In Vivo Valutazione dello sviluppo di callo di frattura durante la guarigione dell'osso nei topi utilizzando un MRI-compatibile con osteosintesi per il femore di Mouse

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di utilizzare l'imaging a risonanza magnetica, o MRI, per la valutazione longitudinale dello sviluppo del callo di frattura murina durante la guarigione ossea. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della guarigione ossea, come ad esempio come si sviluppano i calli di frattura nel tempo in diversi modelli murini. I principali vantaggi di questa tecnica sono che lo sviluppo del callo di frattura può essere monitorato in vivo in tempo reale e che il fissatore esterno applicato fornisce un modello di guarigione della frattura altamente standardizzato.

A dimostrare la procedura di risonanza magnetica sarà Anne Subgang, un tecnico della struttura Small Animal Imaging Core. Prima di iniziare la procedura, confermare il livello appropriato di sedazione in caso di mancata risposta al pizzicamento delle dita dei piedi e iniettare nel topo per via sottocutanea una singola dose di antibiotici in un deposito di liquidi di due volte 250 microlitri di cloruro di sodio allo 0,9%. Applicare un unguento sugli occhi dell'animale e posizionare il mouse su un termoforo a 37 gradi Celsius.

Rimuovere il pelo dall'arto posteriore destro e strofinare l'area chirurgica con un disinfettante a base di alcol. Posizionare un telo sterile sull'animale lasciando esposta l'area chirurgica e coprire la zampa posteriore destra con un pezzetto di un guanto sterile. Strofinare l'area chirurgica altre tre volte con disinfettante.

Quindi, utilizzando un bisturi sterilizzato in autoclave, praticare un'incisione cutanea longitudinale di circa un centimetro lungo il lato interno del femore destro e utilizzare micro forbici e pinze per separare senza mezzi termini i muscoli bicipite femorale e vasto laterale. Tagliare l'inserzione tendinea in corrispondenza del trocantere femorale per consentire il libero accesso alla parte anterolaterale dell'osso avendo cura che il nervo sciatico sia preservato, e posizionare il fissatore esterno parallelamente al femore. Utilizzando una punta da trapano da 0,45 millimetri, praticare manualmente dei fori attraverso la corteccia.

E partendo dalle estremità più prossimali e distali, posizionare i perni di montaggio in ceramica nei fori. Quando tutti i perni sono stati posizionati, umidificare l'osso con un piccolo volume di soluzione fisiologica sterile e utilizzare una sega a filo Gigli da 0,4 millimetri per creare un'osteotomia da 0,4 millimetri attraverso l'osso del foro tra i due perni interni. Sciacquare accuratamente la fessura dell'osteotomia con due millilitri di soluzione fisiologica sterile per rimuovere eventuali frammenti ossei tra le due cortecce fratturate e utilizzare una sutura riassorbibile continua per adattare i muscoli seguita dall'adattamento della pelle con suture interrotte non riassorbibili.

Quindi, pulire l'area chirurgica con un disinfettante e riportare il topo nella sua gabbia monitorandolo fino al completo recupero. Già tre giorni dopo l'intervento, inserire con cura il fissatore esterno in un dispositivo di montaggio su misura e posizionare il topo anestetizzato su una culla a temperatura controllata per l'introduzione nel dispositivo MRI. Fissare rigidamente il fissatore esterno al dispositivo di montaggio sulla bobina di testa a quattro elementi e utilizzare un sistema di risonanza magnetica dedicato per piccoli animali ad alto campo operante a 11,7 tesla per applicare una sequenza di eco turbo-spin multi-sliced a densità di protoni e soppressa nel grasso alla frattura.

Quando tutte le immagini sono state acquisite, aprire i dati nel software di analisi delle immagini appropriato e inserire la dimensione del voxel come 0,05 x 0,05 x 0,35 millimetri cubi. Per segmentare i diversi tessuti del callo di frattura con la soglia semiautomatica in base alla loro intensità, fare clic sul campo Modifica nuova etichetta e fare clic su Aggiungi materiale. Rinomina il materiale in callo e usa lo strumento lazo per distinguere l'area del callo dai tessuti circostanti in base al segnale ipointenso proveniente dal periostio.

Fare clic su Aggiungi al materiale, quindi fare clic su Aggiungi materiale e rinominare il materiale in cartilagine. Utilizzando lo strumento soglia, segmentare la cartilagine e selezionare solo il materiale corrente dal callo. Quindi, fare clic su cartilagine e Aggiungi al materiale.

Quando tutti i tessuti sono stati segmentati, fare clic su Genera superficie, applicare Nessuno per il tipo di levigatura e fare clic su Vista superficie per generare ricostruzioni 3D dei femori fratturati in base ai dati di segmentazione dei tessuti. Una procedura chirurgica di successo può essere confermata dalla risonanza magnetica della frattura che mostra tutti e quattro i perni al centro della diafisi femorale con uno spazio per l'osteotomia compreso tra 0,3 e 0,5 millimetri. Il 10° giorno dopo l'intervento, la valutazione delle scansioni longitudinali durante il processo di guarigione della frattura rivela tessuto cartilagineo al centro del callo della frattura e tessuto osseo alla periferia della frattura.

Sia il tessuto cartilagineo che quello osseo aumentano fino al giorno 14. Il tessuto cartilagineo diminuisce quindi fino al giorno 21, momento in cui si può osservare un ponte osseo. Dopo la segmentazione dei diversi tessuti nel callo di frattura, come appena dimostrato, è possibile generare un'intera scansione 3D del femore con la corteccia matura che appare in grigio, i perni in ceramica contrassegnati in giallo, il tessuto molle del callo in verde, il tessuto cartilagineo in rosso e il tessuto osseo del callo indicato in viola.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come applicare un fissatore esterno al femore del topo per creare l'osteotomia del femore e inserire un topo in un dispositivo di risonanza magnetica per garantire una posizione di scansione standardizzata. Una volta padroneggiata, l'applicazione del fissatore esterno e la tecnica dell'osteotomia possono essere completate entro 20-30 minuti se eseguite correttamente.