Name: Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico derivato di cellule staminali embrionali umane in un modello di atrofia geografica gran-eyed (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Scopri il trapianto subretinico di cellule epiteliali del pigmento retinico derivate da cellule staminali embrionali umane in un modello di atrofia geografica. Questo protocollo avanzato utilizza la tomografia a coerenza ottica per valutare l'integrazione cellulare.

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Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dal Karolinska Institute, Fondazione della Crown Princess Margareta per i non vedenti, la Fondazione di Jordan Edwin per ricerca oftalmologica, la Fondazione svedese di occhio, il re Gustav V Foundation, la ARMEC Fondazione di Lindeberg e la Fondazione di Cronqvist.

Il seguente protocollo segue le indicazioni di cura degli animali di Karolinska Instituet. Tutti gli esperimenti su animali utilizzando Nuova Zelanda conigli albini (Tabella materiali) sono stati approvati dal comitato di etica animale regionale (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd) (permesso: dnr 56/15). L'uso di hESC (dnr 2011/745-31/3) e il trasferimento e la manipolazione di hESC-RPE (dnr 2013/813-31/2) è anche secondo la legislazione svedese e i regolamenti del Karolinska Institutet ed è stato approvato dalla (Comitato regionale etica umana Regionala Etikprövningsnämnden ho Stoccolma).
1. subretinal iniezione di iodato di sodio (NaIO3) in un modello animale di gran-eyed
<ol><li>Anestetizzare gli animali di somministrazione intramuscolare nella coscia con una miscela di 35 mg/kg ketamina e 5 mg/kg xylazina in Salina usando una siringa da 30 G, e dilatare le pupille con colliri topici utilizzando un mix di 0,75% di Ciclopentolato e 2,5% di fenilefrina. Amputate corretta è confermato se l'animale non reagisce a un pizzico duro della zampa posteriore.</li>
	<li>Posizionare il coniglio sotto il microscopio chirurgico con la testa rivolta verso il chirurgo (Figura 1A). Utilizzare un riavvolgitore di coperchio per rimuovere le palpebre e nictitans membrana con un panno sterile per ridurre al minimo il rischio di contaminazione. Uso equilibrato di soluzione salina (BSS) per prevenire la secchezza mentre nell'ambito dell'anestesia in entrambi gli occhi.</li>
	<li>
Per microchirurgia, uso una porta 2 (o 3-porta opzionale) 25 G transvitreal pars plana tecnica con trocar non valvolato per l'inserimento di microsurgical strumenti (Figura 1B). La macchina multifunzione vitrectomia ha porte per collegare una cannula infusione endoilluminazione, vitrector ed endolaser. Per preparazioni iniettabili subretinal, solo l'endoilluminazione è obbligatoria, che rende un set-up 2 porte sufficiente. Inserire il endoillumation attraverso il trocar sinistro superiore e utilizzare il trequarti destro superiore per la cannula iniezione subretinal.
	<ol>
<li>Per un set-up di 3-porta, utilizzare il trocar temporale inferiore per la cannula di infusione di BSS. Se gli strumenti opzionali (ad esempio un vitrector) sono utilizzati, inserirli attraverso il trocar di destro superiore.</li>
		<li>Inserire il 2 trocar superiore 1-2 mm dal limbus utilizzando artigliate pinze per afferrare e spostare la congiuntiva che ricopre il sito di inserimento.</li>
		<li>Assicurarsi che il trocar sono inseriti transsclerally ad un angolo di 30-45° limbus parallela e procedere verso il centro della punta del trocar. Poi girare il trocar 90° e avanzare nell'occhio, che mira al polo posteriore dell'occhio. Questa procedura sarà evitare perdite post-chirurgica dalla sclerotomies e anche diminuire il rischio di endoftalmite (cioè, infezione batterica nell'occhio). Vedi anche Figura 2B per le posizioni di trocar.</li>
		<li>Mettere una lente a contatto monouso piatto sulla cornea di visualizzare la retina, con le lacrime sintetiche come gel di contatto tra l'occhio e la lente a contatto (Figura 1A).</li>
		<li>Disegnare 500 µ l di NaIO3 in una siringa da 1 mL, collegato ad un tubo di prolunga (operato dall'assistente) e una cannula di polytip 38 G (operati dal chirurgo).</li>
		<li>Inserire la sonda endoilluminazione attraverso il trocar di sinistra superiore e la cannula di iniezione attraverso il trocar di destra superiore e fare avanzare la cannula attraverso lo spazio vitreo verso la retina, con l'obiettivo per la zona appena sotto la testa del nervo ottico.</li>
		<li>Permettere che la punta della cannula lentamente toccare la retina fino a quando uno sbiancamento focale è visibile. L'iniezione stessa penetrerà la retina, permettendo per consegna subretinal. Non lasciare che la cannula penetrare la retina, poiché ciò potrebbe causare l'emorragia.</li>
		<li>Iniettare 50 µ l di NaIO3 subretinally su un periodo di 5 s. Poiché c'è un aereo di fenditura naturale fra la retina e della coroide sottostante, una vescichetta semitrasparente chiaramente visibile dovrebbe formare gradualmente durante l'iniezione.</li>
		<li>Durante l'iniezione, lentamente, ritirare l'ago, ma assicurarsi che la punta sia mantenuta entro la vescichetta per minimizzare il reflusso.</li>
		<li>Dopo la rimozione della cannula endoillumation e iniezione, rimuovere il trocar usando il forcipe artigliato e applicare una leggera pressione per 30 s per il sclerotomies di sutura-meno autosigillante usando la punta o l'estremità smussata delle pinze.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cappetta dare 10 mL di soluzione fisiologica per via sottocutanea per prevenire la disidratazione. Non do post-chirurgici steroidi topici o antibiotici. Per gli analgesici dare 0,5 mL di buprenorfina 0,3 mg/ml per via sottocutanea dopo l'intervento, come pure il giorno dopo l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Dopo l'uso, lavare tutti gli strumenti, immergerli per un paio di secondi in primo luogo in etanolo al 70%, in secondo luogo in etanolo al 45% e infine in acqua distillata. Asciugarli correttamente con un tovagliolo di carta.</li>
	<li>Frequentare gli animali fino a che riprenda conoscenza sufficiente e metterli tutti singolo ingabbiato. Se necessario (ad esempio, per scopi di immunoistochimica), eutanasia animali tramite iniezione endovenosa di 100 mg/kg pentobarbital (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Attendere 7 giorni per procedere con il trapianto di cellule hESC-RPE.</li>
</ol>2. subretinal trapianto di cellule hESC-RPE in animali trattati
<ol><li>Somministrare 2 mg (100 µ l) di triamcinolone intravitreal in animali anestetizzati utilizzando un ago per iniezione 30g inserito 1-2 mm dal limbus nel quadrante temporale inferiore 1 settimana prima del trapianto di CSE-RPE e ri-amministrarlo ogni 3 mesi. Assicurarsi di puntare la punta verso il polo posteriore dell'occhio per evitare un tocco di lente.</li>
	<li>Un monostrato hESC-RPE come descritto in precedenza1della coltura.</li>
	<li>Media di differenziazione delle cellule (Vedi Tabella materiali), di un monostrato confluente 24 pozzetti hESC-RPE di rimuovere e lavare ogni bene con 500 µ l di PBS senza Ca2 + e Mg2 +. Ripetere questa azione ancora una volta, per un totale di 2 lavaggi.</li>
	<li>Eliminare il surnatante, aggiungere 500 µ l di tripsina ogni pozzetto e incubare per 12 min a 37 ° C.</li>
	<li>Inclinare il piatto e rimuovere con cautela la tripsina (celle devono rimanere agganciate alla piastra). Raccogliere le cellule in 800 µ l di fresco 37 ° C preriscaldati differenziazione media pipettando delicato, o raschiare anche se necessario, per ottenere una sospensione di singola cellula. Nota: Utilizzare un colino di cella di 40 µm se si osservano cellule ciuffi.</li>
	<li>Numero di celle in una camera di un emocitometro usando 0.2% Trypan Blue, secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Aggiungere 5 mL di differenziazione le cellule di media e centrifuga a temperatura ambiente, 300 x g per 5 min.</li>
	<li>Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in PBS appena sterilizzati con filtro (passato attraverso un filtro per siringa 25 mm) a una concentrazione finale di 1.000 cellule / µ l.</li>
	<li>Aliquotare la precedente sospensione cellulare in 600 µ l aliquote e tenere il ghiaccio fino a e durante la chirurgia.</li>
	<li>Anestetizzare gli animali di somministrazione intramuscolare nella coscia con una miscela di 35 mg/kg ketamina e 5 mg/kg xylazina salina utilizzando una siringa di 30 G. Dilatare le pupille con i eyedrops d'attualità usando amix di 0,75% di Ciclopentolato e 2,5% di fenilefrina. Amputate corretta è confermato se l'animale non reagisce a un pizzico duro nella sua gamba posteriore.</li>
	<li>Posto il coniglio con la testa rivolta verso il chirurgo. Utilizzare un riavvolgitore di coperchio per rimuovere le palpebre e nictitans membrana con un panno sterile per ridurre al minimo il rischio di contaminazione. Utilizzare BSS per prevenire la secchezza mentre nell'ambito dell'anestesia in entrambi gli occhi.</li>
	<li>
Per microchirurgia, uso una porta 2 (o 3-porta opzionale) 25 G transvitreal pars plana tecnica con trocar posizionato nella stessa posizione come descritto al punto 1.3 e Figura 2. Se il sclerotomies precedente sono visibili, eseguire inserimento trocar appena adiacente, ma non attraverso questi, per ridurre al minimo il rischio di perdita postoperatoria.
	<ol>
<li>Mettere una lente a contatto monouso piatto sulla cornea di visualizzare la retina, con le lacrime sintetiche come il gel di contatto tra l'occhio e la lente a contatto (Figura 1A).</li>
		<li>Dopo Punta corretto posizionamento (Vedi i passaggi 1.3.5 e 1.3.6), iniettare 50 µ l di una sospensione delicatamente miscelato hESC-RPE (50.000 cellule) subretinally. Obiettivo per il centro della zona di3 pretrattati NaIO distinto da un riflesso di caratteristici "metallico" endo-illuminazione. La retina neurosensoriale dovrebbe separare facilmente creando una vescichetta chiaramente visibile. Filo dell'ago con sterile di H2O tra conigli/dopo utilizzare per evitare ago intasamento grazie alla cella ciuffi. Cambia l'ago quando intasamento è notato.</li>
		<li>Durante l'iniezione, lentamente di ritrarre l'ago ma assicurarsi che la punta sia mantenuta entro la vescichetta per minimizzare il reflusso.</li>
		<li>Dopo la rimozione della cannula endoillumation e iniezione, rimuovere il trocar usando il forcipe artigliato e applicare una leggera pressione per 30 s per il sclerotomies di sutura-meno autosigillante usando la punta o l'estremità smussata delle pinze.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cappetta dare 10 mL di soluzione fisiologica per via sottocutanea per prevenire la disidratazione. Non do post-chirurgici steroidi topici o antibiotici. Per gli analgesici dare 0,5 mL di buprenorfina 0,3 mg/ml per via sottocutanea dopo l'intervento, come pure il giorno dopo l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Dopo l'uso, lavare tutti gli strumenti, immergerli per un paio di secondi, in primo luogo in etanolo al 70%, in secondo luogo in etanolo al 45% e infine in acqua distillata. Asciugarli correttamente con un tovagliolo di carta.</li>
	<li>Frequentare gli animali fino a che riprenda conoscenza sufficiente e metterli tutti singolo ingabbiato. Se necessario (ad esempio per scopi di immunoistochimica), eutanasia animali tramite iniezione endovenosa di 100 mg/kg pentobarbital.</li>
</ol>3. in Vivo della retina e Subretinal Imaging
<ol><li>
Utilizzare un dispositivo di (SD-OCT) la tomografia ottica di coerenza dominio spettrale con il software in dotazione (Vedi tabella materiali) per ottenere a sezione trasversale b-scansioni degli animali trattati, secondo le istruzioni del produttore. Per evitare la sfocatura dell'immagine, assicurarsi di mantenere umida la cornea irrigando con soluzione fisiologica topico ogni 30-60 s.
	<ol>
<li>Sistemare gli animali anestetizzati e pupilla dilatata (vedere i passaggi 1.1 e 2.10) in un supporto regolabile per ottenere un percorso senza ostacoli dalla sorgente di luce strumento alla retina di coniglio.</li>
		<li>Ottenere almeno 3 OCT scansioni con oftalmoscopia laser infrarosso-confocale simultanea scansione immagini di riferimento di riflettanza (IR-cSLO) che rappresenta la parte superiore, centrale e inferiore del sito di inoculo.</li>
		<li>Ottenere immagini del fondo it-viso con cSLO blu, verde, infrarossi e multicolor laser riflettanza (cioè, più colori laser simultanea), rispettivamente.</li>
		<li>Catturare immagini di autofluorescence luce blu (BAF) utilizzando la funzionalità blu-luce laser del dispositivo SD-OCT.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Plaza Reyes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-Free+and+Defined+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigment+Epithelial+Cells+Functionally+Integrate+in+a+Large-Eyed+Preclinical+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model.</a> Stem Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2016).</li>
<li>Bartuma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Imaging+of+Subretinal+Bleb-Induced+Outer+Retinal+Degeneration+in+the+Rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">In Vivo Imaging of Subretinal Bleb-Induced Outer Retinal Degeneration in the Rabbit.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (4), 2423-2430 (2015).</li>
<li>Petrus-Reurer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+Subretinal+Suspension+Transplants+of+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigment+Epithelial+Cells+in+a+Large-Eyed+Model+of+Geographic+Atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Integration of Subretinal Suspension Transplants of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells in a Large-Eyed Model of Geographic Atrophy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1314-1322 (2017).</li>
<li>Carido, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+mouse+model+with+complete+RPE+loss+and+its+use+for+RPE+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of a mouse model with complete RPE loss and its use for RPE cell transplantation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5431-5444 (2014).</li>
<li>Lund, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+cells+rescue+visual+function+in+dystrophic+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats.</a> Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).</li>
<li>Vugler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+phenomenon+of+HESC-derived+RPE%3A+anatomy+of+cell+genesis%2C+expansion+and+retinal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation.</a> Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).</li>
<li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).</li>
<li>Hughes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+schematic+eye+for+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">A schematic eye for the rabbit.</a> Vision Res. 12 (1), 123-138 (1972).</li>
<li>Blanch, R. J., Ahmed, Z., Berry, M., Scott, R. A., Logan, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22603978">Animal models of retinal injury.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 2913-2920 (2012).</li>
<li>Nork, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+anatomic+consequences+of+subretinal+dosing+in+the+cynomolgus+macaque%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque.</a> Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).</li>
</ol>

Nessuno degli autori hanno interessi concorrenti o conflitto di interessi.

In questo protocollo, la generazione di un modello di grandi occhi di GA e suo uso preclinico per valutare hESC-RPE integrazione in vivo è descritto.
Per la traduzione di terapie rigenerative per GA e malattie correlate nella clinica7, è importante sviluppare e ottimizzare metodi che acquisire fedelmente i metodi clinici per trapianto e di imaging. Il coniglio è in questo aspetto attraente: ha un occhio relativamente grande che permette l'ambulatorio intraocula...

Questo protocollo descrive la generazione di un modello preclinico dagli occhi grandi di atrofia geografica (GA) che permette la valutazione dell'integrazione dei trapiantati hESC-RPE nello spazio subretinal. I metodi descritti in dettaglio qui sono stati utilizzati in 3 pubblicazioni recenti che illustrano la produzione di una popolazione arricchita, pura e funzionale di cellule RPE da hESC1, come pure la creazione di danno retinico esterno e un fenotipo simile a GA indotto tramite l'iniezione subretinal di soluzioni saline fisiologiche (cioè, BSS e PBS) o NaIO3 , occhio del coniglio2,3. Abbiamo ulteriormente dimostrato che trapianti di sospensione sub-retinico di hESC-RPE formano monostrati vasti funzionali con fotorecettore soccorso capacità2.
Diversi vantaggi accompagnano l'uso dell'occhio di coniglio per la generazione di un modello di GA di malattia. In primo luogo, la dimensione dell'occhio di coniglio, che è del 70% il volume di un occhio umano adulto, consente il trapianto clinicamente significativo usando una densità di cella che è molto inferiore di quanto abitualmente utilizzati per occhi piccoli roditori (1.000 cellule / µ l vs 50.000 cellule / µ l)4 , 5. in secondo luogo, chirurgia nei roditori è di solito transscleral attraverso la coroide, che compromette la barriera della retina e potenzialmente attiva una risposta infiammatoria e un eventuale rifiuto6. Entrambi fattori insieme possono portare a multilayering e aggregazione delle cellule trapiantate e un'integrazione nel complesso scadente delle cellule trapiantate in un tessuto retinico nativo perturbato. Tuttavia, il modello di coniglio dagli occhi grandi consente di effettuare una tecnica chirurgica con strumentazione identica a una regolazione clinica. In terzo luogo, un modello di grandi dimensioni-eyed consente anche ad alta risoluzione in vivo imaging e monitoraggio delle cellule trapiantate e la retina sovrastante attraverso tempo1,2,3. Così, descriviamo un modello preclinico clinicamente rilevante e costo-efficiente che dovrebbe essere un'alternativa attraente ai roditori per chiunque con un interesse nella ricerca della retina normale e malata e lo spazio sub-retinico.

<table><tbody><tr><td>NutriStem hESC XF mezzo di differenziazione - bFGF e &ndash; TGFb</td><td>Biological Industries</td><td>06-5100-01-1A</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select 1x</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Corp</td><td>12563-011</td><td></td></tr><tr><td>PBS senza Ca2+ e Mg2+</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Corp</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare 40 &mu; m Nylon</td><td>VWR</td><td>732-2757</td><td></td></tr><tr><td>Ago 30 G 0,5' &rsquo;; 0,3 mm x 13 mm</td><td>BD Microlance</td><td>304827</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc 25 mm Filtro per siringa</td><td>Acrodisc</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>0,4% tripano blu</td><td>ThermoFisher Scientific Corp</td><td>15250061</td><td>Utilizzare allo 0,2%</td></tr> <tr><td>NaIO3</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>S4007</td><td></td></tr><tr><td>BSS</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>65079550</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Solveco AB</td><td>1047</td><td></td></tr><tr><td>Ketaminolo, 100 mg/mL</td><td>Intervet, Boxmeer</td><td>511519</td><td>Utilizzare 35 mg/kg di ketamina</td></tr><tr><td>Rompun veterinario, 20 mg/mL</td><td>Bayer Animal Health</td><td>22545</td><td>Utilizzare 5 mg/kg di xilazina</td></tr><tr><td>Triescenza, 40 mg/mL</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>412915</td> 2 mg di ciclepala-fenilefrina <td>per via intravitaria</td></tr><tr><td>, 0,75% + 2,5%</td> <td>APL</td><td>321968</td><td>Utilizzare 1 goccia in ciascun occhio</td></tr><tr><td>Viscotears</td><td>Laboratoires Th&eacute; a</td><td>597562</td><td></td></tr><tr><td>soluzione salina topica</td><td>Apotea AB</td><td>7053249369080</td><td></td></tr><tr><td>Allfatal vet. 100 mg/mL</td><td>Omnidea</td><td>77168</td><td>Utilizzare 100 mg/mL di pentobarbital</td></tr><tr><td>Tubo di prolunga (Hammer)</td><td>MedOne Surgical Inc</td><td>3223</td><td></td></tr><tr><td>25 G/38 G cannula sottoretinica</td><td>polytip MedOne Surgical Inc</td><td>3219</td><td>25 G/38 G</td></tr><tr><td>Lente piatta monouso</td><td>Volk</td><td></td><td></td>#VWFD10</tr><tr><td>Divaricatore per coperchi Barraquer Colibri</td><td>AgnTho's AB</td><td>42-020-030</td><td></td></tr><tr><td>Trocar senza valvola</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>8065751448</td><td></td></tr><tr><td>Pinze artigliate</td><td>Bausch & Lomb Nordic AB</td><td>ET1811</td><td></td></tr><tr><td>Alcon Accurus 400VS Macchina per vitrectomia</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>8065740238</td><td></td></tr><tr><td>Accurus 25+ Gauge Vitrectomia TotalL Plus Pak</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>8065751493</td><td></td></tr><tr><td>dispositivo SD-OCT</td><td>Heidelberg Engineering</td><td>Spectralis HRA+OCT</td><td>Utilizzare Heidelberg Eye Explorer versione 1.9.10.0</td></tr><tr><td>piastre a 24 pozzetti</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro Neubauer</td><td>VWR</td><td>631-0925</td><td></td></tr><tr><td>Conigli albini della Nuova Zelanda</td><td>Lidk&ouml; pings Rabbit Farm, Svezia</td><td></td><td></td></tr><tr>cellule <td></td><td></td><td>hESC-RPE</td><td>Vedere il numero di riferimento 1</td></tr><tr><td>Buprenodale Vet, 0,3 mg/ml</td><td>Dechra</td><td>660500</td><td>Utilizzare 0,5 mL di buprenorfina per via sottocutanea</td></tr></tbody></table>

subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico derivato di cellule staminali embrionali umane in un modello di atrofia geografica gran-eyed

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Atrofia geografica (GA), la fine della fase di degenerazione maculare senile secca è caratterizzata da perdita dello strato del pigmento retinico epiteliale (RPE), che conduce a degenerazione successiva delle strutture retiniche vitali (ad es., fotorecettori) causando gravi problemi visivi. Allo stesso modo, perdita di RPE e diminuzione dell'acuità visiva è visto in seguito a lungo termine di pazienti con avanzato wet età degenerazione maculare senile (AMD) trattati intravitreale anti-vascolare fattore di crescita endoteliale (VEGF). Pertanto, da un lato, è fondamentale in modo efficiente derivare cellule RPE da una fonte illimitata che potrebbe servire come terapia sostitutiva. D'altra parte, è importante valutare il comportamento e l'integrazione delle cellule derivate in un modello della malattia che comportano chirurgica e metodi di imaging come vicino possibile a quelle applicate negli esseri umani. Qui, forniamo un dettagliato protocollo basato su nostre pubblicazioni precedenti che descrive la generazione di un modello preclinico di GA utilizzando l'occhio di coniglio albino, per valutazione della cellula staminale embrionale umana derivate cellule epiteliali del pigmento retinico (hESC-RPE) in un impostazione clinicamente rilevante. Differenziato hESC-RPE sono trapiantate in occhi ingenui o con NaIO3-indotto GA-come degenerazione retinica utilizzando una tecnica di 25 G transvitreal pars plana. Valutazione delle zone degenerate e trapiantati viene effettuata da multimodale ad alta risoluzione imaging non-invasivo in tempo reale.

Rappresentante in vivo immagini di BAF, IR-cSLO e SD-OCT di una retina di coniglio albino normale sono indicate nella Figura 2. Notare i diversi strati della retina con i loro caratteristici livelli di riflessione della luce catturata dallo strumento SD-OCT.
Nelle figure 1A e 1B di figura, è illustrato il programma di installazione...

Cellule epiteliali del pigmento retinico potrebbero servire come una terapia di sostituzione delle cellule per la forma avanzata di degenerazione maculare senile secca. Questo protocollo descrive la generazione di un modello di grande-eyed di atrofia geografica e il subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico derivati da cellule staminali embrionali umane in questo modello della malattia.

Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico derivato di cellule staminali embrionali umane in un modello di atrofia geografica gran-eyed

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare un modello animale di atrofia geografica con occhi grandi per trapiantare cellule epiteliali pigmentate retiniche di derivazione embrionale umana nell'occhio e valutare l'integrazione delle cellule del donatore utilizzando la tomografia a coerenza ottica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della medicina rigenerativa, come il trattamento basato sulle cellule staminali per le malattie degenerative. Il vantaggio principale di questo ambiente chirurgico è la fonte illimitata di cellule sane e l'impostazione chirurgica per l'iniezione sottoretinica, che ha molte somiglianze con una procedura destinata al paziente.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della degenerazione maculare legata all'età attraverso l'ostentazione di cellule epiteliali pigmentate retiniche derivate da cellule staminali embrionali umane. Il nostro tecnico animale, Monica Aronsson, tiene in posizione il coniglio in modo da poter visualizzare e riprendere la retina con la tomografia a coerenza ottica. Dopo aver anestetizzato un coniglio secondo il protocollo di testo, posizionare il coniglio sotto il micro

subretinal-transplantation-human-embryonic-stem-cell-derived-retinal

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Il trapianto cellulare rappresenta una strategia per il trattamento della degenerazione retinica caratterizzata dalla perdita di fotorecettore. Qui descriviamo un metodo per l'arricchimento dei fotorecettori trapiantabili e il loro innesto subretinale in topi adulti.

Trapianto subretinale di cellule precursori del fotorecettore purificato MACS nella retina del topo adulto

Qui presentiamo un protocollo accettato dalla comunità in formato multimediale per l'iniezione sottoretinica di un bolo di cellule RPE in ratti e topi. Questo approccio può essere utilizzato per determinare i potenziali di salvataggio, i profili di sicurezza e le capacità di sopravvivenza delle cellule RPE trapiantate dopo l'impianto in modelli animali di degenerazione retinica.

Esecuzione sottoretinico Iniezioni in roditori di agire cellule retiniche epitelio pigmentato in sospensione

Epitelio pigmentato retinico (RPE) strategie di sostituzione e la terapia genica basati sono considerati per diverse condizioni degenerative della retina. Per la traduzione clinica, modelli di grandi dimensioni occhio animali sono tenuti a studiare tecniche chirurgiche applicabili nei pazienti. Qui vi presentiamo un modello di coniglio per la chirurgia sottoretinico orientata verso il trapianto di RPE, che è versatile ed economico.

Un passo per passo protocollo per la chirurgia sottoretinico in Conigli

Iniezione subretinal è stato ampiamente applicato negli studi preclinici di terapia sostitutiva delle cellule staminali per degenerazione maculare senile. In questo articolo visualizzato in quel momento, descriviamo una tecnica di iniezione subretinal meno rischioso, riproducibile e precisamente modificati tramite l'approccio trans-sclerale per fornire cellule negli occhi del ratto.

Sviluppo di un protocollo di raffinata per Trans-sclerale Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico umano negli occhi di topo

Descriviamo un metodo per progettare un tessuto retinico composto di cellule epiteliali del pigmento retinico derivate da cellule staminali pluripotenti umane coltivate in cima membrane amniotiche umane e la sua preparazione per l'innesto in modelli animali.

Ingegneria del tessuto di trapianto-adatto del pigmento retinico epitelio derivato da cellule staminali embrionali umane

Qui viene presentata una tecnica chirurgica per il trapianto di tessuto retinico derivato da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) nello spazio sottoretinico di un grande modello animale.

Trapianto sottoretinico di tessuto retinico derivato da cellule staminali embrionali umane in un modello animale felino di grandi dimensioni

Il primate non umano (NHP) è un modello ideale per lo studio delle terapie cellulari retiniche umane a causa delle somiglianze anatomiche e genetiche. Questo manoscritto descrive un metodo per il trapianto submaculare di cellule epiteliali pigmentate retiniche nell'occhio NHP e strategie per prevenire le complicanze intraoperatorie associate alla manipolazione maculare.

Trapianto di epitelio pigmentato retinico in un modello di primati non umani per malattie degenerative della retina

Questo protocollo presenta un approccio trans-sclerale guidato dalla visione transpupillare per fornire in modo sicuro e preciso innesti cellulari sottoretinici, con un basso tasso di complicanze chirurgiche, in riceventi murini con o senza degenerazione retinica.

Trapianto trans-sclerale transpupillare guidato di innesti sottoretinici in un modello murino di degenerazione retinica

Descriviamo un protocollo dettagliato per la preparazione di cellule progenitrici fotorecettrici derivate da hESC post-crioconservate e la somministrazione sub-retinica di queste cellule in topi rd10 .

Somministrazione sottoretinica di progenitori di fotorecettori derivati da cellule staminali embrionali umane in topi rd10

Propagazione di staminali embrionali umane (ES) Cellule

Scopri il trapianto subretinico di cellule epiteliali del pigmento retinico derivate da cellule staminali embrionali umane in un modello di atrofia geografica. Questo protocollo avanzato utilizza la tomografia a coerenza ottica per valutare l'integrazione cellulare.

Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico derivato di cellule staminali embrionali umane in un modello di atrofia geografica gran-eyed (Video) | JoVE Journal

Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico derivato di cellule staminali embrionali umane in un modello di atrofia geografica gran-eyed

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