Costruire una piattaforma di High-throughput Screening per valutare l'eterogeneità dell'amplificazione del Gene HER2 nei cancri al seno
5 dicembre 2017
Distribuzione eterogenea delle cellule HER2-positive può essere osservato in un sottogruppo di tumori al seno e genera dilemmi clinici. Qui, presentiamo un protocollo affidabile ed economico per definire, quantificare e confrontare eterogeneità genetica intra-tumore di HER2 in un'ampia serie di cancri al seno eterogeneo trasformati.
L'obiettivo generale di questa procedura di laboratorio è quello di definire, quantificare e confrontare simultaneamente l'eterogeneità genetica intra-tumorale di HER2 in un'ampia serie di tumori mammari trattati in modo eterogeneo mediante ibridazione in situ con argento ad alto rendimento. Questo metodo può aiutare ad affrontare la scelta chiave, la traduzione e la ricerca sul cancro al seno, come lo studio dell'eterogeneità dell'amplificazione del gene HER2, un'ampia coorte di casi recuperati dagli archivi di patologia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la schizoanalisi HER2 ad alto rendimento in diverse aree topografiche di tumori mammari multipli ed eterogeneamente elaborati.
In generale, gli individui che non conoscono l'ibridazione in situ avranno difficoltà perché gli studi retrospettivi richiedono tipicamente l'analisi di campioni d'archivio che sono stati sottoposti a diverse procedure di fissazione, elaborazione e conservazione. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo deciso di riclassificare tutti i tumori al seno dal nostro database istituzionale dal 2003. A dimostrare questa procedura sarà Giulia Ercoli, tecnico del nostro laboratorio.
Inizia questo protocollo con la selezione dei pazienti e dei campioni di tessuto come descritto nel protocollo di testo. Crea e apri un nuovo foglio di calcolo, incorporando i record delle aree distinte di ciascun caso. Include colonne separate per l'ID del caso, l'ID del blocco, l'ID dell'area, il tipo di tessuto, la topografia, la morfologia, lo stato del biomarcatore e tutte le altre caratteristiche immunoistochimiche disponibili.
Creare un progetto TMA. Definisci i blocchi dei destinatari PMA passando a file, new, block. Fare clic sul primo campo da compilare e digitare le dimensioni del blocco di paraffina.
Quindi, crea un progetto di array di tessuti passando a file, nuovo, array di tessuti. Fai clic sull'icona di importazione, quindi scegli il file modello del blocco destinatario creato in precedenza. Fare clic su Avanti.
Quindi scegli un millimetro come dimensione del punto facendo clic sul pulsante rotondo. Scegli 500 micron come spaziatura dei punti, che è lo spazio tra due centri di punti vicini. Quindi fare clic sull'icona della calcolatrice per calcolare il numero totale di punti creati, che dovrebbe essere 231.
Quindi fare clic sul pulsante Definisci per creare griglie e sottogriglie. Elimina le colonne otto e 15 e la riga centrale. Mantieni tre punti della prima linea per l'orientamento.
La mappa finale dovrebbe comprendere un numero totale di 183 punti. Definisci l'elenco dei tipi di tessuto navigando su file, nuovo, elenco dei tipi di tessuto. Quindi definisci il progetto passando a file, nuovo, progetto booster.
Preparare quindi i blocchi accettori. Riempire gli stampi metallici puliti con paraffina elasticizzata a 65 gradi Celsius. Lasciare raffreddare i blocchi di paraffina alla temperatura della pellicola per una notte all'interno degli stampi metallici.
Il giorno successivo, estrarre i blocchi di paraffina dagli stampi metallici. Costruisci il TMA utilizzando un arrayer automatizzato o semi-automatizzato accendendo prima l'arrayer e quindi inserendo i blocchi accetter sul carosello dell'arrayer. Definisci la posizione iniziale su ciascun blocco ricevente utilizzando i tasti freccia per spostare la luce laser e allinearla con il bordo superiore sinistro sulla paraffina del blocco ricevente.
Fare clic su Avanti e ripetere per l'allineamento verticale. Fare nuovamente clic su Avanti per creare automaticamente un foro nella coordinata precedentemente definita del blocco ricevente. Svuotare il punzone.
Posizionare il blocco donatore per il campionamento e rimuovere un nucleo di tessuto dall'area di interesse precedentemente annotata. Inserire il nucleo di tessuto del donatore nel foro del blocco ricevente. Quindi rimuovere il blocco donatore dall'arrayer.
Ripetere questi passaggi fino al completamento del TMA. Posizionare il lato in tessuto del blocco TMA appena generato su un vetrino bianco sterile e posizionarlo nel forno da laboratorio a 45 gradi Celsius per cinque minuti. Premere delicatamente il blocco sul vetrino per cinque secondi per appiattire i nuclei di tessuto.
Ripetere una volta per un totale di due volte. Successivamente, coprire la superficie del tessuto TMA con un sottile strato di paraffina elasticizzata a 65 gradi Celsius. Lasciare il blocco TMA a temperatura ambiente per due ore.
Infine, trasferire il blocco TMA a quattro gradi Celsius per 24 ore prima di eseguire le analisi istochimiche e immunoistochimiche come descritto nel protocollo di testo. Posizionare i vetrini TMA per analizzarli a 60 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi avviare lo strumento immunostainer e il software.
Nella vista principale, fare clic sul pulsante protocolli, quindi fare clic su crea/modifica protocolli. Selezionare la procedura del cocktail dual ISH per modificare il modello di base. Contrassegnare la cottura nell'elenco delle caselle e impostare la temperatura a 63 gradi Celsius per 20 minuti.
Quindi contrassegnare la deparaffinazione. Contrassegnare il condizionamento della cella nell'elenco delle caselle. Quindi contrassegnare il condizionamento cellulare CC2 e impostare la temperatura a 86 gradi Celsius e il tempo di incubazione a quattro minuti.
Contrassegnare CC2 lieve per otto minuti, standard per 12 minuti ed esteso per otto minuti. Contrassegnare ISH-Protease tre nell'elenco delle caselle e impostare il tempo di incubazione a 16 minuti. Selezionare il dinitrofenile HER2 della sonda e la digossigenina del cromosoma 17.
Incubare per 16 minuti e poi impostare la denaturazione per 20 minuti a 80 gradi Celsius. Impostare il tempo di incubazione della sonda a sei ore. Quindi impostare il tempo di incubazione del multimero SISH a 32 minuti.
Impostare il cromato d'argento e il tempo di incubazione a quattro minuti. Quindi impostare il tempo di incubazione del multimero rosso a 24 minuti. Impostare il cromato rosso e il tempo di incubazione a otto minuti.
Quindi contrassegnare la controcolorazione nell'elenco delle caselle, selezionare l'ematossilina due e impostare il tempo di incubazione a otto minuti. Contrassegnare la controcolorazione nell'elenco delle caselle, selezionare il reagente azzurrante e impostare il tempo di incubazione a quattro minuti. Infine, eseguire la schizoanalisi per HER2.
Valutare l'amplificazione del gene HER2 come positiva se il rapporto della sonda di enumerazione cromosomica 17 HER2 è maggiore o uguale a 2,0 con un numero medio di copie di HER2 maggiore o uguale a 4,0 segnali per cellula. Valutare come negativo se il rapporto della sonda di enumerazione cromosomica 17 HER2 è inferiore a 2,0 con un numero medio di copie HER2 inferiore a 4,0 segnali per cellula. Qui sono mostrate micrografie rappresentative che mostrano l'analisi di ibridazione in situ dell'argento di un carcinoma mammario eterogeneo HER2.
In questo esempio paradigmatico, due aree distinte di carcinoma mammario invasivo di alto grado di tipo non speciale mostrano risultati diversi in termini di amplificazione del gene HER2, visualizzati come punti neri, rispetto alla sonda di enumerazione centromerica 17, visualizzata come punti rossi. In particolare, un'area appartenente al nucleo tumorale e che mostrava un pattern di colorazione irregolare della citocheratina sette era amplificata da HER2, mentre un singolo spot davanti al fronte invasivo mostrava un pattern HER2 wild-type. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire una schizoanalisi leggibile di array marcati di tessuto che incorporano tumori al seno multipli ed eterogeneamente elaborati.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni lavorativi dalla selezione del caso. Sebbene questo metodo sia ottimizzato per il cancro al seno, può essere tradotto in altri tipi di cancro in cui l'eterogeneità di HER2 è di fondamentale rilevanza, come il cancro gastrico. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la semplice valutazione di HER2 perché è progettata per la mappatura completa di più aree topografiche in serie più ampie di tumori al seno.
Durante questa procedura, è importante evitare qualsiasi crepa sul blocco TMA. Anche una minima crepa nella paraffina deduce la qualità, la riproducibilità e la limpidezza complessiva dell'ibridazione in situ. A seguito di questa procedura, è possibile eseguire l'imaging con spettrometria di massa MALDI per rispondere a ulteriori domande sulla proteomica del carcinoma mammario, in particolare in termini di eterogeneità intra e inter-tumorale.
Non dimenticare che lavorare con punzoni TMA e cera di paraffina calda può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare guanti monouso in nitrile.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo affidabile ed economico per definire, quantificare e confrontare l'eterogeneità genetica intratumorale di HER2 nei tumori del seno. Il metodo utilizza l'ibridazione in situ ad alta capacità con argento per affrontare dilemmi clinici derivanti dalla distribuzione eterogenea delle cellule positive per HER2.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Ricerca sul cancro al seno
- Genetica dell'eterogeneità
- Tecniche di ibridazione in situ
Sfondo
- Le cellule positive al HER2 mostrano una distribuzione eterogenea in alcuni tipi di cancro al seno.
- Questa eterogeneità pone sfide per il processo decisionale clinico.
- I metodi esistenti possono avere difficoltà con campioni archiviati a causa delle diverse modalità di trattamento.
- Tecniche ad alto rendimento possono migliorare l'analisi su più campioni.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per analizzare l'eterogeneità dell'amplificazione del gene HER2.
- Facilitare la ricerca sul cancro al seno utilizzando un'ampia coorte proveniente da archivi di anatomia patologica.
- Migliorare l'affidabilità dell'analisi di HER2 in ambito clinico.
Metodi Utilizzati
- Ibridazione in situ ad alta capacità con argento.
- Analisi di una vasta serie di casi di cancro al seno.
- Confronto dell'eterogeneità genetica di HER2 in diverse aree tumorali.
- Utilizzo di campioni archiviati con fissazione e trattamento variabili.
Risultati principali
- Il metodo consente una quantificazione efficace dell'eterogeneità di HER2.
- L'analisi ad alto rendimento rivela variazioni significative nell'espressione di HER2.
- I risultati possono orientare le decisioni terapeutiche nella gestione del cancro al seno.
- Il protocollo è adattabile a diverse condizioni di lavorazione dei campioni.
Conclusioni
- Questo protocollo migliora la comprensione dell'eterogeneità del HER2 nel cancro al seno.
- Fornisce uno strumento prezioso sia per i ricercatori che per i clinici.
- Studi futuri potranno basarsi su questo metodo per indagare ulteriormente le terapie correlate al HER2.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'eterogeneità del HER2 nel cancro al seno complica le decisioni terapeutiche e contribuisce a esiti clinici variabili, creando la necessità di metodi di valutazione standardizzati e scalabili. Questa piattaforma SISH ad alto rendimento consente la quantificazione simultanea dell'amplificazione genica del HER2 in molteplici topografie tumorali e campioni di archivio, supportando la validazione preclinica del bersaglio e la stratificazione dei biomarcatori. Fornendo una mappatura riproducibile e quantitativa dello stato del HER2, il metodo aumenta la fiducia predittiva nei flussi di lavoro della ricerca traslazionale e della scoperta precoce.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente l'analisi dei modelli di amplificazione di HER2 attraverso diverse regioni tumorali per chiarire la validità del bersaglio e la sua rilevanza biologica.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio funzionale del bersaglio quantificando la variabilità genetica intratumorale in coorti archiviate di cancro al seno.
- Valore predittivo: Genera rapporti tra i segnali di HER2 e del cromosoma 17 e soglie del numero di copie per informare decisioni di selezione del bersaglio di tipo go/no-go.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Produce formati standardizzati di TMA ottimizzati per la SISH, consentendo uno screening scalabile dello stato del gene HER2 in campioni eterogenei.
- Output quantitativo: Fornisce il rapporto tra HER2 e cromosoma 17 e il numero medio di copie di HER2 per cellula come parametri misurabili per la validazione del saggio.
- Riutilizzo della piattaforma: Adattabile ad altri tipi di cancro (ad esempio, gastrico) in cui l’eterogeneità di HER2 influisce sulla risposta terapeutica, favorendo la trasferibilità del saggio tra diverse indicazioni.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Mappa lo stato del recettore HER2 dalla fase di scoperta attraverso modelli preclinici, preservando l'eterogeneità spaziale nei tessuti in paraffina (FFPE).
- Allineamento dei Biomarcatori: Si integra con la colorazione immunoistochimica (IHC) per ER, PR, Ki67 e HER2, consentendo un profilo multimodale dei biomarcatori in coorti di tessuti archiviati.
- Progressione Basata sul Rischio: Identifica sottopopolazioni negative per HER2 all'interno di tumori apparentemente positivi per HER2, fornendo indicazioni per strategie di terapia combinata e meccanismi di resistenza.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso dalla scoperta alla traduzione, consentendo la valutazione dell'eterogeneità di HER2 dopo l'identificazione del bersaglio e prima dei test di efficacia preclinica, in particolare nella stratificazione guidata da biomarcatori.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica di ipotesi sui modelli di amplificazione di HER2 e sull'eterogeneità delle vie in campioni di tumore primario.
- Screening: Garantisce la riproducibilità del saggio attraverso la costruzione standardizzata di TMA e l'esecuzione del protocollo SISH su campioni sottoposti a diverse modalità di trattamento.
- Analisi: Fornisce rapporti quantitativi tra HER2 e cromosoma 17 e soglie numeriche per il numero di copie, consentendo un confronto oggettivo dell'eterogeneità genetica.
- Ricerca traslazionale: Favorisce la continuità con studi preclinici collegando i modelli spaziali di HER2 a risultati funzionali in sistemi modello.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma scalabile e standardizzata per la valutazione di HER2 applicabile a diverse indicazioni oncologiche e a insiemi di campioni archiviati.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nei percorsi guidati da HER2 risolvendo l'eterogeneità genetica intratumorale.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità attraverso l'allestimento automatizzato di TMA e condizioni SISH ottimizzate.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza delle decisioni di avanzamento/cessazione fornendo soglie quantitative di HER2 per la stratificazione dei pazienti negli studi preclinici.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio dei candidati mirati a HER2 identificando tumori con profili di amplificazione eterogenei.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella costruzione di microarray di tessuti, nell'ibridazione in situ e nell'analisi di patologia digitale.
- Dipende da coloratori automatici, dispositivi per l'allestimento di microarray di tessuti (TMA) e sistemi di imaging in grado di rilevare segnali SISH.
- Necessita di una standardizzazione tra gruppi di lavoro nei settori di patologia, biologia molecolare e bioinformatica per un'interpretazione coerente dei dati.
- Deve tenere conto delle variazioni nella fissazione, nell'elaborazione e nella conservazione quando si confrontano i segnali HER2 in campioni archiviati.
- Limitato alla valutazione dell'amplificazione di HER2 a livello di DNA; non rileva l'espressione proteica o l'attività di segnalazione senza test complementari di immunoeistochemica (IHC) o saggi funzionali.
Domande frequenti sul biopharma
Chapters in this video
0:05
Title
1:24
Design and Construct Tissue Microarrays (TMAs) Based on the Kononen Technique
6:20
Silver In Situ Hybridization (SISH) Analysis of Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 (HER2)
9:11
Results: Analysis of Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers
10:00
Conclusion
