Utilizzando CRISPR/Cas9 Gene Editing per studiare l'attività oncogena di calreticulina mutante in cellule ematopoietiche Cytokine dipendente

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di utilizzare l'editing genico CRISPR/Cas9 per modellare le mutazioni della calreticulina in cellule ematopoietiche citochine dipendenti al fine di studiare la loro attività oncogenica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neoplasie ematologiche, come la funzione biologica delle mutazioni driver quando sono espresse a livelli fisiologici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza il sistema di editing genetico CRISPR/Cas9 per modellare e studiare la funzione biologica dei geni coinvolti nel cancro.

Per ricuocere e fosforilare gli oligo, aggiungere i reagenti per un totale di 10 microlitri in una provetta per PCR tenuta in ghiaccio. Impostare il programma nel termociclatore. Utilizzare acqua per diluire la reazione al termine del ciclo.

Per digerire il vettore lentiGuide-Puro, preparare 50 microlitri di reazione del digestore. Quindi, inizia la reazione di digestione a 55 gradi Celsius a un blocco di calore. Dopo un'ora, aggiungere un ulteriore microlitro di enzima di restrizione BsmB1 e continuare la reazione per un'altra ora.

Per defosforilare l'osso tagliato alla schiena, aggiungere sette microlitri di tampone di reazione alla fosfatasi e due microlitri di enzima fosfatasi al vettore digestivo. Quindi, incubare la miscela a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Purificare l'osso dorsale già tagliato e defosfilelato utilizzando un kit commerciale.

Per preparare la miscela di legatura, aggiungere 15 nanogrammi di osso dorsale digerito e altri reagenti a una provetta per PCR tenuta in ghiaccio e regolare il volume a 10 microlitri con acqua. Incubare la reazione a temperatura ambiente per un'ora. Quindi trasformare le cellule compatibili con STBL3 con due microlitri della miscela di legatura.

E poi impiattare sulla piastra di agar del brodo di lisogenia contenente 100 microgrammi per millilitro di ampicillina. Successivamente, incubare la piastra per una notte a 37 gradi Celsius. Scegli tre colonie e inoculale.

Eseguire la mini preparazione per ogni coltura e sequenziare il sito di inserzione dell'oligo con un primer della regione del promotore U6. Semina le cellule hek293t su un piatto di 10 centimetri. E lascialo per l'incubazione notturna.

Per preparare la miscela di DNA per la trasfezione, pipettare 45 microlitri del reagente di trasfezione nel DNA. Utilizzare una pipetta per mescolare accuratamente il DNA e il reagente di trasfezione e lasciarlo riposare per 20 minuti. Successivamente, aggiungere la miscela di trasfezione del DNA goccia a goccia sulle cellule seminate.

Agitare delicatamente i piatti. E incubare al 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius per un giorno. Raccogliere il surnatante contenente il virus dopo 24 e 48 ore facendolo passare attraverso un filtro da 0,22 micromitra.

E aliquotare 1,6 millilitri di surnatante in ogni fiala criogenica. Successivamente aspirare il surnatante e risospendere le cellule Ba/F3 in terreno pipettando le cellule su e giù più volte. Aggiungere 500 microlitri di cellule risospese, 1,5 millilitri di surnatante virale, quattro microlitri di polibrene e 10 nanogrammi per millilitro di interleuchina 3 murina in una piastra di coltura tissutale a sei pozzetti.

Centrifugare la piastra a 440 G per 120 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, trasferire la piastra in un incubatore per l'incubazione notturna a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Successivamente, centrifugare le celle a 440 G per tre minuti.

E risospendere in cinque millilitri di terreno caldo fresco in una piastra a sei pozzetti. Per selezionare le cellule infette da Cas9, prima ruotare la cella. E poi risospendere in un terreno caldo fresco integrato con cinque microgrammi per millilitro di blasticidina dopo 48 ore di sterilizzazione.

Continua a selezionare le cellule per nove giorni con la blasticidina fino a quando tutte le cellule non infette sono morte. Quindi, trasferire le cellule resistenti in un terreno con un microgrammo per millilitro di blasticidina. Trasdurre le cellule parentali e le cellule che esprimono stabilmente Cas9 con il costrutto reporter pXPR-011 attraverso l'infezione lentivirale.

Continuare a selezionare le cellule con due microgrammi per millilitro di puromicina per tre giorni, 48 ore dopo la sterilizzazione. Infettare le cellule che esprimono Cas9 con acido ribonucleico guida singolo utilizzando lentivirus. Quindi, utilizzare due microgrammi per millilitro di puromicina per selezionare le cellule per tre giorni, 48 ore dopo la sterilizzazione.

Raggruppare le cellule Ba/F3 a crescita esponenziale che esprimono Cas9 ectopico e l'acido ribonucleico guida singolo di interesse. Aspirare il surnatante e lavare le cellule con cinque millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato. Centrifugare le cellule verso il basso e lavare tre volte con soluzione salina tamponata con fosfato.

Quindi, contare il numero di cellule utilizzando un analizzatore di vitalità cellulare. Successivamente, seminare le cellule in triplicati in due millilitri di terreno fresco senza interleuchina 3 in piastre di coltura a sei pozzetti. Inizia a monitorare e contare le celle ogni due giorni per otto giorni.

Di seguito sono mostrati dati psicometrici rappresentativi del flusso che dimostrano l'attività di Cas9 nelle cellule Ba/F3 parentali e le cellule Cas9 che sovraesprimono Ba/F3. Il segnale della proteina fluorescente verde è ridotto del 76% nelle cellule Cas9 che sovraesprimono Ba/F3, indicando una robusta attività di Cas9, mentre nelle cellule parentali Ba/F3, il segnale della proteina fluorescente verde rimane al 100%. La mutazione frame shift mediata da CRISPR/Cas9 più una coppia di basi è stata introdotta nel locus dell'esone nove della calreticulina utilizzando RNasi guida singola m1 e m2.

Le curve di crescita per le cellule Cas9 del recettore della trombopoietina Ba/F3 mirate alla calreticulina mostrano una crescita indipendente dell'interleuchina 3 murina. Tuttavia, le curve di crescita per gli altri tipi di cellule non mostrano alcuna crescita indipendente dalle citochine. I risultati del sequenziamento confermano l'editing mirato dell'esone nove endogino della calreticulina nelle cellule Cas9 del recettore della trombopoietina Ba/F3 mirate alla calreticulina utilizzando la RNasi guida singola m1 e m2.

Le mutazioni di spostamento del frame della coppia di basi più una sono indicate in nero. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due settimane se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante capire quali tipi di mutazioni nel gene di interesse possono essere responsabili del fenotipo desiderato.

Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi per caratterizzare ulteriormente la mutazione, come il suo ruolo nella segnalazione cellulare o nelle interazioni proteina-proteina, al fine di comprendere ulteriormente il meccanismo con cui causa la malattia. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'ematologia per esplorare l'effetto delle mutazioni con guadagno di funzione a livelli fisiologici sulla trasformazione cellulare nelle cellule ematopoietiche Ba/F3. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la metodologia di editing genico CRISPR/Cas9 per studiare l'attività oncogenica delle mutazioni con guadagno di funzione nelle cellule ematopoietiche dipendenti dalle citochine.

Non dimenticare che lavorare con il lentivirus può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come lavorare in una struttura BL2 plus.