Name: Espressione transiente di geni estranei in cellule di insetto (sf9) per analisi funzionale della proteina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Impara a esprimere geni estranei nelle cellule Sf9 mediante induzione da shock termico per valutare l'attività anti-apoptotica delle proteine. Questo metodo controllato offre approfondimenti sullo stato funzionale delle proteine in biotecnologia.

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Si ringrazia il Dr. Jian-Horng Leu dell'Istituto di Biologia Marina, National Taiwan Ocean University per la fornitura di 3 costruzioni di plasmide. Questa ricerca è stata sostenuta da Grant 106-2311-B-197-001 - dal Ministero della scienza e della tecnologia (MOST).

1. preparati
<ol><li>Coltura delle cellule dell'insetto<ol>
<li>Preparare 50 mL di mezzo di coltura cellulare. A tale scopo, aggiungere 500 µ l di antibiotici (anfotericina B = 0,25 µ g/mL, penicillina = 100 unità/mL, streptomicina = 100 µ g/mL) e 5 mL di siero bovino fetale inattivati al calore nel mezzo di coltura privo di siero cellulare (senza FBS o antibiotici). Nota: Riscaldare il siero bovino fetale a 65 ° C per 30 min in un bagno di acqua prima dell'uso.</li>
		<li>Mantenere Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae), cellule di insetto sf9. Staccare ca. 80% delle cellule dal matraccio di cultura di 25cm2 cella agitando la beuta e verifica nell'ambito di microscopia. Quindi, trasferire 50% della sospensione delle cellule in un pallone di cultura cellulare di nuovo 25 cm2 e permettono alle cellule di allegare per 15 min a temperatura ambiente. Sostituire il mezzo con terreno di coltura di cellule fresche 5ml e crescere in un incubatore a 28 ° C. Cellule di passaggio ogni 2 o 3 giorni a seconda della crescita delle cellule.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione di plasmidi per la transfezione delle cellule<ol>
<li>Per inserire i frammenti di DNA bersaglio (ad es., Lymantria xylina MNPV (LyxyMNPV) iap3 gene e suoi costrutti di eliminazione) in pDHsp/V5-His PCR-basata clonazione metodo11. Controllare la crescita di colonie trasformate dalla Colonia PCR usando PCR Master Mix (2 X) e il primer pDhsp-F2/Op-IE2R impostata. Confermare le sequenze di plasmide dal servizio commerciale sequenziamento. Nota: La tabella 1 elenca i primers utilizzati per PCR e i costrutti corrispondenti.</li>
		<li>Colonie batteriche sequenziate unica di cultura, che contengono le costruzioni di cui sopra plasmide (punto 1.2) in 200 mL LB medium contenente selezionato antibiotici (50 µ g/mL), rispettivamente.</li>
		<li>Estrarre i plasmidi dalla colta e. coli utilizzando Midi plasmide Kit secondo istruzioni12 del produttore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare mezzo di placcatura con 1,5 mL di terreno di coltura cellulare e 8,5 mL di mezzo di coltura privo di siero cellulare.</li>
	<li>Preparare il terreno di coltura cellulare actinomicina D (ActD) aggiungendo 1,5 µ l di brodo ActD (1 mg/mL) in 10 mL di terreno di coltura cellulare (concentrazione finale = 150 ng/mL). Conservare a 4 ° C.</li>
</ol>2. espressione transiente proteina
<ol><li>Semina cellulare<ol>
<li>Raccogliere le cellule sf9 agitando il matraccio di cultura, rovesciare e cadere la sospensione cellulare per tubo da 50 mL e trasferire 10 µ l in emocitometro mediante una pipetta P10. Contare il numero delle cellule al microscopio ottico.</li>
		<li>Piastra 3 × 105 sf9 cellule in tutti i pozzetti in una piastra a 24 pozzetti per 15 min a temperatura ambiente. Sostituire il mezzo con 0,5 mL di mezzo di placcatura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfezione di plasmidi<ol>
<li>Reagente di transfezione cellulare diluito: diluire 8 µ l di reagente di transfezione delle cellule in 100 µ l mezzo di coltura privo di siero cella e mescolare nel Vortex per 1 s.</li>
		<li>Aggiungere 2 µ g del DNA del plasmide (pDHsp70-Ac-P35/V5-His o pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His o pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His o pDHsp70-Ly-IAP3-anello/V5-His) in 100 µ l di terreno di coltura cellulare privo di siero e mescolare nel Vortex per 1 s (Figura 2).</li>
		<li>Combinare il DNA del plasmide diluito e reagente di transfezione delle cellule diluito (210 µ l) e mescolare nel Vortex per 1 s. Incubare per 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aggiungere 210 µ l di miscela di reagente di transfezione del DNA goccia a goccia sulle celle mediante una pipetta P1000. Incubare a 28 ° C per 5 h.</li>
		<li>Sostituire il mezzo di placcatura con 0,5 mL di mezzo di coltura cellulare utilizzando una pipetta P1000. La piastra a 24 pozzetti con nastro adesivo ed incubare le cellule a 28 ° C per 16 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Le cellule trasfettate di scossa di calore: mettere il piatto in un bagno d'acqua di 42 ° C (galleggianti sulla superficie dell'acqua). Riscaldare per 30 min e riporre la piastra a 24 pozzetti nell'incubatore di 28 ° C.</li>
	<li>Rilevazione dell'espressione della proteina<ol>
<li>Dopo 1 h o shock termico 5h, lavare le cellule con 0,5 mL di tampone PBS 1X brevemente tre volte. Nota: Diluire il tampone PBS 1x tampone PBS 10X aggiungendo 1 mL di tampone PBS 10X a 9 mL sterilizzato ddH2O</li>
		<li>Lisare le cellule con 40 µ l di 1 x tintura di caricamento SDS pipettando su e giù. Nota: Diluire 4 x tintura di caricamento SDS miscelando 30 µ l di tampone PBS 1X e 10 µ l di tampone campione SDS: 4x.</li>
		<li>I campioni della proteina a 98 ° C per 10 min in un blocco di calore di calore, rotazione verso il basso per 1 min e messo sul ghiaccio per l'analisi di Western blot.</li>
		<li>Western blot analisi Seguire la procedura di analisi occidentale della macchia da Eslami e Lujan13. Eseguire gel SDS-PAGE14: un gel sottoposto al blu di Coomassie macchiatura (controllo di carico per verificare che la quantità di proteina campioni caricati in ogni bene è uguale in quantità) e l'altro sottoposti a Western blot test, secondo Eslami e Lujan13 .</li>
		<li>Rilevare le proteine di fusione V5-taggati con anticorpo di coniglio anti-V5 (5 mg/mL) (diluizione 1: 5000 nel buffer di TBST a lavorare concentrazione 1 µ g/mL) e coniugato di capra anti-coniglio IgG-rafano perossidasi (HRP) (0,8 mg/mL) (diluizione 1: 10000 nel buffer TBST per lavoro concentrazione 0.08 µ g/mL). Nota: Regolare la percentuale di poliacrilammide al 17,5% quando il peso molecolare della proteina sia < 17 kDa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. anti-apoptotiche analisi di attività
<ol><li>Apoptosi cellulare indotta da gene: ripetere la procedura di cui sopra da 2.1 a 2.3. Co-transfect 1 µ g di DNA (gene di induttore di apoptosi contenenti) pDHsp/D-rpr/bandiera-His plasmide con 1 µ g di DNA plasmidico [pDHsp70/V5-His vector (controllo negativo), pDHsp70-Ac-P35/V5-His (controllo positivo), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His o pDHsp70-Ly-IAP3-anello/V5-His, rispettivamente.]. Alle 5h post-calore trattamento d'urto, condurre l'analisi di attuabilità delle cellule (Figura 2).</li>
	<li>Apoptosi cellulare indotta da chimica: ripetere la procedura di cui sopra da 2.1 a 2.3. Al punto 2.1.2, piastra 1 x 106 sf9 celle in ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Transfect 4 µ g di DNA plasmidico [pDHsp70/V5-His vector (controllo negativo), pDHsp70-Ac-P35/V5-His (controllo positivo), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His o pDHsp70-Ly-IAP3-anello/V5-His, rispettivamente.]. A scossa di post-calore 5h, trattiamo sf9 cellule con 2 mL di terreno di coltura cellulare ActD per 16 h e condurre l'analisi di attuabilità delle cellule (Figura 2). Nota: Volume minimo per coprire un pozzetto della piastra a 6 pozzetti è di 1 mL.</li>
	<li>Eseguire gli esperimenti di analisi attività anti-apoptotica sopra, tra cui 3.1 e 3.2 in triplici copie.</li>
</ol>4. cellule
<ol><li>Lavare le cellule trattate con l'aggiunta di 1 mL di tampone PBS 1X per 1 min 3 volte. Risospendere le cellule pipettando 1 mL di tampone di PBS 1x contenente blu di trypan 0,04% e macchia per 3 min a temperatura ambiente. Trasferire la sospensione cellulare in una microprovetta 1,5 mL. Nota: 0,4% trypan blu soluzione diluita da 9 mL di 1X PBS buffer e 1 mL 0,4% trypan blu soluzione di miscelazione.</li>
	<li>Trasferire 10 µ l trypan blu-macchiato cella sospensione per l'emocitometro con una pipetta P10 e contare le cellule vitali intatti sotto un microscopio chiaro.</li>
	<li>Analisi statistica<ol>
<li>Calcolare i dati registrati e presentare come il mezzo ± S.D. per tutti i conteggi.</li>
		<li>Analizzare i dati utilizzando il test di Student a due code t di con Microsoft Excel. Definire i dati statisticamente significativi come P-valore < 0.05.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculoviruses+as+gene+expression+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Baculoviruses as gene expression vectors.</a> Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).</li>
<li>Theilmann, D. A., et al. Family Baculoviridae. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTheilmann%2C+DA+%22Virus+Taxonomy%3A+Eighth+Report+of+the+International+Committee+on+Taxonomy+of+Viruses%22">Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses</a>. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Springer Press. New York. 1129-1185 (2005).</li>
<li>Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H. Determination of nucleopolyhedrovirus' taxonomic position. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNai%2C+YS+%22Biological+Control+of+Pest+and+Vector+Insects%22">Biological Control of Pest and Vector Insects</a>. Shields, V. D. C. , InTech Press. Rijeka. 169-200 (2017).</li>
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<li>Jarvis, D. L., Finn, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifying+the+insect+cell+N-glycosylation+pathway+with+immediate+early+baculovirus+expression+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors.</a> Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).</li>
<li>Clem, R. J., Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+programmed+cell+death+by+the+baculovirus+genes+p35+and+iap%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap.</a> Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).</li>
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<li>Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+promoters+for+transient+gene+expression+in+cultured+mosquito+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells.</a> Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).</li>
<li>Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s13355-016-0403-x">Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay.</a> Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).</li>
<li>Geneaid™. Geneaid™ Midi Plasmid Kit & Geneaid™ Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) Instruction Manual Ver. 05.11.17. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.geneaid.com/sites/default/files/PI13_0.pdf">http://www.geneaid.com/sites/default/files/PI13_0.pdf</a> (2017).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+Blotting%3A+Sample+Preparation+to+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Western Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), e2359(2010).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , Cambridge, MA. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page">https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page</a> (2017).</li>
<li>Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+reaper-induced+apoptosis+by+interaction+with+inhibitor+of+apoptosis+proteins+%28IAPs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Il concetto di sistema basati su shock cellulare pDHsp/V5-His/sf9 calore era in primo luogo descritto da Clem et nel 19948. Confronto del promotore del gene di baculovirus (IE1) e Drosophila hsp70 ha mostrato che quel hsp70 aveva una maggiore efficienza nella zanzara cellule10. Inoltre, a causa dell'induzione di scossa di calore, la tempistica dell'espressione della proteina potrebbe essere controllata precisamente dopo trattamento di sho...

Due sistemi di espressione della proteina sono stati comunemente utilizzati per la produzione di proteine: sistemi di espressione proteica prokaryote (sistema di espressione del gene diEscherichia coli ) e sistemi di espressione della proteina dell'eucariota. Un sistema di espressione della proteina eucariote popolare è il baculovirus espressione vettoriale sistema (BEVS)1. Baculoviridae in primo luogo sono stati usati come agenti di controllo biologico in tutto il mondo dell'agricoltura e della foresta di parassiti. Negli ultimi decenni, Baculoviridae sono stati sviluppati come strumenti biotecnologici per vettori di espressione di proteine pure. I genomi di Baculoviridae sono costituiti da DNA circolare a doppia elica e avvolti i nucleocapsids2. Ad oggi, più di settantotto baculovirus isolati sono state sequenziate3. Basato sulla cascata temporale di baculovirus espressioni di gene in cellule di insetto ospitante, trascrizione genica poteva essere classificata in quattro cascate temporale, compreso immediati-presto, geni di in ritardo-inizio, fine e molto fine4.
BEVSs sono stati indicati in modo che i promotori di geni molto tardi (cioè, poliedro o p10 promotore) sono stati usati per guidare i geni bersaglio, mentre il baculovirus ricombinanti è stato generato da una ricombinazione omologa. Espressione delle proteine straniere in cellule di insetto di baculovirus ricombinanti è simile a quella delle proteine dei mammiferi a modificazioni post-traduzionali (adatti per la produzione di glicoproteina). Così, il baculovirus è stato ampiamente usato5,6,7. Tuttavia, una limitazione è la presenza di vie di N-glicosilazione differenti in cellule di insetto7.
Di conseguenza, un nuovo sistema di espressione di baculovirus, il sistema di espressione del gene transitoria, è stato sviluppato. Questo sistema esprime geni estranei sotto l'unità di baculovirus immediati-presto promotori (promotore diie-1 ) in cellule di insetto. Utilizzando questo sistema, la proteina bersaglio può essere espresso immediatamente sotto il controllo del promotore ie-1 durante la modifica la via di N-glicosilazione in cellule di insetto, con conseguente migliore oligosaccaridi N-collegati7. Inoltre, geni immediati-presto baculovirus sono trascritti dalla RNA polimerasi II cellula ospite e non richiedono alcun fattore virale per attivazione4. Di conseguenza, proteine straniere possono essere espresso in cellule di insetto in breve tempo. Ad oggi, il transitorio sistema di espressione genica è una delle tecnologie più importanti per l'esecuzione di saggi funzionali della proteina in baculovirus in vitro sistema di coltura cellulare. Il sistema può essere applicato per analizzare la funzione di baculovirus o proteine straniere. Uno dei sistemi di espressione genica transitoria commercialmente disponibile si basa sui promotori di geni immediati-presto (IE) di Orgyia pseudotsugata virus nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 e OpIE1 promotori).
Tuttavia, il livello inferiore di espressione di geni estranei in cellule di insetto era ancora un problema quando il sistema di espressione del gene transitoria basata sul promotore di OpIE è stato usato8,9,10. Così, un altro sistema di espressione genica transitoria è stato costruito in base il promotore della drosofila calore shock protein 70 (hsp70) gene di8,9. Il promotore di hsp70 funziona più efficientemente di baculovirus IE promotore quando indotta da shock termico in cellule di insetto10. In questo sistema, sono stati espressi i geni bersaglio sotto l'unità del promotore di Drosophila heat shock 70 (Dhsp70). Geni estranei possono essere facilmente clonati nel plasmide di espressione genica transitoria con i metodi di clonazione PCR-basati. Inoltre, il controllo di temporizzazione per l'espressione genica può essere eseguito tramite induzione di scossa di calore.
In questo rapporto, seguiamo l'approccio ed esprimere tre diversi troncamenti del gene di baculovirus (inibitore dell'apoptosi 3, iap3 da Lymantria xylina MNPV) utilizzando il sistema di espressione basati su scossa transitoria della proteina di calore e applicare ulteriormente queste proteine espresse sulla analisi delle attività anti-apoptotica. Questo sistema può sia esprimere proteine straniere rapidamente o essere applicato alla valutazione delle attività anti-apoptotica della proteina in cellule sf9, pur avendo anche il potenziale per essere applicato ad altre analisi di attività della proteina.

<table><tbody><tr><td>Antibiotico-Antimicotico, 100X</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>per coltura cellulare di insetti</td></tr><tr><td>Siero bovino fetale certificato</td><td>Bioind</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM</td><td>Thermo Fisher</td><td>10902096</td><td>terreno di coltura cellulare privo di siero</td></tr><tr><td>Cellule Sf9 ATCC</td><td></td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>Pallone per coltura cellulare da 25 cm2</td><td>Nunc, Thermo Fisher</td><td>156340</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia ottica invertita</td><td>WHITED</td><td>WHITED WI-400</td><td></td></tr><tr><td>RBC HIT Competent Cell</td><td>Bioman</td><td>RH618-J80</td><td>Escherichia coli (DH5&alpha;)</td></tr><tr><td>L.B. Brodo (Miller)</td><td>Bioman</td><td>LBL407</td><td></td></tr><tr><td>Agar, grado batteriologico</td><td>Bioman</td><td>AGR001</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invitrogen</td><td>ant-zn-1</td><td>selezione antibiotico</td></tr><tr><td>PCR Master Mix (2X)</td><td>ThermoFisher</td><td>K0171</td><td></td></tr><tr><td>Geneaid Midi Plasmid Kit (senza endotossine)</td><td>Geneaid</td><td>PIE25</td><td></td></tr><tr><td>Actinomycin D</td><td>SIGMA</td><td>A9415</td><td></td></tr><tr><td>Corning Provette da centrifuga da 50 mL</td><td>SIGMA</td><td>CLS430829-500EA Provette</td> da <td>50 mL</td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>Gizmo Supply Co</td><td>B-CNT-SLDE-V2</td><td></td></tr><tr>Nunc<td>multipiatto a 24 pozzetti</td><td>, Thermo Fisher</td><td>142475</td><td>piastra a 24 pozzetti</td></tr><tr><td>Reagente Cellfectin II</td><td>Reagente per transfectina cellulare</td><td>Thermo Fisher</td><td></td></tr><tr><td>10362100 PBS-Phosphate-Buffered Soluzione salina (10X) pH 7,4</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>4&volte; Colorante di caricamento SDS</td><td>Bioman</td><td>P1001</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P (membrane assorbenti PVDF)</td><td>Membrane Merck Milipore</td><td>IPVH00010</td><td>PVDF</td></tr><tr><td>Sistema di celle Mini Trans-Blot</td><td>BIO-RED</td><td></td><td>1703930 Dispositivo di blotting</td></tr> Soluzione <tr><td>Ponceau S</td><td>SIGMA</td><td>6226-79-5</td><td></td></tr><tr><td>Anti-V5</td><td>SIGMA</td><td>V8137</td><td>anticorpo</td></tr> <tr><td>anti-V5 di coniglioCapra anti-coniglio IgG-rafano perossidasi (HRP)</td><td>Jackson</td><td>111-035-003</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Merck</td><td>817072</td><td></td></tr><tr><td>6-Well Multidish</td><td>Nunc, Thermo Fisher</td><td>145380</td><td></td></tr><tr><td>0,4 % soluzione di tripano blu</td><td>AMRESCO</td><td>K940-100ML</td><td></td></tr><tr><td>P10 pipettatore</td><td>Gilson F144802</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipettatore</td><td>Gilson</td><td></td><td></td>F123602</tr><tr><td>Nastro</td><td>Symbio</td><td>PPS7</td><td>Nastro a 24 pozzetti ( 19 mm&volte; 36 M)</td></tr></tbody></table>

espressione transiente di geni estranei in cellule di insetto (sf9) per analisi funzionale della proteina

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Il sistema di espressione genica transitoria è una delle tecnologie più importanti per l'esecuzione di analisi funzionale della proteina in baculovirus in vitro sistema di coltura cellulare. Questo sistema è stato sviluppato per esprimere stranieri geni sotto il controllo del promotore baculovirus in plasmidi di espressione transiente. Inoltre, questo sistema può essere applicato a un'analisi funzionale del baculovirus sé o proteine straniere. Il sistema di espressione genica transitoria più ampiamente e commercialmente disponibile è sviluppato sul promotore del gene immediati-presto (IE) di Orgyia pseudotsugata virus nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). Tuttavia, è stato osservato un livello basso di espressione di geni estranei in cellule di insetto. Di conseguenza, un sistema di espressione genica transitoria è stato costruito per migliorare l'espressione della proteina. In questo sistema, plasmidi ricombinanti sono stati costruiti per contenere la sequenza di destinazione sotto il controllo del promotore (Dhsp70) 70 di Drosophila calore shock. Questo protocollo presenta l'applicazione di questo calore shock-base pDHsp/V5-His (epitopo V5 con 6 istidina) /Spodoptera frugiperda cell sistema (sf9 cella); Questo sistema è disponibile non solo per l'espressione genica ma anche per valutare l'attività anti-apoptotica di candidato proteine in cellule di insetto. Inoltre, questo sistema può essere sia transfected con un plasmide ricombinante o co-trasfettate due plasmidi ricombinanti potenzialmente funzionalmente antagonistiche in cellule di insetto. Il protocollo dimostra l'efficienza di questo sistema e fornisce un caso pratico di questa tecnica.

L'intera lunghezza e altri due troncamenti (domini BIR e anello) di Ly-IAP3 da LyxyMNPV overexpressed in cellule sf9, basato sul calore shock-base pDHsp/V5-His /Spodoptera frugiperda (sf9 cella) sistema di celle. Il pDHsp/V5-His conteneva un promotore di un proteina di scossa calore di Drosophila , che aziona l'espressione genica a valle ad una temperatura di 42 ° C condizione utilizzando fattori trascrizionali cellulari e la traduzione del sistema (...

Questo protocollo descrive un sistema di espressione di proteina indotta da scossa di calore (sistema pDHsp/V5-His/sf9 cellulare), che può essere utilizzato per esprimere proteine straniere o per valutare l'attività anti-apoptotica di potenziali proteine straniere e loro troncato amminico acidi in cellule di insetto.

Espressione transiente di geni estranei in cellule di insetto (sf9) per analisi funzionale della proteina

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

L'obiettivo generale di questo sistema di espressione proteica indotto da shock termico è quello di valutare l'attività anti-apoptotica delle proteine in due proteine potenzialmente antagoniste funzionalmente nelle cellule di insetti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulle funzioni e le attività delle proteine candidate in biotecnologia e proteomica, come le loro attività anti-apoptotiche e le interazioni proteiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i tempi di espressione genica sono controllati dall'induzione dello shock termico.Quindi questo metodo può fornire informazioni sullo stato funzionale delle proteine. Può anche essere applicato ad altri sistemi, come l'espressione proteica dei mammiferi. Le cellule di insetto Spodoptera frugiperda, o Sf9, utilizzate in questo protocollo vengono coltivate in terreno di coltura cellulare in fiasche di coltura cellulare da 25 centimetri quadrati a 28 gradi Celsius.Agitare il pallone per coltura cellulare per staccare le cellule dal pallone. Quindi controlla al microscopio ottico per assicurarti che circa l'80% delle cellule sia staccato. Trasferire il 50% della sospensione cellulare in un nuovo pallone

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Metodi di impiego di sistemi di trasduzione alfavirus esprimere reporter fluorescente in vitro e in zanzare adulte sono descritti. Questa tecnica può essere adattato per esprimere qualsiasi proteina di interesse in sostituzione o in aggiunta ad un giornalista.

Sistema alfavirus trasduzione: Strumenti per la visualizzazione di infezione in Vettori Mosquito

Qui si descrive un modo per esprimere antigeni di superficie del virus dell'influenza piegati correttamente e funzionali derivati ​​dal romanzo virus H7N9 cinese in cellule di insetto. La tecnica può essere adattata per esprimere ectodomains di eventuali proteine ​​di superficie virali o cellulari.

Espressione dei funzionali ricombinante emoagglutinina e neuraminidasi proteine ​​del virus Novel H7N9 Influenza utilizzando l&#39;espressione sistema Baculovirus

L'espressione di proteine ricombinanti da parte dei sistemi dei mammiferi sta diventando un metodo attraente per la produzione di complessi proteici per la biologia strutturale. Qui presentiamo un sistema di espressione semplice ma altamente efficiente che utilizza cellule di mammifero cresciute in sospensione per purificare complessi proteici per studi strutturali.

Espressione della proteina ricombinante di Biologia Strutturale in HEK 293F cellule in sospensione: un approccio nuovo e accessibile

In questo studio è stata confrontata l'espressione di una proteina ricombinante umana bersaglio in diverse piattaforme di produzione. Ci siamo concentrati sulle colture tradizionali basate su fermentatori e sugli impianti, descrivendo il set-up di ciascun sistema ed evidenziando, sulla base dei risultati riportati, i limiti e i vantaggi intrinseci per ogni piattaforma.

Un&#39;analisi comparativa di espressione della proteina ricombinante in diversi biofabbriche: batteri, cellule di insetto e impianti

La produzione su scala di laboratorio di proteine eucariotiche con appropriate modifiche post-traduzionali rappresenta un ostacolo significativo. Ecco un protocollo robusto con rapida instaurazione e inversione di tendenza per l'espressione proteica utilizzando un sistema di espressione nei mammiferi. Questo sistema supporta la selettività degli amminoacidi, la marcatura selettiva delle proteine e i modulatori di piccole molecole della composizione dei glicani.

High Yield Espressione di proteine ​​ricombinanti umane con il Transient Trasfezione delle cellule HEK293 in sospensione

Studiare canali ionici, attraverso un sistema di espressione eterologhi è diventata una tecnica di base nella ricerca biomedica. In questo manoscritto, presentiamo un metodo efficiente tempo per realizzare canali ionici strettamente controllato eseguendo trasfezione transiente sotto il controllo di un promotore inducibile.

Controllabile Espressione Ion Canale attraverso inducibile trasfezione transiente

Nonlytic sistemi di espressione di cellule di insetto sono sottoutilizzate per la produzione, il traffico cellulare / localizzazione, e analisi funzionale proteina ricombinante. Qui, descriviamo metodi per generare vettori di espressione e successiva espressione proteica transiente in cellule lepidotteri disponibili in commercio. La co-localizzazione di Bemisia tabaci acquaporine con proteine marker fluorescenti subcellulare è anche presentato.

Espressione transitoria e Localizzazione cellulare di proteine ​​ricombinanti in cellule in coltura per insetti

Qui, presentiamo un protocollo per produrre casa volare carbossilesterasi proteine in vitro con un sistema di espressione di baculovirus mediata delle cellule di insetto e successivamente funzionalmente caratterizzano i loro ruoli in che metabolizza permetrina, quindi, che conferisce piretroidi resistenza conducendo basati su cellule MTT assay e in vitro gli studi metabolici.

Caratterizzazione funzionale di Carboxylesterases in casa resistente all'insetticida mosche, Musca Domestica

Qui, presentiamo i protocolli per l'utilizzazione del insetto cella e baculovirus proteina espressione sistema per produrre grandi quantità di proteine vegetali secernuta per cristallizzazione della proteina. Un vettore di espressione di baculovirus è stato modificato con GP67 o insetto hemolin peptide di segnale per espressione di secrezione della proteina vegetale in cellule di insetto.

Modifica di vettori di espressione di Baculovirus per produrre secreti proteine vegetali nelle cellule di insetto

Il baculovirus expression vector system (BEVS) è una solida piattaforma per lo screening dell'espressione e la produzione di proteina arginina metiltransferasi (PRMT) da utilizzare per studi biochimici, biofisici e strutturali. Quantità di milligrammo di materiale possono essere prodotte per la maggior parte dei PRMT e di altre proteine di interesse che richiedono una piattaforma di espressione eucariotica.

Produzione di proteine PRMT ricombinanti utilizzando il baculovirus Expression Vector System

La trasformazione germinale di successo nel verme dell'esercito autunnale, Spodoptera frugiperda,è stata ottenuta utilizzando l'mRNA della trasposasi iperattiva piggyBac.

Piggy iperattivoTrasponsi-mediata dalla trasposizione della linea germinale nel verme dell'esercito autunnale, Spodoptera frugiperda

Impara a esprimere geni estranei nelle cellule Sf9 mediante induzione da shock termico per valutare l'attività anti-apoptotica delle proteine. Questo metodo controllato offre approfondimenti sullo stato funzionale delle proteine in biotecnologia.

Espressione transiente di geni estranei in cellule di insetto (sf9) per analisi funzionale della proteina

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