Espressione transiente di geni estranei in cellule di insetto (sf9) per analisi funzionale della proteina

L'obiettivo generale di questo sistema di espressione proteica indotto da shock termico è quello di valutare l'attività anti-apoptotica delle proteine in due proteine potenzialmente antagoniste funzionalmente nelle cellule di insetti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulle funzioni e le attività delle proteine candidate in biotecnologia e proteomica, come le loro attività anti-apoptotiche e le interazioni proteiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i tempi di espressione genica sono controllati dall'induzione dello shock termico.

Quindi questo metodo può fornire informazioni sullo stato funzionale delle proteine. Può anche essere applicato ad altri sistemi, come l'espressione proteica dei mammiferi. Le cellule di insetto Spodoptera frugiperda, o Sf9, utilizzate in questo protocollo vengono coltivate in terreno di coltura cellulare in fiasche di coltura cellulare da 25 centimetri quadrati a 28 gradi Celsius.

Agitare il pallone per coltura cellulare per staccare le cellule dal pallone. Quindi controlla al microscopio ottico per assicurarti che circa l'80% delle cellule sia staccato. Trasferire il 50% della sospensione cellulare in un nuovo pallone di coltura cellulare da 25 centimetri quadrati e lasciare che le cellule si attacchino a temperatura ambiente per 15 minuti.

Dopo 15 minuti, sostituire il terreno con cinque millilitri di terreno di coltura fresco e far crescere in un'incubatrice a 28 gradi Celsius. A seconda della crescita cellulare, far passare le cellule ogni due o tre giorni. Prima di raccogliere le cellule Sf9, è importante controllare le cellule al microscopio ottico per assicurarsi che non vi sia contaminazione da parte di batteri o altri microrganismi.

Per raccogliere le cellule Sf9, agitare il pallone di coltura per staccare le cellule, quindi trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 millilitri. Utilizzando una pipetta P10, trasferire 10 microlitri di sospensione cellulare in un ematocitometro e contare il numero di cellule al microscopio ottico. Piastra tre volte da 10 a quinta cella in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e lascia a temperatura ambiente per 15 minuti.

Dopo 15 minuti, sostituire il terreno con 0,5 millilitri di mezzo di placcatura. Preparare il reggente di trasfezione cellulare. Per ogni trasfezione, diluire otto microlitri di reagente di trasfezione cellulare con 100 microlitri di terreno di coltura cellulare privo di siero e agitare per un secondo per mescolare.

In questo studio, tre diversi troncamenti del gene baculovirale, inibitore dell'apoptosi 3, o IAP3, saranno espressi sotto il controllo del promotore dello shock termico 70 di Drosophila, l'intero IAP3, un troncamento mancante del dominio RING e un troncamento mancante del dominio BIR. Aggiungere due microgrammi di ciascun DNA plasmidico in 100 microlitri di terreno di coltura cellulare privo di siero e mescolare agitando per un secondo. Prepara anche un controllo positivo.

Combinare il DNA plasmidico diluito e il reagente di trasfezione cellulare diluita e mescolare mediante vortex. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Utilizzando una pipetta P1000, aggiungere 210 microlitri di ciascuna miscela di reagenti per la trasfezione del DNA goccia a goccia sulle cellule.

Incubare a 28 gradi Celsius per cinque ore. Dopo cinque ore, sostituire il terreno di placcatura con 0,5 millilitri di terreno di coltura cellulare, quindi sigillare la piastra a 24 pozzetti con nastro adesivo. Incubare a 28 gradi.

Il giorno seguente, shock termico per indurre l'espressione proteica facendo galleggiare la piastra in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo 30 minuti, rimettere la piastra a 24 pozzetti nell'incubatore a 28 gradi Celsius. L'espressione proteica è successivamente confermata dal Western blot come descritto nel protocollo di testo.

Per esaminare l'apoptosi cellulare indotta da geni, preparare prima le cellule Sf9 come dimostrato in precedenza. Successivamente, trasfetta le cellule nello stesso modo di prima, ma includi un microgrammo di un plasmide contenente un gene induttore dell'apoptosi in ogni reazione di trasfezione. Incubare a 28 gradi Celsius per cinque ore, sostituire il terreno e incubare per 16 ore.

Shock termico delle celle trasfettate a 42 gradi Celsius per 30 minuti. Incubare le cellule a 28 gradi Celsius per cinque ore prima di eseguire il test di vitalità cellulare. Per l'apoptosi cellulare indotta da sostanze chimiche, placcare una volta 10 alle sei cellule Sf9 in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti.

Lasciare a temperatura ambiente per 15 minuti, quindi sostituire il mezzo con un millilitro di mezzo di placcatura. Trasfetta le cellule con quattro microgrammi di ciascun DNA plasmidico. Dopo cinque ore, sostituire il terreno di placcatura con un millilitro di terreno di coltura cellulare e incubare le cellule a 28 gradi Celsius per 16 ore.

Quindi shock termico a 42 gradi Celsius per 30 minuti. Incubare le cellule a 28 gradi Celsius per cinque ore dopo lo shock termico. Quindi trattare le cellule trasfettate con actinomicina D per indurre l'apoptosi.

Incubare a 28 gradi Celsius per 16 ore prima di eseguire il test di vitalità cellulare. Inizia questa procedura lavando le cellule trattate. Togliete il terreno da ogni pozzetto, aggiungete un millilitro di PBS e lasciate riposare per un minuto.

Lavare le celle tre volte con PBS in questo modo. Risospendere le cellule in ciascun pozzetto con un millilitro di PBS contenente lo 04% di blu di tripano e colorare a temperatura ambiente per tre minuti. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta per microfusibile da 1,5 millilitri.

Trasferire 10 microlitri di sospensione cellulare colorata con blu di tripano in un ematocitometro e contare le cellule intatte vitali al microscopio ottico. Infine, eseguire l'analisi statistica come descritto nel protocollo di testo. L'intera lunghezza e i due troncamenti di IAP3 da Lymantria xylina MNPV erano sovraespressi nelle cellule Sf9 e il Western blot è stato eseguito su lisati cellulari per confermare l'espressione proteica.

La proteina anti-apoptotica Ac-P35 è stata inclusa come controllo positivo. Tutte le proteine potrebbero essere rilevate nelle cellule trasfettate a un'ora o cinque ore dopo lo shock termico, con un'espressione più elevata a cinque ore. Questo sistema può essere adattato per valutare l'attività anti-apoptotica.

Per l'apoptosi cellulare indotta da geni, l'induttore dell'apoptosi Drosophila Reaper è stato co-trasfettato con costrutti di plasmidi genici bersaglio in cellule Sf9, che sono state successivamente sottoposte a shock termico per attivare l'espressione genica. Rispetto al vettore Drosophila Reaper, il controllo positivo ha mostrato un'elevata attività anti-apoptotica, raggiungendo fino all'80% del tasso di vitalità. Gli altri costrutti hanno mostrato vari effetti sull'attività anti-apoptotica.

Per l'apoptosi cellulare indotta da sostanze chimiche, solo un costrutto è stato trasfettato in cellule Sf9 e l'actinomicina D è stata aggiunta cinque ore dopo lo shock termico. Rispetto al controllo positivo o al controllo negativo, gli altri costrutti hanno mostrato vari effetti sull'attività anti-apoptotica. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due o tre giorni se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di obbedire alle regole operative della coltura cellulare in flusso laminare e controllare diligentemente lo stato delle cellule. Seguendo questa procedura, altri metodi, come la co-immunoprecipitazione, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio se esiste un'interazione tra le due proteine co-espresse nelle cellule degli insetti. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biotecnologia per esplorare le funzioni delle proteine negli animali o nei microrganismi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare questo sistema per esprimere proteine estranee o valutare proteine potenzialmente antagoniste funzionalmente nelle cellule di insetti. Non dimenticare che lavorare con alcune sostanze chimiche, come l'actinomicina D, può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni, come indossare i guanti.