Espressione genica in strati di Aleurone orzo bombardati con aumento della velocità di misura

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare l'espressione genica dai costrutti reporter dopo averli introdotti nelle cellule di aleurone d'orzo mediante bombardamento di particelle. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nell'espressione genica regolata dagli ormoni vegetali, come ad esempio il modo in cui specifiche molecole di segnalazione agiscono per regolare l'acido abscissico nei geni indotti dall'orzo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce una maggiore produttività rispetto ai metodi precedenti, consentendo di testare un gran numero di costrutti genici e condizioni di incubazione.

A dimostrare il protocollo sarà Grace, una studentessa del mio laboratorio. Per prima cosa, metti alcuni grani senza embrioni nel coperchio di una capsula di Petri di plastica da 90 millimetri contenente 20 millilitri di soluzione per l'assorbimento e 20 microlitri di cloramfenicolo. Usando una pinza sterile, rimuovi delicatamente il rivestimento trasparente del seme da ogni chicco.

Sbucciare i rivestimenti dei semi dal chicco d'orzo è un passaggio fondamentale. Se i rivestimenti dei semi non vengono completamente rimossi, ai microvettori d'oro verrà impedito di entrare nelle cellule dell'aleurone. Ma se il peeling viene fatto troppo grossolanamente, le cellule dell'aleurone possono essere danneggiate.

Dopo aver staccato il rivestimento di semi da tutti i chicchi, trasferiscili dalla capsula di Petri a una piastra di vermiculite. Quindi, metti i chicchi sbucciati senza embrioni in un'incubatrice a 24 gradi Celsius per 16-20 ore. Ora, etichettare un tubo da un virgola cinque millilitri da ogni trattamento che sarà incluso nell'esperimento di bombardamento.

A ciascuna provetta, aggiungere due virgola cinque microgrammi di plasmide di controllo interno della luciferasi UBI, due virgola cinque microgrammi di un plasmide reporter GUS e la quantità desiderata di un plasmide effettore. Aggiungere acqua ultrapura a ciascun tubo per portare il volume totale a cinque microlitri. Per ogni trattamento, aggiungere 50 microlitri di microcarrier sospesi in glicerolo al 50% in ciascuna provetta da cinque millilitri contenente DNA plasmidico.

Nella fase finale della procedura di codifica dei microvettori, pipettare otto microlitri di microvettori sospesi su ciascuno dei cinque macrovettori e lasciarli asciugare all'aria. Impostare l'apparato di bombardamento di particelle accendendo la pompa del vuoto, aprendo la valvola dell'elio e quindi accendendo il sistema di erogazione delle particelle. Posizionare un disco di rottura da 1550 psi nel tappo di fissaggio e montarlo sul sistema di erogazione delle particelle.

Posizionare un macrocarrier contenente la combinazione di plasmidi desiderata con uno schermo di arresto nel gruppo di lancio del microcarrier. Inserire il gruppo nella fessura superiore della camera di bombardamento. Quindi, disporre otto grani senza embrioni in uno schema radiale stretto con le estremità più sottili rivolte verso l'interno su un cerchio di carta da filtro che viene fissato con nastro adesivo al coperchio di una capsula di Petri da 90 millilitri.

Posizionare il piatto con i chicchi nella camera di bombardamento a una distanza di sei centimetri dallo schermo di arresto. Chiudere la porta e premere l'interruttore a vuoto per evacuare la camera di bombardamento a 95 kilopascal. Ruotare rapidamente l'interruttore del vuoto in posizione di blocco.

Quindi tieni premuto l'interruttore di fuoco per bombardare il campione. Dopo aver rilasciato il vuoto, trasferire i chicchi bombardati in una capsula di Petri da 60 millimetri etichettata contenente quattro millilitri di soluzione per assorbire con un milligrammo per millilitro di cloramfenicolo. Ripeti fino a quando tutti i bombardamenti sono stati completati.

Quindi, incubare i chicchi bombardati su una piattaforma di agitazione a 100 giri/min a 24 gradi Celsius per 24 ore. Usando una pinza, rimuovi gli otto grani bombardati dalla capsula di Petri da 60 millimetri e asciugali su un tovagliolo di carta. Dividi i chicchi in due provette da due millilitri etichettate, ciascuna contenente 800 microlitri di tampone di macinazione e una perlina di acciaio inossidabile da cinque millimetri.

Dopo aver ripetuto il passaggio precedente per tutti i cereali bombardati, posizionare fino a 48 provette da due millilitri in due rack di un omogeneizzatore a sfere. Quindi montare i rack sull'omogeneizzatore e agitare i campioni a 30 hertz per tre minuti. Al termine, rimuovere i rack dall'omogeneizzatore e metterli sul ghiaccio per cinque minuti per raffreddare nuovamente i campioni.

A questo punto, montare i rack sull'omogeneizzatore nella direzione opposta. Agitare nuovamente i campioni a 30 hertz per tre minuti. Dopo aver rimosso i rack dall'omogeneizzatore, metterli sul ghiaccio per cinque minuti per raffreddare nuovamente i campioni.

Successivamente, centrifugare gli estratti di cereali a 16.000 g a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Subito dopo la centrifugazione, decantare i surnatanti chiari in un secondo set di provette per microcentrifuga. Agitare brevemente ogni tubo e conservarlo sul ghiaccio.

Dopo aver trasferito il surnatante, recuperare le perle di acciaio inossidabile dai pellet in modo che possano essere lavate e riutilizzate. Aggiungere ora 200 microlitri di tampone per il saggio GUS a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Mettere 50 microlitri di ogni estratto di grano in uno dei pozzetti e mescolare con la punta della pipetta.

Quindi, sigillare la parte superiore della piastra con pellicola sigillante. Posizionare la piastra a 96 pozzetti in un incubatore al buio a 37 gradi Celsius per 20 ore. Dopo l'incubazione, centrifugare la piastra a 96 pozzetti a 4.000 G a quattro gradi Celsius per 10 minuti.

Al termine, posizionare il piatto sul ghiaccio. Ora, aggiungi 250 microlitri di punto zero due molari di carbonato di sodio a ciascun pozzetto di una piastra nera a 96 pozzetti. Aggiungere sei virgola due cinque microlitri di ciascuna miscela di saggi GUS centrifugata in ciascun pozzetto della piastra nera e mescolare con la punta della pipetta.

Includere pozzetti con sei virgola due cinque microlitri di 10-40 a 100 micromolari, quattro metilumbelliferone come standard. Posizionare la piastra nera in un fluorimetro a piastra. Leggere la fluorescenza del metilumbelliferone impostando il guadagno dello strumento, in modo tale che un pozzetto contenente sei virgola due cinque microlitri di 40 micromolari, quattro metilumbelliferone e 250 microlitri di punto zero due molari carbonato di sodio danno una lettura di 100 unità di fluorescenza.

In questo esperimento, un costrutto reporter HVA1 GUS è stato introdotto nelle cellule di aleurone insieme a un costrutto effettore UBI TaABF1. Mentre un rapporto TaABF1 HVA1 di appena zero virgola zero, uno era sufficiente a causare una triplice induzione del gene reporter HVA1 in assenza di acido esogenico absyssico o ABA. Livelli più elevati del costrutto TaABF1 hanno portato a una progressiva maggiore espressione di HVA1 in modo dose-dipendente.

Sia l'esogenio ABA che il TaABF1 potrebbero indurre fortemente l'espressione del costrutto reporter HVA1 GUS. In entrambi i casi, la presenza di un butanolo ha fortemente inibito l'induzione di HVA1, il che suggerisce che la fosfolipasi D potrebbe svolgere un ruolo importante nell'attivazione dell'espressione genica di HVA1 da parte di ABA attraverso TaABF1. È stato dimostrato che l'ABA inibisce fortemente l'espressione indotta dalla gibberellina per il costrutto reporter GUS Amy32b.

Mentre né il perossido di idrogeno né il nitroprussiato di sodio hanno causato una riduzione significativa. Questi risultati, quindi, non supportano un ruolo dell'ossido nitrico e del perossido di idrogeno nelle risposte ABA delle cellule aleuroniche. Una volta padroneggiata, questa tecnica può consentire di misurare molti campioni diversi per l'espressione genica in un tempo relativamente breve.

Ad esempio, il bombardamento di 200 diversi campioni di grano può essere effettuato da due investigatori in un paio d'ore. Quindi, il giorno successivo, un singolo ricercatore può preparare tutti gli estratti proteici in due ore. Il test GUS modificato eseguito in piastre a 96 pozzetti richiede anche molta meno manodopera rispetto ad altri protocolli che utilizzano nei futuri saggi in provetta.