Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico derivato di cellule staminali embrionali umane in un modello di atrofia geografica gran-eyed

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare un modello animale di atrofia geografica con occhi grandi per trapiantare cellule epiteliali pigmentate retiniche di derivazione embrionale umana nell'occhio e valutare l'integrazione delle cellule del donatore utilizzando la tomografia a coerenza ottica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della medicina rigenerativa, come il trattamento basato sulle cellule staminali per le malattie degenerative. Il vantaggio principale di questo ambiente chirurgico è la fonte illimitata di cellule sane e l'impostazione chirurgica per l'iniezione sottoretinica, che ha molte somiglianze con una procedura destinata al paziente.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della degenerazione maculare legata all'età attraverso l'ostentazione di cellule epiteliali pigmentate retiniche derivate da cellule staminali embrionali umane. Il nostro tecnico animale, Monica Aronsson, tiene in posizione il coniglio in modo da poter visualizzare e riprendere la retina con la tomografia a coerenza ottica. Dopo aver anestetizzato un coniglio secondo il protocollo di testo, posizionare il coniglio sotto il microscopio operatorio con la testa rivolta verso il chirurgo.

Quindi, utilizzare un divaricatore palpebrale per rimuovere le palpebre e un panno sterile per rimuovere la membrana dei nittitani. Per la microchirurgia, utilizzare una tecnica di pars plana transvitreale a 25 porte a due porte o a tre porte opzionale con trocar non valvolari per l'inserimento di strumenti microchirurgici. La macchina per vitrectomia multifunzione è dotata di porte per collegare una cannula per infusione, un'endoilluminazione, un vitrectore e un endolaser.

Per le iniezioni sottoretiniche, è obbligatoria solo l'endoilluminazione, il che rende sufficiente una configurazione a due porte. Usando una pinza per coaguli per afferrare e spostare la congiuntiva, delineare il sito di inserimento. Inserire trasversalmente uno dei due trocar superiori, a uno o due millimetri dal limbus, con un angolo parallelo del limbus da trenta a quarantacinque gradi.

Procedere all'inserimento del trocar al centro della punta. Quindi, ruotare il trocar di novanta gradi e farlo avanzare nell'occhio, puntando al polo posteriore. Ciò impedirà la fuoriuscita post-chirurgica da questa sclerotomia e ridurrà anche il rischio di endoftalmite.

Ripetere con il secondo trocar superiore. Quando si inserisce il trocar, è importante essere a uno o due millimetri dal limbus per incanalare l'inserzione e puntare al polo posteriore per ridurre al minimo il rischio di infezione, sanguinamento del vitreo, distacco della retina e tocco della nostra lente. Applicare lacrime sintetiche come gel contratto sulla cornea, quindi posizionare una lente a contatto piatta monouso sulla cornea per visualizzare la retina.

Quindi, versare cinquecento microlitri di iodato di sodio in una siringa da un millilitro collegata a un tubo di prolunga azionato da un assistente e a una cannula poli-ribaltata calibro 38 azionata dal chirurgo. Inserire la sonda di endoilluminazione attraverso il trocar superiore sinistro. Quindi, inserire la cannula di iniezione attraverso il trocar superiore destro e far avanzare la cannula attraverso lo spazio vitreo verso la retina, mirando all'area appena sotto la testa del nervo ottico.

Lascia che la punta della cannula tocchi lentamente la retina fino a quando non è visibile uno sbiancamento focale. Non lasciare che la cannula penetri nella retina poiché ciò potrebbe causare emorragie. Ora, penetrando la retina con l'ago, iniettare cinquanta microlitri di iodato di sodio per via sottoretinica in un periodo di cinque secondi.

Poiché esiste un piano di scissione naturale tra la retina e la coroide sottostante, durante l'iniezione dovrebbe formarsi gradualmente una bolla semitrasparente chiaramente visibile. Durante l'iniezione, ritrarre lentamente l'ago ma assicurarsi che la punta sia mantenuta all'interno della vescicola per ridurre al minimo il reflusso. Dopo la rimozione dell'endoilluminazione e della cannula di iniezione, utilizzare una pinza per coaguli per rimuovere i trocari.

Quindi utilizzare la punta, o l'estremità smussata della pinza, per applicare una leggera pressione per trenta secondi alla sclerotomia senza sutura a tenuta morbida. Durante il recupero, prendersi cura dell'animale secondo il protocollo di testo e attendere sette giorni per il trapianto. Sette giorni dopo l'iniezione di iodato di sodio e dopo la somministrazione intravitreale di Triamcinolone, secondo il protocollo di testo, rimuovere il mezzo di differenziazione cellulare da un monostrato hESC-RPE confluente a ventiquattro pozzetti e utilizzare cinquecento microlitri di PBS senza calcio e magnesio per lavare ogni pozzetto.

Dopo aver tripsinizzato le cellule, inclinare la piastra e rimuovere con cautela la tripsina per consentire alle cellule di rimanere attaccate alla piastra. Raccogliere le cellule in ottocento microlitri di terreno di differenziazione fresco preriscaldato a trentasette gradi Celsius mediante pipettaggio delicato, o anche raschiando se necessario, per ottenere una sospensione a singola cellula. Utilizzando il punto zero del due percento di tripano blu, contare le cellule in una camera dell'emocitometro secondo le istruzioni del produttore.

Quindi aggiungere cinque millilitri di terreno di differenziazione alla sospensione cellulare e centrifugare le cellule a trecento volte g, a temperatura ambiente per cinque minuti. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in PBS sterilizzato con filtro fresco a una concentrazione finale di mille cellule per microlitro. Aliquotare la precedente sospensione cellulare in aliquote da seicento microlitri e tenerle in ghiaccio fino e durante l'intervento chirurgico.

Dopo aver anestetizzato il coniglio e dilatato le pupille secondo il protocollo di testo, posizionare il coniglio con la testa rivolta verso il chirurgo. Utilizzare il divaricatore palpebrale per rimuovere le palpebre e un panno sterile per rimuovere la membrana dei nittitani. Per la microchirurgia, utilizzare una tecnica di pars plana transvitreale calibro 25 a due porte o a tre porte opzionale con trocar posizionati nelle stesse posizioni come dimostrato in precedenza in questo video.

Se le sclerotomie precedenti sono visibili, eseguire l'inserimento del trocar proprio adiacente ma non attraverso questi siti di inserimento per ridurre al minimo il rischio di perdite postoperatorie. Applicare lacrime sintetiche sull'occhio come prima e posizionare una lente a contatto piatta monouso sulla soluzione sulla cornea per visualizzare la retina. Dopo aver posizionato correttamente la punta e mirato al centro dell'area pretrattata di iodato di sodio, caratterizzata da un caratteristico riflesso di endoilluminazione metallica, iniettare sottoretinamente cinquanta microlitri di una sospensione hESC-RPE delicatamente miscelata.

La retina neurosensoriale dovrebbe separarsi facilmente, creando una bolla chiaramente visibile. Durante l'iniezione, ritrarre lentamente l'ago ma assicurarsi che la punta sia mantenuta all'interno della vescicola per ridurre al minimo il reflusso. Dopo la rimozione dell'endoilluminazione e della cannula di iniezione, utilizzare una pinza per coaguli per rimuovere i trocar e utilizzare l'estremità smussata della pinza per applicare una leggera pressione per trenta secondi come prima.

Utilizzare una tomografia a coerenza ottica a dominio spettrale, o dispositivo SD-OCT, con il software in dotazione per ottenere scansioni B in sezione trasversale degli animali trattati, secondo le istruzioni del produttore. Posizionare l'animale anestetizzato e dilatato con la pupilla in un supporto regolabile per ottenere un percorso senza ostacoli dalla sorgente luminosa dello strumento alla retina del coniglio. Per evitare la sfocatura dell'immagine, mantenere la cornea umida con soluzione fisiologica topica ogni trenta-sessanta secondi.

Ottenere almeno tre scansioni OCT con scansione confocale a infrarossi simultanei, oftalmoscopia laser o immagini di riferimento confocali in riflettanza SLO che rappresentano la parte superiore, centrale e inferiore dell'area iniettata. Ottieni più colori laser simultanei di immagini del fondo oculare en-face con riflettanza laser confocale SLO blu, verde, infrarossa e multicolore. Acquisisci immagini in autofluorescenza a luce blu utilizzando la funzionalità laser a luce blu del dispositivo SD-OCT.

Qui sono mostrate immagini rappresentative in vivo di BAF, IR-cSLO e SD-OCT di una normale retina di coniglio albina. Un ingrandimento dell'immagine SD-OCT illustra i diversi strati retinici con i loro livelli distintivi di riflessione della luce catturati dallo strumento SD-OCT. Come mostrato in questa immagine SD-OCT, presa tre mesi dopo l'iniezione di cinquanta microlitri di una soluzione millimolare di iodato di sodio, si crea una bolla che risolve e degenera progressivamente la retina esterna.

Si può osservare un assottigliamento degli strati neuroretinici più esterni nelle aree SD-OCT e ipo-BAF, corrispondente alla perdita di RPE, ricreando così un fenotipo GA-like. Dopo l'identificazione dell'area del danno, cinquantamila cellule hESC-RPE sono state reiniettate per il trapianto, creando una seconda bolla che si è risolta. Sono presenti aree iper-BAF da lievi a moderate con un iper-BAF focalmente aumentato al confine dell'area di danno, indicativo di stress cronico dell'RPE nativo.

La bolla corrispondente all'iniezione di hESC-RPE in occhi non pretrattati che mostrano macchie di cellule pigmentate nell'immagine MC e strutture retiniche ben conservate nella scansione SD-OCT è mostrata per confronto. La padronanza di questo metodo clinico per l'iniezione sottoretinica faciliterà il trapianto clinico di trattamento cellulare per condizioni, come la degenerazione maculare legata all'età. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impostare le iniezioni sottoretiniche in un modello di tipo di vita, come preparare una cellula derivata da cellule staminali embrionali umane per le iniezioni sottoretiniche e come visualizzare l'integrazione delle cellule del donatore utilizzando la tomografia a coerenza ottica.