Name: Espressione genica in strati di Aleurone orzo bombardati con aumento della velocità di misura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Scopri come misurare l'espressione genica negli strati di aleurone dell'orzo mediante bombardamento con particelle. Questo protocollo ad alto rendimento combina macinazione automatica e saggi enzimatici in piastra 96 pozzetti per studiare i geni regolati dall'acido abscissico.

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Gli autori ringraziano Greyson Butler e Margaret Barrett per aiuto nello svolgere gli esperimenti, Judy Stone per consigli su omogeneizzazione di grano e Lynn Hannum per consigli su fluorometria. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation (IOB 0443676), di un premio per lo sviluppo istituzionale (IDeA) dal National Institute of General Medical Sciences, della National Institutes of Health, sotto concessione numero P20GM0103423 e da sovvenzioni da la divisione di Colby College di scienze naturali.

1. preparazione del Effector e Gene Reporter costruisce
<ol><li>Costruire costrutti effettrici che impiegano un promotore costitutivo (es. mais ubiquitina, UBI) all'espressione di unità da un telaio di lettura aperto desiderato. Ad esempio, costruire un plasmide contenente UBI::TaABF1 di forte espressione costitutiva unità di TaABF15.</li>
	<li>Costruire costruzioni del reporter che includono il promotore cui attività deve essere misurato, posto a Monte di un open reading frame, come GUS. Ad esempio, costruire un plasmide contenente HVA1::GUS per misurare l'espressione dal promotore HVA1 2,5.</li>
	<li>Costruire un costrutto di controllo interno (ad es. UBI::luciferasi).</li>
	<li>Utilizzando una colonna di silice associazione protocollo (Vedi Tabella materiali), preparare il plasmide di alta qualità per ciascuno dei costrutti gene richiesto. Usando la spettroscopia ultravioletta (Vedi Tabella materiali), accuratamente misurare la concentrazione di ogni preparazione del plasmide.</li>
</ol>2. preparazione di chicchi d'orzo per il bombardamento
<ol><li>Impostare un foglio di calcolo (per un esempio, vedere Figura 1 ) che indica i plasmidi che saranno bombardati, i trattamenti ormonali appropriati e altre informazioni pertinenti per ogni trattamento che sarà parte dell'esperimento.</li>
	<li>Utilizzando una lama di rasoio sterile e un tagliere, tagliare gli embrioni da chicchi di orzo Himalaya (40 per ogni trattamento incluso nell'esperimento). Escludere i grani che sono scolorite o sostanzialmente più piccole della media.</li>
	<li>Posizionare tutti i grani embryoless in una provetta da 50 mL. Aggiungere 40 mL di acqua e roccia per 10 minuti.</li>
	<li>Versare l'acqua con attenzione (per evitare di perdere i grani) e aggiungere 40 mL di candeggina al 10%. Roccia per 20 minuti.</li>
	<li>Versare la candeggina e aggiungere 40 mL di acqua sterile. Roccia per 5 minuti. Ripetere questo lavaggio di acqua sterile quattro volte di più.</li>
	<li>Aggiungere 40 mL di soluzione di Imbibing (succinato del sodio di 20 mM, 20 mM di cloruro di calcio, pH 5.0) e 40 μL di soluzione di riserva di cloramfenicolo (10 mg/mL).</li>
	<li>Trasferire la maggior parte della soluzione (con cloramfenicolo) assorbendo dal tubo in una piastra di Vermiculite (Vedi Tabella materiali). Quindi trasferire i grani sulla superficie della carta da filtro bagnata nella piastra di Vermiculite. Stendere in modo uniforme i grani. Versare in una soluzione abbastanza semplice per mantenere i grani parzialmente (ma non completamente) sommerso. Posizionare il coperchio sopra la piastra di Vermiculite.</li>
	<li>Incubare i grani embryoless a 24 ° C per circa 48 h con illuminazione fluorescente. Aggiungi ulteriori Imbibing soluzione come necessario.</li>
	<li>Aprire una capsula di Petri 90 mm plastica e versare 20 mL di soluzione di Imbibing nel piatto stesso e 20 mL nel coperchio rovesciato. Aggiungere 20 μL di cloramfenicolo (10 mg/mL) a ciascuno. Sterilizzare due paia di pinze a punta fine tuffandoli in alcool.</li>
	<li>Posto alcuni dei grani embryoless nel coperchio della piastra di petri. Utilizzando le pinze, rimuovere delicatamente il cappotto di seme (trasparente) da ogni grano. Durante la rimozione il cappotto di seme dal lato liscio del grano, non danneggiare le celle sottostanti (aleuronico). Trasferire il grano pelato di Petri contenente soluzione assorbendo.</li>
	<li>Dopo il cappotto di seme da tutti i grani di peeling, restituirli alla piastra di Vermiculite. Incubare i grani embryoless pelati a 24 ° C per 16-20 ore.</li>
	<li>Appena prima di usare i grani per il bombardamento, togliere l'umidità superficiale agitando loro tra carta da filtro in una capsula di Petri.</li>
</ol>3. preparazione del DNA del plasmide per bombardamento
<ol><li>Etichettare una provetta da 1,5 mL per ogni trattamento che verrà inclusi nell'esperimento bombardamento. A ciascuna provetta aggiungere 2,5 µ g di UBI:: plasmide controllo internoluciferasi , 2,5 µ g di un plasmide del reporter GUS e la quantità desiderata (in genere 0.025 µ g 2,5 µ g) di un plasmide dell'effettore. Aggiungere acqua per portare il volume totale a 5 µ l.</li>
	<li>Preparare 1,6 µm oro microcarriers (Vedi Tabella materiali) pubblicati protocolli6.</li>
	<li>Per ogni trattamento, aggiungere 50 µ l di sospensione microcarriers nella provetta da 1,5 mL contenente il DNA del plasmide. Cappotto microcarriers con DNA plasmidico secondo protocolli6 del produttore.</li>
	<li>Nella fase finale, quando il microcarriers rivestite con plasmide sono sospese in 48 µ l 100% di etanolo, dispensare 8 μL di sospensione microcarriers su ognuno dei cinque macrocarriers e consentire loro di aria secca.</li>
</ol>4. particelle bombardamento di chicchi d'orzo Embryoless
<ol><li>Impostare l'apparecchio di bombardamento di particelle (Vedi Tabella materiali)6.</li>
	<li>Inserire un disco di rottura psi 1550 il tappo ritegno e montarla sullo strumento.</li>
	<li>Posizionare un macrocarrier contenente la combinazione desiderata plasmide (insieme a una schermata di arresto) nel microcarrier lancio assieme. Inserire il gruppo nell'alloggiamento superiore della camera del bombardamento. Impostare la distanza tra il disco di rottura mantenendo il tappo e il coperchio di copertura macrocarrier alla distanza standard (6 mm) e inserire il supporto di schermo di arresto dalla posizione centrale (standard), che permette una distanza di viaggio di macrocarrier di 11 mm (Figura 2A).</li>
	<li>Organizzare embryoless 8 grani a raggiera stretto (con l'estremità più sottile punta verso l'interno) su un cerchio di carta da filtro che è registrato giù piatta al coperchio di una piastra di petri di 90 mm (Vedi Figura 2B).</li>
	<li>Posizionare il piatto con i grani nella camera di bombardamento, ad una distanza di 6 cm dalla schermata di arresto.</li>
	<li>Evacuare la camera di bombardamento a 95 kPa e poi bombardare il campione.</li>
	<li>Dopo aver rilasciato il vuoto, è possibile trasferire i grani hanno bombardati a una capsula di Petri con etichetta 60 mm contenente 4 mL di soluzione di Imbibing contenente 1 mg/ml di cloramfenicolo.</li>
	<li>Ripetere fino a quando tutti i bombardamenti sono stati completati. Incubare (su una piattaforma d'agitazione a 100 giri/min) a 24 ° C per 24 ore.</li>
</ol>5. estrazione della proteina solubile dai grani hanno bombardati
<ol><li>Usando il forcipe, rimuovere i 8 grani bombardati da una capsula di Petri 60mm e asciugare loro secco su un tovagliolo di carta. Dividere i grani in due tubi etichettati 2,0 mL (4 grani per tubo) ognuno dei quali contiene 800 μL rettifica Buffer (100 mM Na fosfato pH 7.2, 5 mM DTT, 10 µ g/mL leupeptina, 20% glicerolo) e una perlina di acciaio di 5 mm. Ripetere questo processo per tutti i cereali hanno bombardati.</li>
	<li>Inserire due cesti dell'omogeneizzatore perlina (fino a 48) 2,0 mL provette (Vedi Tabella materiali). Montare i rack sull'omogeneizzatore.</li>
	<li>Agitare i campioni a 30 Hz per 3 minuti.</li>
	<li>Rimuovere il rack omogeneizzatore dall'omogeneizzatore e metterli su ghiaccio (5 min) per ri-raffreddare i campioni.</li>
	<li>Montare i rack torna sull'omogeneizzatore - nell'orientamento opposto. Agitare nuovamente i campioni a 30 Hz per 3 minuti.</li>
	<li>Raffreddare le cremagliere su ghiaccio, quindi ripetere i passaggi 5.3 a 5.5. Questo aggiungerà fino a un totale di 12 minuti di agitazione.</li>
	<li>Centrifugare gli estratti di grano a 16.000 x g a 4 ° C per 10 minuti.</li>
	<li>
Decantare immediatamente dopo la centrifugazione, i sovranatante chiari in un secondo set di tubi per microcentrifuga. Dare ogni tubo un vortice veloce. Conservare i capillari sul ghiaccio.</li>
	<li>Dopo aver trasferito il supernatante, recuperare le sfere d'acciaio dai pellet così possono essere lavati e riutilizzati.</li>
</ol>6. misurazione di attività luciferasica da estratti di grano
<ol><li>Per ogni provetta di estrazione grana deve essere analizzato, preparare una provetta di vetro 12 mm x 75 mm contenente 200 μL di miscela di Luciferase Assay (45 mM Tris pH 7,7, 15 mM MgCl2, 20mm DTT, 1,5 mM EDTA, luciferina di 1 mM, 1 mM ATP del solfato).</li>
	<li>Aggiungere 100 μL del primo estratto di grano per il primo tubo di dosaggio. Vortice rapidamente per mescolare bene. Immediatamente inserire il tubo nel supporto del tubo del luminometro e chiudere la porta. Quando la misurazione è terminata, estrarre il tubo dal luminometro – lasciando la porta aperta per il posizionamento del tubo successivo.</li>
	<li>Ripetere questo processo fino a quando tutti i campioni sono stati misurati.</li>
</ol>7. misurazione dell'attività GUS da estratti di grano
<ol><li>Aggiungere 200 μL di tampone del saggio GUS (50mm Na fosfato pH 7.2, 2,5 mM 4-methylumbelliferyl - D-glucuronide, 10 mM DTT, 2 mM EDTA, 10 µ g/mL leupeptina, 20% metanolo, 0,02% di sodio azide) in ciascun pozzetto di una piastra ben 96.</li>
	<li>Mettere 50 μL di ogni estrazione grana nella corrispondente bene. Mescolare con la punta dopo l'aggiunta. Sigillare la parte superiore con pellicola sigillante.</li>
	<li>Incubare la piastra ben 96 a 37 ° C al buio per 20 ore.</li>
	<li>Centrifugare la piastra ben 96 a 4.000 x g a 4 ° C per 10 minuti e posizionarlo sul ghiaccio.</li>
	<li>Aggiungere 250 μL di 0,2 M Na2CO3 in ciascun pozzetto di una piastra ben nero 96.</li>
	<li>Aggiungere 6,25 μL di ogni miscela di analisi GUS centrifugato nella corrispondente bene (contenente 0,2 M Na2CO3) del nero 96 ben piatto. Mescolare con la punta dopo l'aggiunta. Includono i pozzetti con 6,25 μL di 10 μM, 40 μM e 100 μM 4-methylumbelliferone come standard.</li>
	<li>Posizionare la piastra nera in un fluorometro di piastra e leggere la fluorescenza di methylumbelliferone. Prendere le letture ad una lunghezza d'onda di eccitazione di 360 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 460 nm. Impostare il guadagno dello strumento tale che un contenente 6,25 μL di 40 μM 4-methylumbelliferone e 250 μL di 0,2 M Na2CO3 dà una lettura di 1000 unità di fluorescenza.</li>
</ol>8. analisi dei dati
<ol><li>Immettere i valori per la luciferasi e dosaggi di GUS in un foglio di calcolo. Escludere dalla considerazione qualsiasi campione con una lettura di luciferasi inferiore a 20.000 luminescenza relativa unità s-1, come questo indica che i costrutti genici non sono stati recapitati correttamente per le cellule di aleurone.</li>
	<li>Per ogni granello con successo hanno bombardato l'Estratto (che rappresenta un gruppo di quattro grani embryoless), calcolare l'espressione di GUS normalizzato dai dati grezzi di GUS e luciferasi come segue: normalizzato GUS = [(espressione di GUS - GUS vuoto) x (2.000.000)] / (luciferase espressione – luciferasi in bianco). Nota: Questo normalizza la quantità di attività di GUS a quanto sarebbe stato osservato in un bombardamento che ha dato una lettura di luciferasi di 2.000.000.</li>
	<li>Segnalare il livello relativo di espressione di un costrutto particolare reporter in presenza di costrutti effettrici o trattamenti ormonali in fase di test confrontando il livello di espressione in assenza di effettori o ormoni.</li>
</ol>

<ol><li>Chen, K., An, Y. Q. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+responses+to+gibberellin+and+abscisic+acid+in+barley+aleurone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Integ.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional responses to gibberellin and abscisic acid in barley aleurone.</a> J. Integ. Plant Biol. 48, 591-612 (2006).</li>
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<li>Johnson, R. R., Shin, M., Shen, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wheat+PKABA1-interacting+factor+TaABF1+mediates+both+abscisic+acid-suppressed+and+abscisic+acid-induced+gene+expression+in+bombarded+aleurone+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The wheat PKABA1-interacting factor TaABF1 mediates both abscisic acid-suppressed and abscisic acid-induced gene expression in bombarded aleurone cells.</a> Plant Mol. Biol. 68, 93-103 (2008).</li>
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<li>Piskurewicz, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gibberellic+acid+signaling+repressor+RGL2+inhibits+Arabidopsis+seed+germination+by+stimulating+abscisic+acid+synthesis+and+ABI5+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity.</a> Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).</li>
<li>Hong, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation-mediated+regulation+of+a+rice+ABA+responsive+element+binding+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation-mediated regulation of a rice ABA responsive element binding factor.</a> Phytochemistry. 72, 27-36 (2011).</li>
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<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOS2-LIKE+PROTEIN+KINASE5%2C+an+SNF1-RELATED+PROTEIN+KINASE3-Type+protein+kinase%2C+is+important+for+abscisic+acid+responses+in+Arabidopsis+through+phosphorylation+of+ABSCISIC+ACID-INSESENSITIVE5%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">SOS2-LIKE PROTEIN KINASE5, an SNF1-RELATED PROTEIN KINASE3-Type protein kinase, is important for abscisic acid responses in Arabidopsis through phosphorylation of ABSCISIC ACID-INSESENSITIVE5.</a> Plant Physiol. 168, 659-676 (2015).</li>
<li>Zong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+regulation+of+ABA+signaling+and+biosynthesis+by+a+bZIP+transcription+factor+targets+drought-resistance-related+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Feedback regulation of ABA signaling and biosynthesis by a bZIP transcription factor targets drought-resistance-related genes.</a> Plant Physiol. 171, 2810-2825 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

L'introduzione del gene dell'effettore costrutti tramite bombardamento di particelle, seguita dall'espressione transitoria di costruzioni del reporter è una strategia importante per il ruolo degli attori particolari nella segnalazione di GA/ABA e nel gene ormone-regolata risultante di dissezione espressione. Tuttavia, i protocolli esistenti per lo svolgimento di tali esperimenti in orzo aleuronico cellule2,3,4,<sup...

Lo strato aleuronico orzo è un sistema consolidato modello per lo studio dell'espressione di gene ormone-regolato in piante1. In particolare, un numero di geni richiesti per la germinazione o lo sviluppo iniziale del semenzale è attivato da gibberelline (GA), mentre i geni associati con le risposte di sforzo sono attivati da acido abscissico (ABA). La GA e ABA vie di segnalazione sono intrecciate, come l'espressione di alcuni geni attivati dal GA è inibita da ABA e viceversa1.
Una strategia importante per comprendere che il ruolo degli attori particolari nella segnalazione di GA/ABA è stata l'introduzione di costrutti genici effettrici tramite bombardamento di particelle, seguita dall'espressione transitoria di costruzioni del reporter che consentono l'effetto risultante sul espressione genica a valle deve essere determinato. L'uso di geni reporter come GUS (β-glucuronidasi) o Luciferase permette la misura sensibile e quantitativa dell'espressione genica in particolare all'interno delle cellule che hanno ricevuto il costrutto dell'effettore. Ad esempio, l'introduzione di un costrutto di effettori che codifica per il fattore di trascrizione TaABF15,6 stabilito che geni indotti da ABA come HVA1 sono indotte da TaABF1, mentre GA-indotta di geni come Amy32b sono repressi. Bombardamento di particelle come una strategia sperimentale è stato utilizzato da più laboratori di approfondire diversi aspetti della GA/ABA segnalazione. Tale lavoro ha portato all'identificazione di elementi promotore importanti per l'attivazione indotta da GA2 sia geni indotti da ABA3e alla scoperta della proteina chinasi4 e fattori di trascrizione5 che regolano la espressione di questi geni.
Gli esistenti protocolli2,3,4,5,6 per bombardamento di particelle e successiva misura della espressione genica transitoria sono abbastanza laborioso, come ogni set di bombardato a malapena grani è omogeneizzato a mano in un mortaio e pestello e l'analisi dell'enzima sono effettuate individualmente. Questo manoscritto segnala un protocollo migliorato che parzialmente automatizza e semplifica il passaggio di omogeneizzazione e GUS saggi per consentire una velocità effettiva significativamente maggiore, permettendo un maggior numero di trattamenti da sottoporre all'esperimento stesso, e/o la inclusione di ulteriori repliche per ogni trattamento ottenere altri risultati statisticamente robusti. Risultati rappresentativi sono indicati per l'espressione di HVA1 e Amy32b costruzioni del reporter, regolata dal fattore di trascrizione TaABF1 nonché da GA, ABA e altre molecole regolatrici.

<table><tbody><tr><td>Kit Maxiprep per plasmidi GeneElute HP</td><td>Spettrofotometro UV-vis Sigma</td><td>NA0310-1KT</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nanodrop</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Chicchi d'orzo dell'Himalaya</td><td>/</td><td>/</td><td>Una varietà di orzo senza buccia (conservare al buio a 4 gradi; C)</td></tr><tr><td>succinato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S2378</td><td>Reagente per l'imbibzione della soluzione</td></tr><tr><td>cloruro di calcio (diidrato)</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>Reagente per l'imbibzione della soluzione</td></tr><tr><td>dell'imbibzione Soluzione</td><td>fatta in casa</td> <td>/</td> <td>20 mM succinato di sodio, 20 mM di cloruro di calcio, pH 5.0. Sterilizzare in autoclave prima dell'uso.</td></tr><tr><td>cloramfenicolo</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>Preparare una soluzione madre da 10 mg/mL in etanolo al 70%.</td></tr><tr><td>vermiculite</td><td>Fisher</td><td>NC0430369</td><td>Utilizzato per lastre di vermiculite.</td></tr>cerchi <tr><td>di carta da filtro (90 mm)</td><td>Whatman</td><td>1001 090</td><td>Utilizzato per la vermiculite e per la preparazione dei cereali pre-bombardamento</td></tr><tr><td>Piastre di vermiculite</td><td>fatte in casa</td><td>/</td><td>Aggiungere 50 ml di vermiculite a una capsula di Petri di vetro. Posizionare un cerchio di carta di 90 mm sopra la vermiculite. Autoclave.</td></tr><tr><td>pinze (a punta fine)</td><td>Fisher</td><td>13-812-42</td><td>Utilizzato per rimuovere il rivestimento dei semi dai chicchi d'orzo.</td></tr><tr><td>pinza (punta ultra fine)</td><td>Fisher</td><td>12-000-122</td><td>Utilizzato per rimuovere il rivestimento dei semi dai chicchi d'orzo.</td></tr><tr><td>microcarrier d'oro (1,6 &mu; m)</td><td>BioRad</td><td>1652264</td><td></td></tr><tr><td>macrocarrier</td><td>BioRad</td><td>1652335</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di calcio (diidrato)</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>Preparare una soluzione madre da 2,5 M e conservare 1 mL di aliquote a -20&deg; C.</td></tr><tr><td>spermidina</td><td>Sigma</td><td>S0266</td><td>Preparare una soluzione madre da 100 mM e conservarne 500 &mu; Aliquote L a -20 gradi C (utilizzare entro 2 mesi).</td></tr>dischi <tr><td>di rottura (1550 psi)</td>Schermi di arresto <td>1652331 BioRad</td><td>1652336</td><td></td></tr><tr><td>supporti per macrocarrier</td><td>BioRad</td><td></td> 1652322 BioRad Sistema <td></td></tr><tr><td>di rilascio di particelle biolistico</td><td>BioRad</td><td>PDS-1000/He</td><td></td></tr><tr><td>fosfato di sodio monobasico monoidrato</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>Reagente per 1M fosfato di sodio pH 7,2</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fosfato di sodio bibasico</td><td>Sigma</td><td>S9763</td><td>Reagente per 1M fosfato di sodio pH 7,2</td></tr><tr><td>1M fosfato di sodio pH 7,2</td><td>fatto in casa</td><td>/</td><td>Combinare 6,9 g di fosfato di sodio monobasico monoidrato con 7,1 g di fosfato di sodio bibasico. Aggiungere acqua a 100 ml. Aggiungi NaOH per ottenere un pH 7,2.</td></tr><tr><td>ditiotrietolo (DTT)</td><td>Sigma</td><td>43819</td><td>Sciogliere in acqua a 1 M. Conservare a -20 gradi in aliquote da 1 mL.</td></tr><tr><td>leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td>Sciogliere in acqua a 10 mg/mL. Negozio a -20 gradi </td></tr><tr><td>C.glicerolo</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>Preparare una soluzione al 50% in acqua.</td></tr><tr><td>Macinazione Tampone</td><td>fatto in casa</td><td>/</td><td>Combina 10 mL di 1 M di fosfato di sodio pH 7,2, 500 &mu; L di 1 m DTT, 100 &mu; L di 10 mg/mL di leupeptina e 40 mL di glicerolo al 50%. Aggiungere acqua a 100 ml.</td></tr><tr><td>perline in acciaio inossidabile (5 mm)</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>provette da 2,0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td>Questo specifico modello di provetta è consigliato per l'uso con l'omogeneizzatore.</td></tr><tr><td>omogeneizzatore a sfere (TissueLyser)</td><td>Qiagen</td><td>85210</td><td></td></tr><tr><td>Provette in vetro da 12 mm x 75 mm</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>luciferina</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-100</td><td>Preparare una soluzione madre da 25 mM e conservare aliquote da 1 mL a -20 °C.</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td>Preparare una soluzione stock da 100 mM e conservare 250 &mu; Aliquote L a -20 gradi &nbsp;C.</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Reagente per 1M Tris solfato pH 7,7.</td></tr><tr>acido <td>solforico</td><td>Sigma</td><td>258105</td><td>Reagente per 1M Tris solfato pH 7,7.</td></tr><tr><td>1M Tris solfato pH 7,7</td><td>fatto in casa</td><td>/</td><td>Sciogliere 12,1 g di base Tris in 100 ml di acqua. Regolare il pH a 7,7 con acido solforico.</td></tr><tr><td>cloruro di magnesio</td><td>Sigma</td><td>M9397</td><td>Sciogliere in acqua fino a 2 M.</td></tr><tr><td>Tampone per il saggio della luciferasi (LAB)</td> <td>fatto in casa</td><td>/</td><td>Combina 3 ml di 1 M Tris solfato pH 7,7, 500 &mu; L di cloruro di magnesio 2 M, 1 mL di DTT 1 M e 200 &mu; L di 0,5 m EDTA. Aggiungere acqua a 50&nbsp; Ml.</td></tr><tr><td>Miscela di saggi luciferasi</td><td>fatta in casa</td><td>/</td><td>Combina 15 ml di LAB, 800 &mu; L di 25 mM luciferina, 200 &mu; L di 100 mM di ATP e 4 mL di acqua. Questo rende sufficiente la miscela di analisi (20&nbsp; mL) per 100 saggi di luciferasi.</td></tr><tr><td>luminometro (Sirius)</td><td>Berthold</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>4-metilumbelliferil-&beta;-D-glucuronide (MUG)</td><td>Goldbio</td><td>MUG1</td><td>Sciogliere in DMSO a 100 mM.</td></tr><tr><td>sodio azide</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td>Preparare una soluzione madre al 2% in acqua e conservare 1 mL di aliquote a -20°C.</td></tr><tr><td>Piastre da 96 pozzetti (standard)</td><td>Tampone per saggio GUS Fisher</td><td>12565501</td><td></td></tr><tr><td></td><td>fatto in casa</td><td>/</td><td>Combina 2,5 mL di MUG, 5 mL di fosfato di sodio 1 M pH 7,2, 400 &mu; L di 0,5 M EDTA, 1 mL di 1 M DTT, 100 &mu; L di 10 mg/ml di leupeptina, 20 mL di metanolo e 1 mL di azoturo di sodio al 2%. Aggiungere acqua a 100 ml.</td></tr><tr><td>TempPlate film sigillante</td><td>USA Scientific</td><td>2921-1000</td><td></td></tr><tr><td>piastre a 96 pozzetti (nero)</td><td>Costar</td><td>3916</td><td></td></tr><tr><td>carbonato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S7795</td><td>Preparare una soluzione da 200 mM in acqua.</td></tr><tr><td>4-metilumbelliferone</td><td>Sigma</td><td>M1381</td><td>Preparare un 100 &mu; M in acqua. Congelare 1 mL di aliquote a -20 gradi &nbsp;C.</td></tr><tr><td>lettore di fluouresence per micropiastre</td><td>Bio-Tek</td><td>FLX-800</td><td></td></tr></tbody></table>

espressione genica in strati di aleurone orzo bombardati con aumento della velocità di misura

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

Lo strato aleuronico di chicchi d'orzo è un importante sistema modello per l'espressione di gene ormone-regolato nelle piante. In cellule di aleurone, geni richiesti per la germinazione o lo sviluppo iniziale del semenzale attivati da gibberelline (GA), mentre i geni associati con le risposte di sforzo sono attivati da acido abscissico (ABA). I meccanismi di segnalazione GA e ABA possono essere interrogati dall'introduzione di costruzioni di gene del reporter in cellule di aleurone via bombardamento di particelle, con l'espressione transitoria risultante misurata mediante analisi dell'enzima. Un protocollo migliorato è segnalato che parzialmente automatizza e semplifica il passaggio di omogeneizzazione di grano e l'analisi dell'enzima, che consente una velocità effettiva significativamente maggiore rispetto ai metodi esistenti. Omogeneizzazione dei campioni grano viene effettuata utilizzando un omogeneizzatore automatizzato del tessuto, e GUS (β-glucuronidasi) le analisi sono effettuate utilizzando un sistema di piastra a 96 pozzetti. Risultati rappresentativi utilizzando il protocollo suggeriscono che l'attività della fosfolipasi D può svolgere un ruolo importante nell'attivazione dell'espressione genica di HVA1 di ABA, attraverso il fattore di trascrizione TaABF1.

La tecnica qui descritta può essere utilizzata per introdurre qualsiasi costruzione di prova gene nelle cellule di aleurone di chicchi d'orzo. Il livello di espressione dal gene test quindi può essere convenientemente misurato (Figura 2). Il protocollo di throughput superiore descritto qui notevolmente aumenta l'efficienza del seme macinazione e la procedura di analisi enzima. Questo metodo è stato utilizzato per valutare la capacità del fattore di trascrizio...

Un protocollo migliore è presentato per la misura dell'espressione genica transitoria da costruzioni del reporter in cellule di aleurone di orzo dopo il bombardamento di particelle. La combinazione di grano automatizzato rettifica con analisi dell'enzima piastra a 96 pozzetti fornisce throughput elevato per la procedura.

Espressione genica in strati di Aleurone orzo bombardati con aumento della velocità di misura

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare l'espressione genica dai costrutti reporter dopo averli introdotti nelle cellule di aleurone d'orzo mediante bombardamento di particelle. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nell'espressione genica regolata dagli ormoni vegetali, come ad esempio il modo in cui specifiche molecole di segnalazione agiscono per regolare l'acido abscissico nei geni indotti dall'orzo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce una maggiore produttività rispetto ai metodi precedenti, consentendo di testare un gran numero di costrutti genici e condizioni di incubazione.A dimostrare il protocollo sarà Grace, una studentessa del mio laboratorio. Per prima cosa, metti alcuni grani senza embrioni nel coperchio di una capsula di Petri di plastica da 90 millimetri contenente 20 millilitri di soluzione per l'assorbimento e 20 microlitri di cloramfenicolo. Usando una pinza sterile, rimuovi delicatamente il rivestimento trasparente del seme da ogni chicco.Sbucciare i rivestimenti dei semi dal chicco d'orzo è un passaggio fondamentale. Se i rivestimenti dei semi non vengono completamente rimossi, ai microvettori d'oro verrà impedi

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Analisi di espressione genica globale Utilizzando un Zebrafish piattaforma Microarray oligonucleotidi

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Traffico macromolecolari tra le cellule delle piante può essere valutata transitoriamente esprimere una proteina fluorescente-tagged di interesse e per analizzarne la distribuzione intra-ed intercellulare mediante microscopia confocale.

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Presentato qui è un protocollo per la microdissezione laser-cattura (LCM) di tessuti vegetali. LCM è una tecnica microscopica per isolare aree di tessuto in modo privo di contaminazione. La procedura include fissazione del tessuto, incorporamento di paraffina, sessazione, LCM e estrazione dell'RNA. L'RNA viene utilizzato nell'analisi dei trascrimi specifici del tessuto a valle e tempormente risolta.

Microsezione laser-cattura RNA-Sequenziamento per l'analisi dell'espressione genica spaziale e temporale specifica del tessuto nelle piante

Scopri come misurare l'espressione genica negli strati di aleurone dell'orzo mediante bombardamento con particelle. Questo protocollo ad alto rendimento combina macinazione automatica e saggi enzimatici in piastra 96 pozzetti per studiare i geni regolati dall'acido abscissico.

Espressione genica in strati di Aleurone orzo bombardati con aumento della velocità di misura

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