L'iniezione intramiocardica ecocardiografia-guida percutanea contrasto e consegna delle cellule in un modello preclinico grande

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di erogare in modo sicuro e accurato un volume di iniettato nel miocardio ventricolare sinistro del cuore del coniglio. E per farlo sfruttando la guida dell'ecocardiografia con mezzo di contrasto percutaneo. Ciò si ottiene anestetizzando prima l'animale e quindi preparando il torace per la procedura.

Successivamente, dopo aver posizionato il coniglio su una coperta termica e verificato che un segnale ECG sia visualizzato correttamente, utilizzare un sistema a ultrasuoni clinico per ottenere una finestra acustica appropriata e ottimizzare l'immagine in un ampio campo visivo. Quindi, dopo aver caricato la siringa con cellule marcate miscelate con un mezzo di contrasto adatto e sotto guida ecografica, allineare attentamente l'ago di fronte al trasduttore e posizionarlo vicino alla pelle dell'emitorace sinistro, prima di rallentare l'avanzamento dell'ago verso la regione bersaglio del miocardio. Infine, l'iniettato viene erogato in modo sicuro, come dimostrato dall'iperecogenicità transmurale nel sito di iniezione nell'immagine ecocardiografica.

In definitiva, la conferma ex vivo del successo della somministrazione di iniettato è dimostrata dalla presenza di colorante nel miocardio, mentre l'analisi immunoistochimica trasversale di sezioni di tessuto miocardico viene utilizzata per mostrare il successo della somministrazione di un marcatore cellulare e di un colorante nel miocardio bersaglio. Lo scopo di questo video è quello di dimostrare come eseguire questa tecnica in modo sicuro e accurato, per le nostre possibilità, sul coniglio di oggi, utilizzando un sistema di ecocardiografia clinica. I principali vantaggi di questa tecnica sono la natura minima e basilare della macchina e la capacità di utilizzare la guida ecocardiografica con mezzo di contrasto per una visualizzazione precisa dei siti target di iniezione, riducendo così al minimo il rischio di erogazione accidentale dell'intercamera.

Prima di procedere con l'iniezione intramiocardica, iniziare iniettando una combinazione di ketamina e medetomidina per anestetizzare l'animale. Come dimostrato, il coniglio rimane calmo quando la testa è coperta da una coperta chirurgica. Una volta che l'animale è stato anestetizzato, utilizzare un tagliacapelli per rimuovere i peli dalla pelle del torace, iniziando da sotto il collo e poi spostandosi verso la regione subxifoidea.

Radere regioni aggiuntive da uno a tre centimetri della faccia interna dell'arto anteriore destro e delle regioni tibiali mediali di entrambi gli arti posteriori destro e sinistro. Quindi, applicare un gel conduttore adatto agli elettrodi e posizionarli nelle regioni rasate degli arti. Fissare gli elettrodi con del nastro chirurgico per evitare la perdita di contatto durante lo spostamento dell'animale durante la procedura.

Successivamente, posizionare l'animale su una coperta termica, verificare che sullo schermo del sistema venga visualizzato un segnale ECG corretto, mantenere l'animale in posizione supina da decubito e consentire all'animale di respirare spontaneamente durante la somministrazione di ossigeno tramite maschera facciale durante l'intera procedura. Pulire e disinfettare accuratamente la pelle rasata del torace con una soluzione a base di clorexidina. Per mantenere un buon contatto della pelle con il trasduttore, ridurre gli artefatti e migliorare la qualità complessiva dell'immagine, applicare una quantità sufficiente di gel per ultrasuoni sul trasduttore.

Quindi, posizionare manualmente il trasduttore dal quarto al sesto spazio intercostale a due o tre centimetri di distanza dalla linea parasternale destra e con un angolo di incidenza del fascio di ultrasuoni di circa 90 gradi, rispetto alla parete toracica. Assicurarsi che il segno di orientamento del trasduttore sia rivolto in avanti per facilitarne l'allineamento con l'ago nei passaggi successivi. Dovresti ottenere una vista parasternale dell'asse corto del cuore a livello dei muscoli papillari.

Ed è importante avere un ampio campo visivo aumentando la profondità con il controllo appropriato nel sistema. Se necessario, regolare la posizione del trasduttore rispetto allo spazio intercostale, nonché il suo angolo anteroposteriore e dorso-ventrale per ottimizzare l'immagine, quindi identificare in questa vista il ventrico destro, il ventricolo sinistro, il ventricolo sinistro, il setto interventricolare, l'IVS, la parete posteriore, il PW, nonché i muscoli papillari antero-retromediali. Prestare particolare attenzione per ottenere un'immagine simmetrica in questa vista, nonché un'appropriata differenziazione delle contorsioni endocardiche ed epicardiche e, se necessario, regolare attraverso controlli di ottimizzazione dell'immagine come il controllo del guadagno.

Una volta ottenuta la corretta visione ecocardiografica, mantenere questa posizione per tutto il resto della procedura mentre un secondo operatore esegue l'iniezione intramiocardica. A tal fine, utilizzare una siringa precaricata con un ago inserito che deve essere posizionato vicino alla pelle dell'emitorace sinistro in una posizione di specchiatura simmetrica rispetto al trasduttore. Quindi, allineare manualmente l'ago con il segno di orientamento del trasduttore con un angolo di circa 90 gradi e far avanzare lentamente l'ago attraverso la pelle e nella cavità toracica.

L'inserimento percutaneo dell'ago in questa posizione e orientamento consente la visualizzazione dell'ago nel piano del fascio di ultrasuoni, consentendo così il monitoraggio in tempo reale e, quando necessario, la regolazione della posizione dell'ago rispetto alla regione target del miocardio, come mostrato qui. Si noti in questa immagine, la presenza dell'ago nella camera ventricolare sinistra, mostrata dalle punte di freccia. Questo può essere facilmente riposizionato ritraendo delicatamente e riposizionando l'ago nella posizione desiderata.

Con la punta nella posizione target, erogare lentamente l'iniettato per un periodo di 20-30 secondi, ritraendo lentamente e delicatamente l'ago per aumentare l'entità del miocardio trattato. Eseguire sottili modifiche all'angolo di incidenza dell'ago, se necessario, per completare le iniezioni in quattro siti di iniezione intramiocardica. Uno nel setto intraventricolare e tre nella parete libera del ventricolo sinistro ed erogano un volume di 250 microlitri di iniettato per sito di iniezione.

Dopo aver completato la procedura, continuare a monitorare le scansioni ecocardiografiche della finestra biseriale del coniglio, nonché i tracciati ECG per verificare l'assenza di complicanze secondarie alla procedura, fino a quando l'animale non è completamente sveglio dall'anestesia. L'uso del monitoraggio ECG Holter 24 ore su 24 è consigliabile per aiutare a determinare gli effetti delle iniezioni intramiocardiche sul ritmo cardiaco. Utilizzando il protocollo qui descritto, una volta che il posizionamento intramiocardico della punta dell'ago è stato confermato dall'ecocardiografia e l'iniezione è stata avviata, l'iperecogenicità transmurale è stata osservata durante la somministrazione di inchiostro di china nella regione bersaglio in questa vista parasternale dell'asse corto, punte di freccia bianche.

L'iperecogenicità è stata osservata anche poco dopo l'iniezione, come mostrato in questa vista parasternale dell'asse lungo del cuore, dove un'immagine luminosa dell'eco può essere chiaramente vista sulle punte delle frecce bianche del setto interventricolare. Quando l'iniezione intramiocardica è stata immediatamente seguita dall'eutanasia, i depositi di inchiostro di china erano facilmente visibili all'esame esterno del cuore, come mostrato in questa immagine. Punte di freccia nere.

Allo stesso modo, le sezioni di tessuto cardiaco a livello dei muscoli papillari hanno rivelato depositi transmurali di inchiostro di china nella parete libera delle punte di freccia nere del ventricolo sinistro, dimostrando una somministrazione efficiente ed efficace di iniettato nel miocardio. In questa stessa immagine, un deposito di inchiostro di china era visibile anche al setto interventricolare. Freccia bianca.

Sebbene la procedura sia stata generalmente ben tollerata, è stato molto comune osservare un'accelerazione o una decelerazione transitoria della frequenza cardiaca, associata a contrazioni ventricolari premature isolate, PVC, sia durante che subito dopo la procedura. Infatti, il monitoraggio con ECG Holter delle 24 ore negli animali che hanno ricevuto iniezione intramiocardica con inchiostro di china ha rivelato che le aritmie erano molto comuni e che la loro frequenza relativa poteva essere influenzata dallo stato fisiologico sottostante dell'animale. Questa immagine mostra un esempio di PVC isolato, l'aritmia più frequentemente osservata, rilevata durante il monitoraggio Holter.

Un confronto tra un gruppo di conigli con fenotipo normale e un gruppo di conigli che hanno ricevuto somministrazione endovenosa di Doxorubicina, o DOX, un farmaco cardiotossico e antitumorale, per otto settimane. Prima dell'iniezione intramiocardica con inchiostro di china indicava che i PVC isolati erano significativamente più frequenti nel gruppo DOX. Altre aritmie rilevate dal monitoraggio Holter ECG in entrambi i gruppi sono state distici in PVC, triplette in PVC e tachicardia ventricolare non sostenuta.

Significativamente, mentre la frequenza cardiaca media nei gruppi normale e DOX era comparabile, la deviazione standard degli intervalli da normale a normale, da R a R, o SDNN, una misura delle dinamiche non lineari correlate allo stato di salute del cuore, ha mostrato una marcata riduzione nel gruppo trattato con doxorubicina. Prima della procedura, il successo della trasfezione della proteina fluorescente verde potenziata, cellule marcate eGFP positive, è stata confermata da una microscopia a fluorescenza durante le condizioni di coltura cellulare in vitro. Quindi, dopo l'iniezione intramiocardica, che è stata immediatamente seguita dall'eutanasia, è stato dimostrato il successo della somministrazione di cellule marcate positive all'eGFP nel miocardio attraverso l'analisi immunoistochimica di sezioni di tessuto cardiaco.

Quindi, come mostrato in questa immagine, erano presenti abbondanti cellule marcate all'interno del miocardio. Punte di freccia nere, intervallate da depositi di inchiostro di china. Depositi di inchiostro di china e abbondanti cellule positive all'eGFP, punte di freccia bianche, erano ancora presenti quando l'eutanasia è stata ritardata di 24 ore dopo l'iniezione intramiocardica.

Da notare che in questo momento è stata osservata una risposta infiammatoria acuta, con neutrofili che si infiltravano nel miocardio, frecce rosse, suggerendo una risposta acuta di rigetto cellulare alle cellule xenogeniche che erano state trapiantate. L'infiammazione acuta è stata osservata anche 24 ore dopo l'iniezione intramiocardica con il solo inchiostro di china. Tuttavia, in questo caso, le cellule predominanti che si infiltravano nel miocardio erano i macrofagi.

Punte di freccia bianche. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un'iniezione intramiocardica percutanea, guidata dall'ecocardiografia con mezzo di contrasto in un cuore di coniglio. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 25 minuti dopo la stasi.