f/f, chiamato "CTRL") in questo studio.
	<ol>
<li>Utilizzare 8 settimana-vecchio femmine. Età delle femmine varia a seconda dell'esperimento di interesse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinare le fasi del ciclo estrale la mattina alle 08:00 h. Usare solo le femmine allo stadio del ciclo di estro. Per metodi dettagliati di sbavature vaginali e analisi citologica, consultare le procedure pubblicate in precedenza11.</li>
</ol>2. accoppiamento e valutare copulatore spine
<ol><li>Al giorno di estro (16:00 h), casa la femmina nella gabbia del maschio.</li>
	<li>La mattina successiva (08:00 h), separare la femmina dal maschio mouse.</li>
	<li>Utilizzare un adattamento di un metodo precedentemente pubblicato12 per accedere la presenza o l'assenza di un plug vaginale o copulatoria come un'indicazione dell'accoppiamento.</li>
	<li>Tenere premuto il mouse femmina dalla base della coda per sollevare brevemente gli arti posteriori.</li>
	<li>Trovare la spina copulatoria dalla presenza di un coagulo seminale biancastro all'apertura vaginale utilizzando uno stuzzicadenti. Se la spina copulatoria è presente, lo stuzzicadenti non sarà in grado di essere inserito nel canale vaginale.</li>
</ol>3. preparazione prima dell'accumulazione del tessuto
<ol><li>Preparare 10 mL di mezzi di L-15 di Leibovitz, completati con 1% di siero fetale bovino (chiamato L15 media + 1% FBS) in una provetta da 15 mL. Incubare i media a 37 ° C per 15 min a bagnomaria.</li>
	<li>Al fine di preservare la vitalità del tessuto e dello sperma per applicazioni a valle, aliquotare 2 mL di pre-riscaldato L15 media + 1% FBS in una microcentrifuga 2 mL tubo per la raccolta del tessuto.</li>
	<li>Scaldare la fase dello stereomicroscopio a 37 ° C. Impostare il calore-blocco a 37 ° C e inserire un tubo del microcentrifuge vuoto 1,5 mL nel blocco.</li>
	<li>Se le applicazioni a valle richiedono imaging di motilità dello sperma, calda il vetrino a 37 ° C.</li>
</ol>4. tessuto collezione
<ol><li>Portare preriscaldata L15 media + 1% aliquota FBS alla zona di raccolta del tessuto.</li>
	<li>La femmina di eutanasia (~ 08: 30h) utilizzando anidride carbonica asfissia seguita da dislocazione cervicale. Nota: Questo è circa 8 h dopo l'accoppiamento, supponendo che l'accoppiamento avviene a mezzanotte.</li>
	<li>Metti l'animale in posizione supina per esporre la zona addominale.</li>
	<li>Spruzzare alcool al 70% sull'addome vicino arti posteriori.</li>
	<li>Utilizzare le forbici per dissezione per fare un piccolo taglio (~ 1 cm) sulla pelle dell'addome più basso.</li>
	<li>Utilizzare la mano dominante per tirare la coda (e arti posteriori se necessario) mentre la mano non dominante tira la pelle in direzione opposta (verso la testa) per esporre il muscolo addominale. Questo metodo viene utilizzato per ridurre al minimo la contaminazione di capelli agli organi viscerali.</li>
	<li>Tagliare il muscolo addominale in una forma di V alla base dell'addome, adiacente alla vagina, per esporre gli organi viscerali.</li>
	<li>Spostare gli intestini e grasso addominale verso il lato per esporre il tratto riproduttivo.</li>
	<li>Tagliare dalla vescica e altri tessuti sopra la zona vaginale.</li>
	<li>Tagliate la sinfisi pubica per ottenere l'accesso al tessuto vaginale.</li>
	<li>Sollevare il tessuto vaginale all'apertura vaginale e utilizzando forbici per separare il canale vaginale dal tessuto rettale.</li>
	<li>Tagliate accuratamente il grasso mesenterico da entrambi i lati dell'utero utilizzando forbici di primavera. Attenzione: L'utero è molto fragile con lo sperma all'interno. Fare attenzione a non perforare l'utero, altrimenti lo sperma sarà perso.</li>
	<li>Sollevare il basso tratto riproduttivo e tagliare il cuscinetto di grasso ovarico fuori entrambi i lati.</li>
	<li>Trasferire il tratto intero riproduttivo nel tubo di pre-riscaldato Leibovitz L-15 media + 1% FBS.</li>
</ol>5. misurazione della liquefazione dello sperma (viscosità) dalla raccolta contenuto uterino
<ol><li>Sul piatto riscaldato dello stereomicroscopio, trasferire i tessuti in un piatto di coltura di tessuto sterile 35 mm riempiti con 3,5 mL pre-riscaldati L-15 media + 1% FBS per pulire i tessuti di sangue e di altri contaminanti. Attenzione: Durante il lavaggio, afferrare i tessuti per il grasso, non l'utero. A questo punto, lo sperma dovrebbe essere intatto all'interno dell'utero.</li>
	<li>Asciugare i tessuti del terreno in eccesso utilizzando salviette di laboratorio.</li>
	<li>Tenere il tessuto all'estremità vaginale mentre inserendo l'estremità ovarica nel tubo del microcentrifuge pre-riscaldata. Tenendo l'estremità vaginale, tagliata i corni uterini alla base dell'utero, permettendo i corni uterini cadere nel tubo del microcentrifuge.</li>
	<li>Lasciate che lo sperma fuoriuscire i corni uterini nella provetta. Utilizzare pinze senza denti per spremere delicatamente i corni uterini dall'estremità ovarica fino alla fine vaginale, espellendo fuori lo sperma rimasto.</li>
	<li>Scartare i tessuti in sacchetto biohazard e incenerire.</li>
	<li>Si sono fermati brevemente lo sperma in un minicentrifuge (~ 1-2 s).</li>
	<li>Disporre il tubo, parallelo al piatto riscaldato - sperma non versare fuori.</li>
	<li>Hanno il timer pronto e impostare a 'contare'.</li>
	<li>Inserire un tubo capillare di 25 µ l del campione di sperma con un angolo di 180° (parallelo alla parete del tubo). Questo è per ridurre al minimo la variabilità tra ciascun investigatore da che tiene il tubo capillare in diverse angolazioni.</li>
	<li>Premere il timer, non appena il tubo capillare fa contatto con lo sperma.</li>
	<li>Registrare il tempo (s) necessario per lo sperma a raggiungere la linea di 25 µ l.</li>
	<li>Quando la misurazione è terminata, immediatamente messo il tubo contenente sperma indietro nel blocco a calore secco per ulteriori analisi funzionale, come l'imaging dei video di motilità dello sperma.</li>
	<li>Disinfettare il tubo capillare contenente sperma immergendo il tubo nella soluzione di candeggina al 10% per 20 min e scartare il tubo capillare nell'apposito contenitore.</li>
</ol>6. video Imaging di motilità dello sperma
<ol><li>Accendere il microscopio e video software di imaging.</li>
	<li>Pipettare 20 µ l di sperma restante nella diapositiva di vetro pre-riscaldato, mentre il vetrino viene collocato sul piatto riscaldato.</li>
	<li>Coprire con un vetrino coprioggetti.</li>
	<li>Posizionare il lato del vetrino coprioggetto diapositiva sul microscopio.</li>
	<li>Utilizzare 20 X Diametro obiettivo per trovare l'area di interesse.</li>
	<li>Cambiare a 100 X Diametro obiettivo per l'imaging dei video.</li>
	<li>Registrare il video a 12 fotogrammi/s (fps) per 30 s.</li>
	<li>Casualmente è possibile registrare i video in almeno 3 diverse aree per animale.</li>
	<li>Eseguire l'imaging rapidamente e minimizzare l'esposizione alla luce alla diapositiva al fine di preservare la motilità e vitalità. Nota: Questa procedura di imaging deve essere eseguita entro 2-3 min.</li>
	<li>Eseguire l'analisi di dati utilizzando software ImageJ come descritto in precedenza8.</li>
</ol>

<ol><li>Suarez, S. S., Pacey, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+transport+in+the+female+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Sperm transport in the female reproductive tract.</a> Hum Reprod Update. 12 (1), 23-37 (2006).</li>
<li>Bedford, J. M., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+sperm+motility+after+mating+in+the+rat+and+hamster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Androl%22%5BJournal%5D)">Initiation of sperm motility after mating in the rat and hamster.</a> J Androl. 13 (5), 444-449 (1992).</li>
<li>Lilja, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+semenogelin%5BTitle%5D)+AND+%22Andrologia%22%5BJournal%5D)">Cell biology of semenogelin.</a> Andrologia. 22 Suppl 1, 132-141 (1990).</li>
<li>Lilja, H., Abrahamsson, P. A., Lundwall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semenogelin%2C+the+predominant+protein+in+human+semen.+Primary+structure+and+identification+of+closely+related+proteins+in+the+male+accessory+sex+glands+and+on+the+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Semenogelin, the predominant protein in human semen. Primary structure and identification of closely related proteins in the male accessory sex glands and on the spermatozoa.</a> J Biol Chem. 264 (3), 1894-1900 (1989).</li>
<li>Veveris-Lowe, T. L., Kruger, S. J., Walsh, T., Gardiner, R. A., Clements, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seminal+fluid+characterization+for+male+fertility+and+prostate+cancer%3A+kallikrein-related+serine+proteases+and+whole+proteome+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Thromb+Hemost%22%5BJournal%5D)">Seminal fluid characterization for male fertility and prostate cancer: kallikrein-related serine proteases and whole proteome approaches.</a> Semin Thromb Hemost. (33), 87-99 (2007).</li>
<li>Emami, N., Deperthes, D., Malm, J., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+role+of+human+KLK14+in+seminal+clot+liquefaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Major role of human KLK14 in seminal clot liquefaction.</a> J Biol Chem. 283 (28), 19561-19569 (2008).</li>
<li>Gerhard, I., Roth, B., Eggert-Kruse, W., Runnebaum, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+kallikrein+on+sperm+motility%2C+capillary+tube+test%2C+and+pregnancy+rate+in+an+AIH+program%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Androl%22%5BJournal%5D)">Effects of kallikrein on sperm motility, capillary tube test, and pregnancy rate in an AIH program.</a> Arch Androl. 24 (2), 129-145 (1990).</li>
<li>Li, S., Garcia, M., Gewiss, R. L., Winuthayanon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+estrogen+for+the+mammalian+female+in+regulating+semen+coagulation+and+liquefaction+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Crucial role of estrogen for the mammalian female in regulating semen coagulation and liquefaction in vivo.</a> PLoS Genet. 13 (4), e1006743(2017).</li>
<li>Elia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+semen+hyperviscosity%3A+prevalence%2C+pathogenesis+and+therapeutic+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">Human semen hyperviscosity: prevalence, pathogenesis and therapeutic aspects.</a> Asian J Androl. 11 (5), 609-615 (2009).</li>
<li>Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uterine+epithelial+estrogen+receptor+alpha+is+dispensable+for+proliferation+but+essential+for+complete+biological+and+biochemical+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19272-19277 (2010).</li>
<li>McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performing+vaginal+lavage%2C+crystal+violet+staining%2C+and+vaginal+cytological+evaluation+for+mouse+estrous+cycle+staging+identification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification.</a> J Vis Exp. (67), e4389(2012).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/10293">Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning.</a> JoVE. , Cambridge, MA (2017).</li>
<li>Prassas, I., Eissa, A., Poda, G., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unleashing+the+therapeutic+potential+of+human+kallikrein-related+serine+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Unleashing the therapeutic potential of human kallikrein-related serine proteases.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 183-202 (2015).</li>
<li>Muytjens, C. M., Vasiliou, S. K., Oikonomopoulou, K., Prassas, I., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+functions+of+tissue+kallikrein-related+peptidases+in+vaginal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Urol%22%5BJournal%5D)">Putative functions of tissue kallikrein-related peptidases in vaginal fluid.</a> Nat Rev Urol. 13 (10), 596-607 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Raccolta di sperma da uteri del mouse possa fornire vantaggi rispetto sperma analisi in vitro come l'ex può illustrare le interazioni fisiologiche tra lo sperma e le secrezioni dal tratto riproduttivo femminile. Le tecniche presentate in questo studio permettono ai ricercatori di determinare la qualità dello sperma nonché la vitalità degli spermatozoi e la motilità in condizioni fisiologiche ideali. Inoltre, ci sono varie analisi a valle che possono essere eseguite utilizzando lo sperma raccolto dalla u...

Il tratto riproduttivo femminile comprende i tratti superiori e inferiori. Il tratto riproduttivo superiore include Tube di Falloppio, l'utero e l'endocervice. Il tratto riproduttivo inferiore comprende l'esocervice e vagina. In esseri umani, lo sperma eiaculato è depositato presso la parete anteriore della vagina, adiacente al ectocervix1. In topi, tuttavia, lo sperma è spazzato in utero pochi minuti dopo l'accoppiamento di2.
Lo sperma contiene gel seminale che si solidifica in pochi secondi di eiaculazione, causando lo sperma per essere intrappolati e immobilizzato3. Liquefazione rilascia lo sperma immobilizzato modificando lo sperma da un simil-gel ad una consistenza acquosa. Questo processo è essenziale per la motilità spermatica e la riproduzione dei mammiferi. Conoscenza della liquefazione dello sperma è principalmente basato su studi in vitro dove lo sperma diventa liquefatto in una piastra di coltura. In esseri umani, l'attività enzimatica di antigene prostatico specifico o PSA (noto anche come callicreina-correlati peptidasi 3 o KLK3) è il maggiore contributo per liquefazione attraverso idrolisi del semenogelins (gelificanti proteine presenti nel liquido seminale)4 ,5,6. Degradazione di semenogelins libera lo sperma dal coagulo seminale, aumento della mobilità degli spermatozoi. Liberate lo sperma nuotare verso le tube di Falloppio per fertilizzare l'uovo. Liquefazione (o viscosità del liquido seminale) test sono uno delle proiezioni standard iniziale per analisi del liquido seminale in cliniche di fertilità per valutare la fertilità maschile7.
Un articolo pubblicato di recente mostra che l'analisi del liquido seminale raccolto da mouse femminile tratto riproduttivo post-corrispondersi può essere utilizzato per illustrare una carenza nella liquefazione che successivamente può causare difetti di fertilità8. Liquefazione difettoso come sperma iperviscosità contribuisce a 11,8-32,3% dei casi infertili in uomini9, suggerendo che normale liquefazione è indispensabile per la riproduzione dei mammiferi. Tuttavia, studi e trattamento dei difetti di liquefazione si sono concentrati esclusivamente sul maschio7. La possibilità che il tratto riproduttivo femminile svolge un ruolo nella liquefazione dello sperma non è stata esplorata. Di conseguenza, i metodi per la raccolta dello sperma e la misurazione del tempo di liquefazione fornire ai ricercatori un nuovo strumento diagnostico per determinare se la liquefazione potrebbe essere una delle cause della sterilità nell'organismo modello di interesse.

<table><tbody><tr><td>Stuzzicadenti</td><td>Diamond</td><td>750-Flat</td><td>Autoclavato sterile, utilizzare stuzzicadenti smussato. Non utilizzare</td></tr><tr><td>forbici da dissezione</td> a punta <td>Fisher</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla</td><td>Roboz</td><td>RS-5600</td><td></td></tr><tr><td>Pinze fini</td><td>Roboz</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>25-&mu; Tubo capillare in vetro L</td><td>VWR</td><td>53432-761</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz' s Terreni L-15</td><td>Life Technologies</td> 11415064 <td>Integratore con l'1% di FBS</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga da 1,5 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga da 2 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-A</td><td></td></tr><tr><td>Riscaldatore digitale a blocco secco</td><td>VWR</td><td>13259-052</td><td>Per riscaldare la provetta per microcentrifuga prima della raccolta dello sperma</td></tr><tr><td>Minicentrifuga</td><td>Corning</td><td>LSE 6765</td><td></td></tr><tr><td>Piatto di coltura da 35 mm</td><td>VWR</td><td>10861-656</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga in polipropilene da 15 ml</td><td>VWR</td><td>10025-686</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>Precisione</td><td>TSGP05</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio a tavolino riscaldato</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ10F</td><td>Per mantenere caldo il tessuto prima di </td></tr><tr><td>Microscopio a campo chiaro</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMi8</td><td>Opzionale. Per l'imaging video della motilità degli spermatozoi</td></tr>, <tr><td>la fotocamera</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMC2900</td><td>opzionale. Per l'imaging video della motilità degli spermatozoi</td></tr><tr><td>Vetrini Fisher</td><td></td><td>12-552-3</td><td>Opzionale. Per l'imaging video della motilità degli spermatozoi</td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti</td><td>VWR</td><td>48393-059</td><td>Opzionale. Per l'imaging video della motilità degli spermatozoi</td></tr>, <tr><td>candeggina</td><td></td><td></td>, <td>diluire in dH2O al 10% di concentrazione</td></tr></tbody></table>

raccolta di post-accoppiamento sperma dal tratto riproduttivo femminile e la misurazione della liquefazione dello sperma nei topi

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

In topi, sperma eiaculato è depositato nell'utero. Dopo l'eiaculazione, lo sperma cambia consistenza da gel-like a acquoso, un processo chiamato liquefazione. In questo studio, mostriamo come raccogliere il post-eiaculato sperma dal tratto riproduttivo femminile in un modello murino. In primo luogo, adulti topi femminili in fase di estro sono stati alloggiati nella gabbia del maschio durante la notte. La mattina successiva, copulazione è stata confermata dalla presenza di copulatoria spina all'apertura vaginale. I topi femminili con spine copulatore sono stati eutanasizzati e ogni tratto riproduttivo è stato raccolto nel suo complesso (vagina, utero, ovidotti, ovaie), garantendo un sistema chiuso per contenere lo sperma. Il tratto riproduttivo è stato disposto in una microcentrifuga da 1,5 mL, e la vagina è stata tagliata fuori per liberare il suo sperma nel tubo. Per garantire il volume di sperma massimo per l'analisi, senza denti forcipe sono stato utilizzato per spremere i corni uterini da ovarico fine a fine vaginale espellendo lo sperma restante. Il tratto intero riproduttivo è stato poi scartato. Il tubo che contiene lo sperma era filato brevemente verso il basso. Una pipetta capillare 25 μL è stato disposto nel tubo ad un angolo di 180° (parallela alla parete del tubo). La quantità di tempo utilizzato per riempire il tubo capillare alla riga 25 μL è stata registrata. Sperma da un allevatore provato maschio di solito prende circa 60-180 s per riempire un tubo capillare di 25 μL. Questa tecnica di raccolta dello sperma è utilizzabile anche in altre applicazioni a valle quali analisi di imaging e la motilità dello sperma.

Lo sperma è stato raccolto da CTRL e KO femmine circa 8 h dopo l'accoppiamento con i maschi fertili di CTRL. Liquefazione (o viscosità del liquido seminale) è quantificata mediante il tempo impiegato per riempire il tubo capillare di 25 μL di sperma. Lo sperma raccolto da uteri di CTRL preso 2,06 ±0.12 min (mean±S.E.M, n = 5) per riempire il tubo capillare (Figura 1). Tuttavia, lo sperma raccolto da uteri di KO ha avuto più di 60 min (60,0 ' di ± 0.0, mean±S.E.M, n = 5) di ...

Liquefazione dello sperma è richiesto per gli spermatozoi di essere liberato dal gel seminale. Questo studio fornisce le procedure per la raccolta dello sperma dal post-coito tratto riproduttivo femminile e misurazione del tempo di liquefazione dello sperma.

Raccolta di post-accoppiamento sperma dal tratto riproduttivo femminile e la misurazione della liquefazione dello sperma nei topi

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

L'obiettivo di questo studio è determinare come raccogliere lo sperma post-accoppiamento dal tratto riproduttivo femminile e come misurare la liquefazione dello sperma nei topi. Gli animali utilizzati in questo studio sono stati gestiti secondo le linee guida del Comitato per la cura e l'uso degli animali della Washington State University e in conformità con i protocolli animali approvati dalla WSU 4702 e 4735. Nell'uomo, lo sperma eiaculato si deposita sulla parete anteriore della vagina adiacente all'ectocervice.Nei topi, tuttavia, lo sperma viene spazzato nell'utero pochi minuti dopo l'accoppiamento. Lo sperma contiene gel seminale che si solidifica entro pochi secondi dall'eiaculazione provocando l'immobilizzazione dello sperma. Il processo di liquefazione cambia lo sperma da gelatinoso a una consistenza acquosa.Questo processo è essenziale per la motilità degli spermatozoi e la riproduzione dei mammiferi. L'attività enzimatica dell'antigene prostatico specifico o PSA è il principale contributore alla liquefazione attraverso l'idrolisi del gel seminale o della proteina gelificante presente nel liquido seminale. La degradazione della proteina gelificante libera gli spermatozoi dal coagulo seminale, aumentando la mobilità degli spermatozoi in modo che gli spermatozoi nuotino verso il tratto riproduttivo femminile superiore per fecondare l'ovulo nelle tube di Falloppio.Il metodo per la raccolta dello sperma dal tratto riproduttivo femminile e la misurazione del tempo di liquefazione presenti in questo studio forniranno ai ricercatori un nuovo strumento diagnostico per determinare se la liquefazione potrebbe essere una delle cause di infertilità nell'organismo modello di interesse. Successivamente ci sono le procedure in cui i topi vengono accoppiati e viene determinato il tappo vaginale. Possono essere utilizzati topi maschi adulti standard C57BL/6 o altri ceppi di interesse.Sono state utilizzate solo femmine nella fase di estro del ciclo. Per il metodo dettagliato per lo striscio vaginale e l'analisi citologica, fare riferimento alle procedure precedentemente pubblicate. Alle quattro del pomeriggio.Il giorno dell'estro, la femmina veniva alloggiata nella gabbia del maschio. La mattina dopo, alle otto, la femmina viene separata dalla gabbia del maschio. Utilizzando uno stuzzicadenti piatto sterile, la presenza o l'assenza di una deposizione di un tappo vaginale o copulatorio è stata valutata come indicazione di accoppiamento utilizzando una procedura adattata da un metodo precedentemente pubblicato.La successiva è la procedura per la preparazione prima della raccolta dei tessuti. Preparare 10 millilitri di terreno L-15 di Leibovitz integrato con l'1% di siero fetale bovino o terreno L-15 più l'1% di FBS in una provetta da 15 millilitri. Riscaldare il supporto a 37 gradi Celsius per 15 minuti.Al fine di preservare la vitalità del tessuto e dello sperma per le applicazioni a valle, aliquotare due millilitri di terreno in una provetta da due millilitri per la raccolta dei tessuti. Riscaldare il tavolino dello stereomicroscopio a 37 gradi Celsius. Imposta il blocco termico a 37 gradi Celsius.Posizionare un tubo vuoto nel blocco termico. Riscaldare anche il vetrino a 37 gradi Celsius se l'applicazione a valle richiede l'imaging della motilità degli spermatozoi. Seguono le procedure per la raccolta dei tessuti.Ecco gli strumenti che verranno utilizzati per la raccolta dei tessuti. Eutanasia della femmina immediatamente dopo il controllo del tappo utilizzando l'asfissia da anidride carbonica seguita da lussazione cervicale. Posizionare l'animale in posizione supina per esporre la zona addominale.Spruzzare etanolo al 70% sull'addome. Fai un piccolo taglio di circa un centimetro sulla pelle del basso ventre. Tirare la coda e la pelle in direzioni opposte per esporre il muscolo addominale.Tagliare il muscolo addominale a forma di V alla base dell'addome. Sposta l'intestino e il grasso addominale di lato per esporre il tratto riproduttivo. Taglia la vescica e gli altri tessuti sopra l'area vaginale.Tagliare la sinfisi pubica per accedere ai tessuti vaginali. Tirare la parte legata alla sinfisi pubica utilizzando una pinza tubolare per esporre il canale vaginale. Sollevare il tessuto vaginale dall'apertura vaginale e utilizzare le forbici per separare il canale vaginale dal tessuto rettale sottostante.Taglia con cura il grasso mesenterico da entrambi i lati dell'utero usando le forbici a molla. L'utero è molto fragile con lo sperma all'interno. Pertanto, l'investigatore dovrebbe fare attenzione a non perforare l'utero, altrimenti lo sperma andrà perso.Taglia il cuscinetto adiposo ovarico da entrambi i lati delle ovaie. Trasferire l'intero tratto riproduttivo nel tubo di terreno preriscaldato. Il prossimo è il metodo per la misurazione della liquefazione dello sperma.Ecco gli strumenti per la raccolta del seme. Trasferire tre millilitri di supporto caldo in un piatto da 3,5 centimetri. Trasferisci il fazzoletto nel piatto.Lavare il fazzoletto più volte afferrando il cuscinetto adiposo. A questo punto, lo sperma dovrebbe essere ancora intatto all'interno dell'utero. Tampona il fazzoletto su Kimwipes per eliminare i terreni in eccesso.Tenere il fazzoletto all'estremità vaginale e inserire il fazzoletto nel tubo preriscaldato sollevando le estremità dell'ovaio all'interno di un tubo vuoto. Taglia entrambe le corna uterine tra la vagina e l'utero. Lascia che lo sperma fuoriesca dalle corna uterine nel tubo.Usa una pinza senza denti per spremere ed espellere delicatamente lo sperma rimasto nelle corna uterine. Far girare brevemente lo sperma per uno o due secondi. Posare il tubo parallelamente al tavolino riscaldato.Inserire un tubo capillare da 25 microlitri nel campione di sperma con un angolo di 180 gradi. Questo per ridurre al minimo la variabilità tra ciascun investigatore che tiene il tubo capillare ad angoli diversi. Registrare il tempo impiegato dal liquido seminale per raggiungere la linea da 25 microlitri.Il tempo di liquefazione è quantificato dal tempo impiegato per riempire il tubo capillare da 25 microlitri con lo sperma. Lo sperma raccolto dall'utero di controllo ha impiegato circa due minuti per riempire il tubo capillare. Tuttavia, lo sperma raccolto dall'utero knockout ha richiesto più di 60 minuti di tempo sperimentale.Questi dati suggeriscono che lo sperma è significativamente più liquefatto nel controllo rispetto all'utero knockout. Ecco uno degli esempi di applicazione a valle utilizzando l'imaging video della motilità degli spermatozoi. Utilizzare un puntale per pipetta per pipettare 25 microlitri di sperma rimanente sul vetrino di vetro preriscaldato mentre il vetrino è posizionato sul tavolino di riscaldamento.Applicare il vetrino coprioggetti con un vetrino coprioggetti. Trasferire il vetrino al microscopio posizionando il vetrino coprivetrino verso il basso. Usa l'obiettivo 20X per trovare lo sperma.Quindi passare all'obiettivo 100X per l'imaging video. Registra il video a 12 fotogrammi al secondo per 30 secondi. Lo sperma raccolto dagli uteri di controllo mostra spermatozoi che nuotano liberamente all'interno del campo microscopico.Tuttavia, lo sperma raccolto dall'utero knockout ha mostrato che la maggior parte degli spermatozoi erano raggruppati insieme con una mobilità minima. Questi risultati suggeriscono che lo sperma raccolto dal tratto riproduttivo femminile otto ore dopo l'accoppiamento può essere utilizzato per ulteriori analisi. Oltre a queste applicazioni a valle, i ricercatori possono anche valutare l'effetto degli inibitori o dei composti di interesse che interferiscono in diversi processi del trasporto degli spermatozoi, processi come la liquefazione degli spermatozoi, il numero di spermatozoi nel tratto, la motilità degli spermatozoi o la migrazione degli spermatozoi in diverse aree del tratto riproduttivo femminile.I composti possono essere applicati nel tratto riproduttivo femminile prima dell'accoppiamento. Quindi, l'impatto di tali inibitori o composti può essere valutato dal campione di sperma dopo l'accoppiamento. Questo metodo può essere utile per testare la praticità dei farmaci contraccettivi che inibiscono il trasporto degli spermatozoi.

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Raccolta di post-accoppiamento sperma dal tratto riproduttivo femminile e la misurazione della liquefazione dello sperma nei topi

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