Induzione della ricombinazione di Cre-lox nella corteccia cerebrale del Mouse attraverso elettroporazione In Utero

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare un mosaico genetico nella corteccia cerebrale del topo inducendo la ricombinazione Cre-Lox attraverso l'elettroporazione in utero. Questo metodo di generazione di mosaici genetici può aiutare a rispondere a domande chiave in neurobiologia. Come determinare se un gene è necessario per un dato fenotipo neuronale in modo autonomo dalla cellula.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'efficace sistema di ricombinazione Cre-Lox è combinato con una tecnica di consegna genica altrettanto efficace nell'elettroporazione in utero. Sebbene questo metodo sia focalizzato sul targeting dei neuroni corticali di livello due-tre, può essere utilizzato per colpire i neuroni in altre profondità degli strati corticali. Quando abbiamo cercato di creare mosaici genetici nel nostro tessuto cerebrale, abbiamo incontrato diversi problemi nel far sopravvivere i nostri animali da esperimento dopo la nascita, quindi abbiamo introdotto diverse semplificazioni e perfezionamenti alla nostra tecnica.

Preparare una pipetta con una conicità molto lunga e una punta molto fine, tipica delle pipette per l'iniezione di cellule staminali embrionali o il trasferimento nucleare, inserendo prima il capillare di vetro nell'estrattore per pipette. Dopo aver fissato i morsetti, attivare il programma al protocollo di trazione, creando una rastremazione sul capillare di vetro. Assicurarsi che la lunghezza della conicità sia compresa tra 10 e 15 mm utilizzando un microscopio ottico composto.

Successivamente, per rompere la punta della pipetta, centrare un task task a strato singolo, strofinare su un becher da 50 ml e tenderlo con una mano. Con l'altra mano, spingere la pipetta estratta, con il cono rivolto verso il basso, perpendicolarmente attraverso il centro della salvietta provocando una rottura netta della conicità. Controllare le dimensioni dell'apertura al microscopio ottico composto.

Quindi calibrare la pipetta aspirando 1 mcL di blu di tripano allo 0,4% e PBS in una pipetta parzialmente riempita e graduare la pipetta con marcature di 1 mcL in base all'altezza di 1 mcL nella pipetta. Utilizzare la pipetta calibrata per graduare altre pipette estratte prima di scartarle. Posizionare le pipette nel portapipette libere da polvere e altre particelle.

Dopo aver anestetizzato profondamente una topolina incinta a E-15.5, testare il riflesso di raddrizzamento inclinando delicatamente la camera di induzione e notando la risposta del topo. Se il riflesso di raddrizzamento è assente, trasferire il topo nell'area di preparazione chirurgica e somministrare isoflurano inalato attraverso un cono nasale per mantenere un piano chirurgico di anestesia. Utilizzare una pinza per testare il riflesso del pedale per verificare l'anestesia.

Monitorare la frequenza respiratoria durante lo sforzo, cercando una respirazione profonda e regolare e che le mucose siano di colore rosa e umide. Applicare una quantità sufficiente di unguento oftalmico veterinario sugli occhi per coprirli completamente per proteggerli dalla secchezza. Massaggiare la crema depilatoria sulla zona addominale con tamponi di cotone fino a quando il pelo addominale non si scioglie.

Quindi rimuovere il pelo addominale. Pulire accuratamente eventuali residui e la crema depilatoria con etanolo al 70% e tamponi di cotone. Applicare la soluzione scrub a base di iodio sulla zona addominale con un movimento circolare.

Quindi utilizzare un telo chirurgico per isolare l'area chirurgica e mantenere le condizioni sterili. Dopo aver praticato un'incisione ventrale della linea mediana di 2 cm nella pelle, trovare la linea alba per visualizzare la linea mediana del retto dell'addome. Tirare il muscolo verso l'alto e lontano dall'addome e praticare un'incisione della linea mediana di 2 cm per esporre la cavità addominale utilizzando tecniche asettiche.

Utilizzando un puntale per micropipetta sterile da 10 mcL, erogare il carprofene nella cavità addominale per l'analgesia. Quindi, clamp una pinza per zanzare Hartmann sul bordo sinistro dell'incisione del retto addominale. Appoggiare la pinza sulla capsula di Petri capovolta a sinistra dell'incisione, mantenendo aperto il lato sinistro dell'incisione.

Dopo aver bloccato il lato destro dell'incisione in modo simile, posizionare una spugna di garza attorno all'area dell'incisione. Usando una pinza ad anello senza una vite di limite attaccata, tirare l'utero tra due embrioni vicini senza schiacciare o ferire alcun tessuto. Inizia a estrarre tutti gli embrioni attraverso l'incisione, adagiandoli sopra la spugna di garza.

Collegare una pipetta calibrata al tubo di aspirazione e iniettare esattamente 1 mcL di soluzione di DNA preparata attraverso la parete uterina in un ventricolo laterale di ciascun embrione. Usa il pollice e l'indice per manipolare gli embrioni, consentendo agli embrioni di essere spinti delicatamente contro la parete uterina durante l'iniezione. I ventricoli laterali appaiono come due macchie più scure sul telencefalo dorsale dell'embrione.

Confermare l'avvenuta iniezione osservando il blu di tripano che riempie il ventricolo laterale. Dopo aver iniettato tutti gli embrioni, posizionare il catodo di elettrodi a pinzetta sull'utero, direttamente sopra la corteccia mediale e caudale per colpire la corteccia visiva. Posizionare l'anodo appena sotto e anteriormente alla testa dell'embrione.

Con il pedale, attivare l'erogazione di impulsi di 550 ms di 50 volt separati da un intervallo di 950 ms. Dopo aver elettroporicato tutti gli embrioni, riportare l'utero nella cavità addominale con lo stesso orientamento in cui è stato trovato. Utilizzare la soluzione salina per lubrificare l'utero guidandolo manualmente ed estremamente delicatamente, facendo attenzione a non spostare gli embrioni dalla loro posizione nell'utero.

Chiudere i muscoli addominali con punti di sutura riassorbibili. Usa un semplice punto interrotto, legando le estremità con un nodo da chirurgo. Chiudere lo strato cutaneo con punti di sutura riassorbibili.

Applicare una piccola quantità di adesivo per tessuti per sigillare la ferita. Applicare l'adesivo in tessuto sui nodi per evitare che si sgancino. Utilizzare una micropipetta per rimuovere l'eventuale adesivo tissutale che circonda la ferita che può essere aspirato.

Una volta che l'adesivo del tessuto è asciutto, rimuovere l'animale dall'isoflurano e lasciare che la femmina si riprenda da sola in una gabbia calda. Continuare a monitorare il mouse fino a quando non si è completamente ripreso e non si comporta normalmente. Una volta rimossa, rimetti la femmina in gabbia con il maschio.

Posiziona il teschio su una superficie piana con salviette da lavoro a strato singolo inumidite con 1-x PBS. Usando una pinzetta, rimuovi prima l'osso occipitale. Quindi rimuovere con cura le ossa parietali, rimuovendo le pinzette e allontanandole dalla superficie del cervello.

Rimuovere con cura eventuali meningi per evitare danni alla corteccia. Incastra la parte posteriore delle pinzette sotto il cervello lungo il cranio per recidere i nervi cranici e rimuovere il cervello. Utilizzare una lama di rasoio a filo singolo per eseguire un taglio coronale di circa 0,5 mm rostrale al bregma e un altro taglio coronale di circa 0,5 mm caudale al tessuto di interesse.

Il blocco di tessuto è ora pronto per il sezionamento. L'iniezione di 1 mcL di 2 mg/mL di GFP Cre determina una distribuzione sparsa di cellule marcate, alcune delle quali possono essere luminose. Poiché il tessuto viene sezionato a 100 micron, la maggior parte degli alberi dendritici viene conservata.

Quando l'elettroporazione in utero viene eseguita al giorno embrionale 15.5, la marcatura avviene attraverso gli strati corticali due e tre. Le spine dendritiche possono essere osservate ad alti ingrandimenti. L'iniezione di 1,5 mcL di 2 mg/mL di GFP Cre determina una marcatura molto densa, che può essere non ottimale in quanto è difficile rintracciare la fonte di neuriti e spine dendritiche.

Tuttavia, selezionando una cella luminosa alla periferia dell'area marcata, è ancora possibile visualizzare un neurone e i suoi processi. In alternativa, l'iniezione di costrutti SuperNova si traduce in una distribuzione sparsa di neuroni di strato due-tre che sono marcati in modo molto brillante. Una volta padroneggiata, l'intervento di elettroporazione in utero richiederà meno di 30 minuti se eseguito correttamente.

Mentre si tenta questa procedura con altri costrutti di DNA, è importante ricordare di provare diverse concentrazioni e volumi, questo aiuterà a raggiungere la scarsità di marcatura desiderata richiesta per l'analisi del mosaico. I nostri risultati rappresentativi hanno utilizzato un singolo costrutto o un costrutto SuperNova di recente invenzione. In quest'ultimo, abbiamo scoperto che potremmo ottenere un'eccellente marcatura sparsa, massimizzando al contempo la luminosità dei neuroni.

Questa tecnica potrebbe essere adattata per creare tessuto cerebrale a mosaico in altri modi. Ad esempio, l'editing genetico CRISPR e Cas9 può essere combinato con l'elettroporazione in utero, oppure la ricombinazione Cre-Lox può essere combinata con l'iniezione intraventricolare di vettori virali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di diverse tecniche semplificate e raffinate utilizzate per ottenere un mosaico genetico sparso, in modo da poter combinare insieme la ricombinazione Cre-Lox e l'elettroporazione in utero.

Vi auguriamo buona fortuna.