Prova di tolleranza di glucosio intraperitoneale, misura della funzione polmonare e la fissazione del polmone per studiare l'impatto dell'obesità e metabolismo alterato sugli esiti polmonare
15 marzo 2018
L'incidenza dell'obesità è in aumento e aumenta il rischio di malattie polmonari croniche. Per stabilire i meccanismi sottostanti e le strategie preventive, animale ben definiti modelli sono necessari. Qui, mettiamo a disposizione tre metodi (prova di tolleranza di glucosio, pletismografia corporea e fissazione del polmone) per studiare l'effetto dell'obesità sui risultati polmonari nei topi.
L'obiettivo generale dei seguenti tre metodi è studiare l'impatto dell'obesità e dei disturbi metabolici sulla struttura e la funzione polmonare. Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca respiratoria sull'impatto dei disturbi metabolici sulla struttura e sulla funzione polmonare. Il vantaggio di queste tecniche è che possono essere combinate per valutare il ruolo funzionale del metabolismo sulla patogenesi delle malattie polmonari croniche e per testare diversi approcci terapeutici.
Le implicazioni di queste tecniche si estendono oltre la fenotipizzazione a ciò che sta chiarendo il ruolo funzionale specifico dei bersagli metabolici nella patogenesi delle malattie polmonari. Questi metodi possono essere applicati anche allo studio della struttura e della funzione sia in animali sani con modificazioni genetiche ma anche in modelli animali di BPCO e asma. In generale, gli individui che non conoscono questi metodi avranno difficoltà poiché l'inserimento del tubo tracheale, l'insufflazione del polmone e la somministrazione dell'anestesia profonda, richiedono tutti esperienza e formazione.
Abbiamo avuto l'idea di questi metodi quando abbiamo scoperto che l'obesità ad esordio precoce nei topi ma anche negli esseri umani era intimamente legata all'impatto del metabolismo e alle malattie polmonari croniche oltre l'infanzia. Per misurare la tolleranza al glucosio intraperitoneale, trattenere delicatamente un topo adulto a digiuno di 12 ore per la coda e utilizzare forbici sterili per incidere la punta della coda. Applicare immediatamente una goccia di sangue a flusso libero sulla striscia reattiva del glucometro per misurare il livello di glucosio nel sangue a digiuno.
Il risultato del test apparirà sullo schermo del glucometro dopo quattro secondi. Dopo aver misurato il glucosio per ogni animale, etichettarli singolarmente con pennarelli colorati e pesare gli animali. Quindi utilizzare un ago calibro 27 collegato a una siringa da un millilitro per somministrare 100 microlitri di glucosio per tonnellata di peso corporeo a ciascun animale tramite iniezione intraperitoneale e misurare i livelli di glucosio nel sangue 15, 30, 60 e 120 minuti dopo con nuove strisce reattive come appena dimostrato.
Per valutare la funzione polmonare, posizionare un topo adulto in posizione supina su un tappetino e applicare un unguento sugli occhi dell'animale. Dopo aver confermato la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita, bagnare il pelo nella regione tiroidea con etanolo al 70% e utilizzare una pinza per sollevare la pelle sulla linea mediana tra la tacca giugulare sullo sterno e la sinfisi del tubero del mento. Usando le forbici smussate, praticare con cura un'incisione cutanea di un centimetro nella pelle tesa per visualizzare il tessuto adiposo sottocutaneo sottostante e la ghiandola tiroidea ed esporre la trachea con un'attenta separazione smussata di entrambi i lobi tiroidei all'istmo e la dissezione dei muscoli sternotiroidei e sternotiroidei.
Usando una pinza affilata, passare una sutura chirurgica intrecciata 4-0 tra la trachea e l'esofago e incidere con cura la trachea vicino alla laringe tra le cartilagini tracheali con microforbici. Intubare con un tubo tracheale che fissa il tubo con una sutura chirurgica e spostare l'animale sul letto riscaldato di una camera del corpo. Collegare il tubo tracheale alla piastra frontale e accendere il ventilatore.
Confermare il movimento del torace contemporaneamente alla velocità di ventilazione per confermare il corretto posizionamento del tubo tracheale e osservare il segnale di pressione sullo schermo del computer. Per controllare le variazioni della pressione transpolmonare durante la ventilazione, inserire un tubo esofageo a livello dei polmoni guardando lo schermo per facilitare il posizionamento del tubo dove si può osservare la massima deflessione della pressione e il minimo artefatto cardiaco. Iniziare l'acquisizione dei dati secondo le istruzioni del produttore e applicare 10 microlitri di PBS sul nebulizzatore.
Iniziare la nebulizzazione dopo cinque minuti di acclamazione seguita da una fase di risposta di tre minuti durante la quale vengono misurate la resistenza delle vie aeree e la compliance del sistema respiratorio. Lasciare che l'animale si riprenda per tre minuti prima di iniziare la nebulizzazione successiva e seguire le istruzioni del software per l'applicazione graduale di concentrazioni crescenti di 10 microlitri di metacolina sul ventilatore. Per l'analisi istomorfometrica quantitativa del tessuto polmonare, utilizzare le forbici smussate per praticare una piccola incisione nel diaframma di un topo adulto e utilizzare le forbici smussate curve per praticare un'incisione peristernale lungo l'intera lunghezza della gabbia toracica per aprire delicatamente il torace.
Sollevare la gabbia toracica per esporre la cavità pleurica e rimuovere il timo. Dopo aver rimosso il cuore, utilizzare una pinza affilata per preparare ed esporre la trachea al fine di far passare una sutura chirurgica intrecciata 4-0 tra la trachea e l'esofago seguita da un'attenta incisione della trachea vicino alla laringe tra le cartilagini tracheali. Intubare con una cannula endovenosa calibro 26 e utilizzare un agente fissativo per gonfiare i polmoni mediante fissazione a pressione a una pressione costante di 20 centimetri di acqua.
Dopo 30 minuti a temperatura ambiente, legare la trachea e rimuovere contemporaneamente la cannula. Quindi asportare con cura i polmoni senza danneggiare il tessuto e conservare i polmoni in un agente fissativo fresco a quattro gradi Celsius durante la notte. I topi obesi dimostrano un aumento dei livelli di glucosio sierico 15 e 30 minuti dopo l'iniezione intraperitoneale di glucosio, indicando un ridotto assorbimento cellulare del glucosio rispetto ai topi alimentati con la dieta standard.
L'analisi invasiva della funzione polmonare mostra un aumento fino a 1,5 volte della resistenza delle vie aeree nei topi obesi e alimentati con una dieta ricca di grassi dopo la stimolazione con metacolina rispetto agli animali di controllo. La colorazione con ematossilina ed eosina delle sezioni del parenchima polmonare dopo l'installazione intratracheale rivela aree multiple non gonfiate, setti alveolari spessi e alveoli di forma poligonale nei polmoni instillati con una pressione insufficiente. Al contrario, un'eccessiva pressione di instillazione porta a aree eccessivamente gonfiate con setti alveolari distrutti.
L'applicazione della quantità appropriata di pressione durante la fissazione polmonare, tuttavia, porta a un polmone completamente gonfio con alveoli di forma rotonda. Una volta padroneggiati, i test di tolleranza al glucosio intraperitoneale possono essere completati in due ore e mezza. I test di funzionalità polmonare possono essere completati in un'ora e l'insufflazione polmonare può essere completata in meno di un'ora.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che l'adattamento dei topi, la formazione dello sperimentatore e il lavoro in un ambiente tranquillo e a stress ridotto sono tutti raccomandati per un'acquisizione ottimale dei dati. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del metabolismo e delle malattie respiratorie per esplorare i meccanismi coinvolti e il potenziamento delle strategie di trattamento della malattia polmonare cronica utilizzando piccoli modelli animali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indagare l'impatto dell'obesità e dei disturbi metabolici sulla struttura e la funzione polmonare.
Non dimenticare che lavorare con animali o strumenti chirurgici può causare lesioni o reazioni cutanee e che durante l'esecuzione di queste procedure è necessario prendere sempre precauzioni come indossare i dispositivi di protezione individuale appropriati.
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Panoramica
Questo articolo discute i metodi per studiare l'impatto dell'obesità sulla struttura e sulla funzione polmonare utilizzando modelli animali. Evidenzia l'importanza di queste tecniche nella comprensione delle malattie polmonari croniche.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Neuroscienze
- Ricerca respiratoria
- Disturbi metabolici
Sfondo
- L'obesità è legata a malattie polmonari croniche.
- Comprendere i meccanismi richiede modelli animali ben definiti.
- La ricerca mira a esplorare il ruolo funzionale del metabolismo nella patogenesi polmonare.
- Le tecniche possono essere applicate sia a modelli sani che malati.
Scopo dello studio
- Valutare l'impatto dell'obesità sui risultati polmonari.
- Stabilire strategie preventive per le malattie polmonari croniche.
- Chiarire il ruolo funzionale dei bersagli metabolici.
Metodi utilizzati
- Test di tolleranza al glucosio
- Pletismografia corporea
- Fissazione polmonare
- Combinazione di tecniche per una valutazione completa
Principali risultati
- I metodi forniscono informazioni sulla struttura e sulla funzione polmonare.
- Le tecniche possono aiutare a testare approcci terapeutici.
- I risultati si estendono alla comprensione della BPCO e dell'asma.
- È necessaria esperienza per l'esecuzione corretta della tecnica.
Conclusioni
- Questi metodi sono cruciali per studiare gli effetti dell'obesità sulla salute polmonare.
- Facilitano l'esplorazione dei disturbi metabolici nelle malattie respiratorie.
- La formazione è essenziale per l'applicazione efficace di queste tecniche.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Obesity-related metabolic dysfunction represents a growing risk factor for chronic lung diseases, creating a need for preclinical models that can mechanistically link systemic metabolism to pulmonary outcomes. The integrated assessment of glucose tolerance, lung function, and histological structure enables de-risking of therapeutic hypotheses by providing quantitative, reproducible readouts across metabolic and respiratory domains. This approach supports target validation and predictive confidence in early discovery by elucidating whether metabolic interventions modify lung pathology in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the functional role of metabolic targets in lung pathogenesis by measuring glucose intolerance as a biomarker of impaired cellular uptake.
- Operational Value: Enables pathway clarification through standardized ipGTT procedures that detect diet-induced metabolic dysregulation in obese models.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking metabolic impairment to functional lung outcomes via concurrent airway resistance and compliance measurements.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by fixing lungs at standardized pressure to ensure reproducible alveolar morphology for histomorphometric analysis.
- Operational Value: Addresses assay standardization through stepwise methacholine challenge protocols that quantify dose-dependent bronchoconstriction in obese versus control animals.
- Scalability: Highlights platform reuse across COPD and asthma models, enabling consistent lung structure-function assessment in genetically modified or diseased cohorts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by connecting systemic inflammatory and metabolic dysregulation to lung structural changes such as thickened septa and polygonal alveoli.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by demonstrating how lung fixation at 20 cm H2O pressure yields round-shaped alveoli, enabling reliable quantitative endpoints.
- Risk-Adjusted Advancement: Addresses mechanistic de-risking by showing that appropriate insufflation pressure prevents overinflation or collapse, reducing artifact-driven variability in histological assessments.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions itself within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, supporting iterative evaluation of metabolic interventions on lung structure and function in preclinical models.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing by measuring serum glucose levels at 15 and 30 minutes post-injection to evaluate cellular glucose uptake in obesity models.
- Screening: Describes assay readiness through reproducible airway resistance and compliance measurements following nebulization and methacholine challenge, enabling compound effect comparison.
- Analytics: Highlights quantitative dependent variable measurements such as increased airway resistance (up to 1.5-fold) and altered alveolar morphology that help teams compare metabolic and pulmonary phenotypes.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by demonstrating lung preparation and fixation protocols that preserve tissue integrity for histological analysis across study groups.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, applicable to both healthy animals with genetic modifications and disease models of COPD and asthma.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in obesity-lung disease linkages.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of metabolic and functional pulmonary assessments.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early metabolic phenotype stratification.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on concordant glucose tolerance, lung function, and histological outcomes.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in surgical procedures including tracheal intubation, lung insufflation, and glucose administration.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs such as glucometers, ventilators, pressure monitoring systems, and nebulizers for methacholine delivery.
- Cross-team standardization requirements for consistent animal fasting, injection dosing, and timing of metabolic and functional readouts.
- Adaptation considerations across model systems including healthy, genetically modified, and disease-induced obese mice.
- Practical limitations supported by source material: investigator training and stress-reduced environments are recommended for optimal data acquisition due to technical complexity of surgical steps.
