Osservazione e analisi del lampeggiante superficie-enhanced Raman Scattering
11 gennaio 2018
Questo protocollo descrive l'analisi del lampeggiante superficie-enhanced Raman scattering dovuto il cammino casuale di una singola molecola su una superficie d'argento utilizzando leggi di potenza.
L'obiettivo generale di questa analisi del Blinking Surface-enhanced Raman Scattering è quello di studiare il comportamento di singole molecole su superfici di nanoparticelle metalliche. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nell'interfaccia e nella scienza dei coralli sul comportamento di lavoro delle interfacce solido-liquido Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile raccogliere molti dati perché è possibile osservare contemporaneamente circa una dozzina di punti lampeggianti in un video. Per iniziare questa procedura, lavare due vetrini da microscopio con detersivo liquido e acqua di rubinetto.
Sciacquare i vetrini con acqua distillata e lasciarli asciugare all'aria. Successivamente, applicare una soluzione acquosa di poli-l lisina allo 0,1% su un vetrino asciutto. Lasciare riposare la soluzione sul vetrino per due o tre secondi.
Quindi, utilizzare un soffiatore d'aria compressa per rimuovere la soluzione in eccesso e asciugare il vetrino. Quindi, applicare una sospensione di nanoparticelle di argento colloidale sul vetrino. Lasciare riposare la sospensione per due o tre secondi.
Asciugare il vetrino con aria compressa. Quindi, utilizzare una penna barriera idrofobica per racchiudere completamente un'area di 26 millimetri per 26 millimetri sul vetrino. Lasciare asciugare la barriera.
Far cadere l'acqua distillata sullo scivolo per riempire l'area chiusa. Coprire il vetrino con il secondo vetrino pulito e asciutto per evitare l'evaporazione dell'acqua. Posizionare il gruppo vetrino sul tavolino portacampioni del microscopio invertito.
Illuminare il vetrino con luce bianca attraverso un condensatore a campo scuro. Metti a fuoco punti di vari colori passando da un obiettivo 2x a un obiettivo 60x. Successivamente, utilizzare un laser a onda continua a stato solido a 532 nanometri pompato a diodi, un filtro di interferenza passa-banda e una lente per illuminare il campione con un raggio attenuato a un angolo di 30 gradi rispetto alla superficie del campione.
Spostare l'illuminazione laser al centro della vista e regolare leggermente la direzione z del tavolino di campionamento per affinare la messa a fuoco sui punti. Osservare gli aggregati come macchie monotone su uno sfondo uniforme. Quindi, spegnere il laser e inserire un filtro lungo sul bordo passante dopo la lente dell'obiettivo.
Illuminare il campione con il laser a un angolo di 30 gradi rispetto alla superficie del campione, attraverso il filtro di interferenza e la lente esterna. Sposta il tavolino nelle direzioni x e y per trovare i punti lampeggianti. Quindi, utilizzare una fotocamera CCD digitale con un tempo di fotogramma compreso tra 61 e 120 millisecondi per acquisire un video di 20 minuti degli spot.
Per iniziare l'analisi, aprire il video acquisito nel software della telecamera CCD. Fare clic e trascinare per selezionare le aree con e senza punti lampeggianti. Eseguire un'analisi temporale per ricavare un profilo temporale dell'intensità del segnale per le macchie e le aree scure.
Acquisisci profili per tutti i punti lampeggianti e le aree scure di interesse in questo modo. Quindi, generare distribuzioni di probabilità per eventi luminosi e scuri in relazione alla loro durata. Macchie lampeggianti multicolori sono state osservate da SERS di nano aggregati d'argento, preparati con vetrini rivestiti di poli-l lisina.
Il segnale lampeggiante è attribuito al cammino casuale di singole molecole alle giunzioni dei nano aggregati d'argento. I segnali provenienti dal singolo nanoaggregato hanno mostrato intensità variabili nel tempo, a differenza della fluorescenza lampeggiante di un punto quantico. La soglia per gli eventi luminosi è stata impostata su tre deviazioni standard al di sopra dell'intensità della linea di base e le durate degli eventi luminosi e scuri sono state determinate per ogni punto.
La distribuzione di probabilità degli eventi luminosi è stata tracciata rispetto alla durata dell'evento come una linea e un grafico logaritmico, mentre la distribuzione di probabilità degli eventi oscuri è stata tracciata rispetto alla durata come una curva. Poiché le durate degli eventi oscuri erano generalmente più lunghe delle durate pari luminose, gli esponenti della legge di potenza per gli eventi luminosi tendevano ad essere più piccoli di quelli per gli eventi oscuri. Tempi di troncamento più brevi per gli eventi oscuri indicavano una passeggiata casuale molecolare più veloce, una barriera di energia più elevata da uno stato non emissivo a uno stato emissivo, o una combinazione di entrambi.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come osservare e analizzare i fenomeni SERS lampeggianti.
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Panoramica
Questo protocollo descrive l'analisi della diffusione Raman amplificata da superficie intermittente dovuta al moto casuale di una singola molecola su una superficie d'argento. Questo metodo consente l'osservazione simultanea di più punti intermittenti, fornendo dati preziosi sul comportamento molecolare alle interfacce solido-liquido.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Diffusione Raman amplificata da superficie
- Analisi di singola molecola
- Interazioni tra nanoparticelle metalliche
Sfondo
- Studia il comportamento di singole molecole su superfici metalliche.
- Affronta questioni fondamentali nell'ambito delle scienze delle interfacce e dei coralli.
- Utilizza punti lampeggianti per la raccolta di dati.
- Si concentra sulla dinamica delle interfacce solido-liquido.
Scopo dello studio
- Per analizzare la diffusione Raman migliorata da superficie intermittente.
- Per comprendere il moto casuale di singole molecole.
- Per raccogliere dati approfonditi sulle interazioni molecolari.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di vetrini in vetro per microscopio.
- Applicazione della soluzione di poli-l-lisina.
- Osservazione di punti lampeggianti mediante video.
- Analisi dei dati utilizzando leggi di potenza.
Risultati principali
- Osservazione riuscita di numerosi punti luminosi intermittenti.
- Informazioni sul movimento casuale delle molecole.
- I dati supportano la comprensione del comportamento molecolare.
- Dimostra l'efficacia della tecnica.
Conclusioni
- La tecnica fornisce informazioni preziose sulla dinamica molecolare.
- Può essere applicata a diverse indagini scientifiche.
- Migliora la comprensione delle interfacce solido-liquido.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'analisi quantitativa del fenomeno di intermittente diffusione Raman amplificata da superficie (SERS) a risoluzione di singola molecola consente una riduzione del rischio meccanicistica nella fase iniziale di scoperta, rivelando la dinamica molecolare alle interfacce metalliche. La modellizzazione statistica secondo una legge di potenza delle durate degli eventi luminosi e oscuri fornisce un grado predittivo di affidabilità per l'interpretazione del comportamento molecolare in ambienti complessi di nanoaggregati. Queste informazioni supportano una validazione solida del bersaglio e guidano lo sviluppo di saggi per applicazioni biofarmaceutiche sensibili alla superficie.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi delle interazioni molecolari a livello di interfacce solido-liquido rilevanti per il legame farmaco-target.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistico quantificando la dinamica del moto casuale di singole molecole su superfici di nanoparticelle.
- Fornisce parametri statistici per la validazione funzionale del target in processi mediati da superfici.
Sviluppo di screening e saggi
- Facilita la preparazione di substrati attivi per la SERS riproducibili per saggi quantitativi successivi.
- Fornisce un'acquisizione standardizzata e ad alto rendimento dei dati relativi agli eventi di lampeggiamento per garantire la riproducibilità del saggio.
- Permette un'analisi robusta del thresholding e della durata degli eventi per supportare uno screening affidabile dei composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Offre framework quantitativi per collegare il comportamento della superficie molecolare a potenziali biomarcatori traslazionali.
- Supporta la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica fornendo informazioni meccanicistiche sulle interazioni di superficie.
- Migliora il valore predittivo per l' avanzamento in base al rischio di modalità mirate alla superficie.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo di analisi del lampeggiamento SERS si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica fornendo letture quantitative e riproducibili della dinamica molecolare alle interfacce di nanoaggregati.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi per eventi molecolari mediati da superfici.
- Screening: Fornisce distribuzioni quantitative e riproducibili della durata degli eventi per la standardizzazione dei saggi.
- Analisi: Fornisce output statistici—come esponenti della legge di potenza e tempi di troncamento—per il confronto tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Correla il comportamento molecolare sulla superficie allo sviluppo potenziale di biomarcatori, quando supportato da ulteriori analisi spettrali.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un framework analitico riutilizzabile per studi diversificati su nanoparticelle e interfacce.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi sulle interazioni superficiali.
- Valore operativo: Standardizza l'acquisizione e l'analisi dei dati per flussi di lavoro scalabili e riproducibili.
- Valore strategico: Guida le decisioni di prosecuzione o interruzione quantificando il comportamento molecolare alle interfacce critiche.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata ai rischi nei programmi di scoperta mirati alle superfici.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in SERS, analisi statistica e imaging a livello di singola molecola.
- Necessita di accesso a microscopia avanzata, illuminazione laser e infrastruttura con camera CCD.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per il fissaggio delle soglie degli eventi e per i protocolli di analisi dati.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diversi sistemi di nanoparticelle o chimiche d'interfaccia.
- L'interpretazione dell'origine dei fenomeni di intermittente luminosità potrebbe richiedere un'analisi spettrale complementare per una chiarezza meccanicistica completa.
