Prova di tolleranza di glucosio intraperitoneale, misura della funzione polmonare e la fissazione del polmone per studiare l'impatto dell'obesità e metabolismo alterato sugli esiti polmonare

L'obiettivo generale dei seguenti tre metodi è studiare l'impatto dell'obesità e dei disturbi metabolici sulla struttura e la funzione polmonare. Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca respiratoria sull'impatto dei disturbi metabolici sulla struttura e sulla funzione polmonare. Il vantaggio di queste tecniche è che possono essere combinate per valutare il ruolo funzionale del metabolismo sulla patogenesi delle malattie polmonari croniche e per testare diversi approcci terapeutici.

Le implicazioni di queste tecniche si estendono oltre la fenotipizzazione a ciò che sta chiarendo il ruolo funzionale specifico dei bersagli metabolici nella patogenesi delle malattie polmonari. Questi metodi possono essere applicati anche allo studio della struttura e della funzione sia in animali sani con modificazioni genetiche ma anche in modelli animali di BPCO e asma. In generale, gli individui che non conoscono questi metodi avranno difficoltà poiché l'inserimento del tubo tracheale, l'insufflazione del polmone e la somministrazione dell'anestesia profonda, richiedono tutti esperienza e formazione.

Abbiamo avuto l'idea di questi metodi quando abbiamo scoperto che l'obesità ad esordio precoce nei topi ma anche negli esseri umani era intimamente legata all'impatto del metabolismo e alle malattie polmonari croniche oltre l'infanzia. Per misurare la tolleranza al glucosio intraperitoneale, trattenere delicatamente un topo adulto a digiuno di 12 ore per la coda e utilizzare forbici sterili per incidere la punta della coda. Applicare immediatamente una goccia di sangue a flusso libero sulla striscia reattiva del glucometro per misurare il livello di glucosio nel sangue a digiuno.

Il risultato del test apparirà sullo schermo del glucometro dopo quattro secondi. Dopo aver misurato il glucosio per ogni animale, etichettarli singolarmente con pennarelli colorati e pesare gli animali. Quindi utilizzare un ago calibro 27 collegato a una siringa da un millilitro per somministrare 100 microlitri di glucosio per tonnellata di peso corporeo a ciascun animale tramite iniezione intraperitoneale e misurare i livelli di glucosio nel sangue 15, 30, 60 e 120 minuti dopo con nuove strisce reattive come appena dimostrato.

Per valutare la funzione polmonare, posizionare un topo adulto in posizione supina su un tappetino e applicare un unguento sugli occhi dell'animale. Dopo aver confermato la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita, bagnare il pelo nella regione tiroidea con etanolo al 70% e utilizzare una pinza per sollevare la pelle sulla linea mediana tra la tacca giugulare sullo sterno e la sinfisi del tubero del mento. Usando le forbici smussate, praticare con cura un'incisione cutanea di un centimetro nella pelle tesa per visualizzare il tessuto adiposo sottocutaneo sottostante e la ghiandola tiroidea ed esporre la trachea con un'attenta separazione smussata di entrambi i lobi tiroidei all'istmo e la dissezione dei muscoli sternotiroidei e sternotiroidei.

Usando una pinza affilata, passare una sutura chirurgica intrecciata 4-0 tra la trachea e l'esofago e incidere con cura la trachea vicino alla laringe tra le cartilagini tracheali con microforbici. Intubare con un tubo tracheale che fissa il tubo con una sutura chirurgica e spostare l'animale sul letto riscaldato di una camera del corpo. Collegare il tubo tracheale alla piastra frontale e accendere il ventilatore.

Confermare il movimento del torace contemporaneamente alla velocità di ventilazione per confermare il corretto posizionamento del tubo tracheale e osservare il segnale di pressione sullo schermo del computer. Per controllare le variazioni della pressione transpolmonare durante la ventilazione, inserire un tubo esofageo a livello dei polmoni guardando lo schermo per facilitare il posizionamento del tubo dove si può osservare la massima deflessione della pressione e il minimo artefatto cardiaco. Iniziare l'acquisizione dei dati secondo le istruzioni del produttore e applicare 10 microlitri di PBS sul nebulizzatore.

Iniziare la nebulizzazione dopo cinque minuti di acclamazione seguita da una fase di risposta di tre minuti durante la quale vengono misurate la resistenza delle vie aeree e la compliance del sistema respiratorio. Lasciare che l'animale si riprenda per tre minuti prima di iniziare la nebulizzazione successiva e seguire le istruzioni del software per l'applicazione graduale di concentrazioni crescenti di 10 microlitri di metacolina sul ventilatore. Per l'analisi istomorfometrica quantitativa del tessuto polmonare, utilizzare le forbici smussate per praticare una piccola incisione nel diaframma di un topo adulto e utilizzare le forbici smussate curve per praticare un'incisione peristernale lungo l'intera lunghezza della gabbia toracica per aprire delicatamente il torace.

Sollevare la gabbia toracica per esporre la cavità pleurica e rimuovere il timo. Dopo aver rimosso il cuore, utilizzare una pinza affilata per preparare ed esporre la trachea al fine di far passare una sutura chirurgica intrecciata 4-0 tra la trachea e l'esofago seguita da un'attenta incisione della trachea vicino alla laringe tra le cartilagini tracheali. Intubare con una cannula endovenosa calibro 26 e utilizzare un agente fissativo per gonfiare i polmoni mediante fissazione a pressione a una pressione costante di 20 centimetri di acqua.

Dopo 30 minuti a temperatura ambiente, legare la trachea e rimuovere contemporaneamente la cannula. Quindi asportare con cura i polmoni senza danneggiare il tessuto e conservare i polmoni in un agente fissativo fresco a quattro gradi Celsius durante la notte. I topi obesi dimostrano un aumento dei livelli di glucosio sierico 15 e 30 minuti dopo l'iniezione intraperitoneale di glucosio, indicando un ridotto assorbimento cellulare del glucosio rispetto ai topi alimentati con la dieta standard.

L'analisi invasiva della funzione polmonare mostra un aumento fino a 1,5 volte della resistenza delle vie aeree nei topi obesi e alimentati con una dieta ricca di grassi dopo la stimolazione con metacolina rispetto agli animali di controllo. La colorazione con ematossilina ed eosina delle sezioni del parenchima polmonare dopo l'installazione intratracheale rivela aree multiple non gonfiate, setti alveolari spessi e alveoli di forma poligonale nei polmoni instillati con una pressione insufficiente. Al contrario, un'eccessiva pressione di instillazione porta a aree eccessivamente gonfiate con setti alveolari distrutti.

L'applicazione della quantità appropriata di pressione durante la fissazione polmonare, tuttavia, porta a un polmone completamente gonfio con alveoli di forma rotonda. Una volta padroneggiati, i test di tolleranza al glucosio intraperitoneale possono essere completati in due ore e mezza. I test di funzionalità polmonare possono essere completati in un'ora e l'insufflazione polmonare può essere completata in meno di un'ora.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che l'adattamento dei topi, la formazione dello sperimentatore e il lavoro in un ambiente tranquillo e a stress ridotto sono tutti raccomandati per un'acquisizione ottimale dei dati. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del metabolismo e delle malattie respiratorie per esplorare i meccanismi coinvolti e il potenziamento delle strategie di trattamento della malattia polmonare cronica utilizzando piccoli modelli animali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indagare l'impatto dell'obesità e dei disturbi metabolici sulla struttura e la funzione polmonare.

Non dimenticare che lavorare con animali o strumenti chirurgici può causare lesioni o reazioni cutanee e che durante l'esecuzione di queste procedure è necessario prendere sempre precauzioni come indossare i dispositivi di protezione individuale appropriati.