Name: Osservazione e analisi del lampeggiante superficie-enhanced Raman Scattering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Scopri l'analisi del lampeggiante surface-enhanced Raman scattering per studiare il comportamento di singole molecole su superfici metalliche. Questo metodo permette di osservare simultaneamente molteplici spot lampeggianti, raccogliendo dati estesi sulle dinamiche molecolari alle interfacce solido-liquido.

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L'autore ringrazia il Prof Y. Ozaki (Kwansei Gakuin University) e Dr. T. Itoh (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) per la loro proficua discussione su quest'opera. Questo lavoro è stato supportato da KAKENHI (sovvenzione per Scientific Research C) dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia (n. 16K 05671).

1. preparazione del campione
<ol><li>
Preparazione di nanoparticelle di argento colloidale 20<ol>
<li>Per fabbricare le nanoparticelle d'argento colloidale, sciogliere 0,030 g di nitrato d'argento e 0,030 g di citrato trisodico biidrato in 150 mL di acqua in un pallone a fondo tondo 200 mL.</li>
		<li>Combinare la beuta con un refrigerante a ricadere (Dimroth).</li>
		<li>Agitare la soluzione in un matraccio con una barra magnetica di agitatore e mescolare. Quindi, riscaldare la soluzione mescolando nel matraccio in bagno d'olio a 150 ° C per 60 min. Nota: La soluzione diventerà grigio giallo, poi latteo.</li>
		<li>Raffreddare la sospensione a temperatura ambiente e a mantenere la sospensione nel pallone coperto con foglio di alluminio in frigorifero. Nota: Il protocollo può essere sospesa a questo punto. Utilizzare le nanoparticelle colloidali, dopo la conservazione in frigorifero, entro un mese.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione del campione per multi-colorato lampeggiante emissione 11<ol>
<li>Per preparare un vetrino da microscopio, lavare a mano, una lastra di vetro con sapone e risciacquare con acqua.</li>
		<li>Aggiungere 0,1% soluzione acquosa di poli-L-lisina per la lastra di vetro e rimuovere la soluzione con un ventilatore.</li>
		<li>Aggiungere la sospensione colloidale d'argento per la lastra di vetro e rimuovere la sospensione con un ventilatore.</li>
		<li>Racchiudere un'area di rilascio sulla lastra di vetro con una penna di liquido bloccante.</li>
		<li>Acqua distillata goccia sulla lastra di vetro e coprire con un'altra lastra di vetro per creare un vetrino da microscopio e impedire l'evaporazione di acqua.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione del campione per monotono SERS lampeggiante colorato 7 , 8 , 9 , 10<ol>
<li>Per preparare un vetrino da microscopio, lavare a mano, una lastra di vetro con sapone e risciacquare con acqua.</li>
		<li>Mescolare la sospensione colloidale d'argento con la tintura di thiacyanine o thiacarbocyanine (25 o 4 µM, rispettivamente) e una soluzione acquosa di NaCl (10 mM) a un rapporto volumetrico di 2:1:1.</li>
		<li>Eliminare la sospensione del campione sulla piastra di vetro e rimuovere la sospensione con un ventilatore.</li>
		<li>Racchiudere un'area di rilascio sulla lastra di vetro con una penna di liquido bloccante.</li>
		<li>Goccia di una soluzione acquosa di NaCl (1 M) sul piatto di vetro per immobilizzare le nanoparticelle d'argento e coprire con un'altra lastra di vetro per creare una piastra di scorrimento microscopio e impedire che la soluzione di evaporazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. osservazione del lampeggiante nanoparticelle d'argento
<ol><li>
Illuminazione del campione
	<ol>
<li>Posizionare la piastra di vetro di campione preparata con protocollo 1.2 o 1.3 sulla scena di un microscopio invertito.</li>
		<li>Illuminare la lastra di vetro del campione usando la luce bianca attraversa un condensatore per campo oscuro e la messa a fuoco su vari punti colorati (blu, verde, gialli e rossi) sulla lastra di vetro utilizzando una lente obiettiva (60 X).</li>
		<li>Illuminare la lastra di vetro di campione utilizzando un fascio di luce attenuata, consegnato ad un angolo di 30° rispetto alla superficie del campione, da un laser a diodi a stato solido pompato (DPSS) continuo-fluttui (cw) attraverso un filtro antidisturbo.</li>
		<li>Per utilizzare laser illuminazione per osservare l'argento nanoaggregati come macchie di colore monotoni in zona dello stesso colore, spostare l'area di illuminazione laser al centro della vista e concentrarsi sui punti sulla lastra di vetro regolando la fase nella direzione z.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Osservazione del lampeggiante
	<ol>
<li>Inserire un filtro passa-lungo dopo la lente dell'obiettivo e illuminare la lastra di vetro di campione utilizzando un fascio di cw-laser DPSS consegnato ad un angolo di 30° rispetto la superficie del campione attraverso un filtro antidisturbo.</li>
		<li>Trovare il lampeggio macchie come mostrato in Figura 1 (Vedi anche Figura S1 nel materiale supplementare) spostando il palco nelle direzioni x e y.</li>
		<li>Registrare video dei luoghi lampeggianti con il microscopio invertito, accoppiato ad una fotocamera raffreddato digitale charge coupled device (CCD), che ha una risoluzione temporale di 61-120 ms, per 20 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. analisi del lampeggiante SERS
<ol><li>
Derivazione del profilo di tempo dal video
	<ol>
<li>Nel software che controlla la telecamera CCD, aprire il file video.</li>
		<li>Per selezionare i punti lampeggianti e zona scura, trascinare aree che coprono separatamente aree con e senza macchie nell'immagine video.</li>
		<li>Per derivare i profili orario di intensità di segnale dal lampeggiante macchie e aree scure nel video, selezionare Analisi temporale nell'analisie fare clic su Calcola nella finestra Analisi temporale .</li>
		<li>Salvare i dati come file di testo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analisi del profilo tempo
	<ol>
<li>Appiattire una previsione del profilo orario sottraendo il profilo orario dall'area scura e/o raccordo con una funzione polinomiale, come mostrato nelle figure 2A e 2B.</li>
		<li>Valutare un'intensità media della linea di base che consiste di circa 2000 punti, iobasee una deviazione standard di intensità della linea di base, σ, come mostrato nelle figure 2 e 2D.</li>
		<li>Distinguere eventi luminosi da eventi oscuri con maggiore intensità di una soglia di hobase + 3 σ e registrare la durata di ogni evento. Nella Figura 3, ad esempio, registrare l'evento da 0 a 3.5476 s come l'evento scuro (con una durata di t = 3.5476 s) e registrare l'evento da 3.5476 a 4.0981 s come l'evento luminoso (con una durata di t = 0.5505 s). Ripetere la procedura come indicato nella tabella 1.</li>
		<li>Contare il numero di eventi di chiari e scuri per ogni durata, come espresso nelle linee prime e seconda della tabella 2.</li>
		<li>Sommare il numero di eventi per ogni durata, fatta eccezione per eventi più brevi di durata t. Come espresso nella seconda e terza riga della tabella 2, ad esempio, sommare il numero di eventi per ogni durata (fatta eccezione per gli eventi per t = 0.0612 s) come 41 + 18 + 9 +...; il risultato è uguale la somma per t = 0.1223 s, cioè 103.</li>
		<li>Dividere le sommatorie per ogni durata e normalizzarli. Come espresso nella tabella 2, per esempio, dividere la somma per durata t = 0.0612 s dalla durata 0.0612 s. Il risultato è 3,351.5791. Poi, dividere il risultato per il totale dei risultati nella quarta riga nella tabella 2. La distribuzione di probabilità è derivata per essere 0.64494.</li>
		<li>Tracciare le distribuzioni di probabilità per il brillante eventi Psu(t) contro la loro durata t in un grafico del logaritmo logaritmo e montare Log10Psu(t) di Log10 (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56729/56729eq1.jpg">) per dedurre il power legge esponente αsu per uno specifico lampeggio spot. Se Psu(t) viene montata dal <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56729/56729eq1.jpg"> , la linea componibile devia dai terreni a piccoli valori di Psu(t), come indicato dalla linea tratteggiata in Figura 4A.</li>
		<li>Tracciare le distribuzioni di probabilità per eventi oscuri Poff(t) contro la loro durata t in un grafico del logaritmo logaritmo e Log10Poff(t) in forma di Log10( <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56729/56729eq3.jpg"> dedurre power legge esponente αfuori e il troncamento tempo τ dal lampeggio stesso spot. Se Poff(t) viene montata dal <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56729/56729eq3.jpg"> , la curva si discosta dai terreni a piccoli valori di Poff(t).</li>
		<li>Ripetere 3.2.1 a 3.2.8 per gli altri punti lampeggianti nel video.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Pieczonka, N. P. W., Aroca, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+analysis+by+surfaced-enhanced+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Single molecule analysis by surfaced-enhanced Raman scattering.</a> Chem. Soc. Rev. 37, 946-954 (2008).</li>
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</ol>

L'autore non ha nulla di divulgare.

Dallo svincolo di nanoaggregati argento, SERS è emessa. Quindi, abbiamo bisogno di preparare nanoaggregati piuttosto che nanoparticelle colloidali, che sono coperti con gli anioni citrato. Aggregati d'argento sono formati dall'effetto creato tramite l'aggiunta di poli-L-lisina, che ha -NH3+ ed è l'origine della SERS, la salatura o cationi Na+ da NaCl, come mostrato in Figura S2 del materiale supplementare. Inoltre, per illuminare i molti punti nella vasta area, il raggio ...

Superficie-enhanced Raman scattering (SERS) è altamente sensibile spettroscopia Raman da una superficie di metallo nobile. Poiché lo spettro Raman fornisce informazioni dettagliate sulla struttura molecolare sulla base delle posizioni di picco acuto, attraverso i modi vibrazionali di gruppi funzionali nelle molecole, è possibile analizzare le informazioni di una singola molecola su una superficie metallica usando SERS1,2,3. Da un argento nanoaggregati con un adsorbato a livello di singola molecola, un segnale lampeggio è osservato1,2,3,4,5,6, 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16e lo spettro fluttua1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10,11,12,13,14. Lampeggiante può essere indotta da una singola molecola che casualmente si muove dentro e fuori un maggiore campo elettromagnetico (EM) in un incrocio di nanoaggregati d'argento di dimensioni nanometriche. Di conseguenza, lampeggiante è considerato prova semplice per il rilevamento di singola molecola, confrontato con una tecnica che utilizza una distribuzione di Poisson di intensità di SERS e un bi-analita2,3,17. Tuttavia, i meccanismi dettagliati dello spettro lampeggio e fluttuante, che può dipendere fortemente il comportamento molecolare sulla superficie Ag, sono ancora controversi.
Negli studi precedenti, lampeggiante SERS è stato analizzato utilizzando la funzione di autocorrelazione, che può calcolare il coefficiente di diffusione e la concentrazione delle molecole in movimento dentro e fuori un'avanzata EM campo12,13,14 . Inoltre, un punteggio di deviazione standard normalizzata, che rappresenta instabilità dell'intensità totale, è stato derivato dal profilo tempo del segnale15. Tuttavia, questi approcci analitici possono basarsi sul comportamento di alcune molecole. Al contrario, in un imaging di Super-risoluzione del lampeggiante SERS, comportamento di singola molecola in un maggiore campo di EM può essere identificato16. Tuttavia, queste tecniche possono ottenere tali parametri solo in un maggiore campo di EM. Il comportamento casuale di una singola molecola all'interno di una vasta gamma (per esempio, nel lampeggiante SERS) può essere rappresentato come una legge di potenza piuttosto che una media4,5,6,7,8 ,9,10,11, simili a fluorescenza lampeggia da un singolo semiconductor quantum dot (QD)18,19. Utilizzando un potere legge analisi4,5,6,7,8,9,10,11, comportamento molecolare può essere stimato in stato brillante (nel campo EM avanzato) sia stato scuro10; ovvero, il comportamento della molecola su tutta la superficie d'argento può essere stimato.
Per questa tecnica, argento colloidale nanoaggregati sono usato4,5,6,7,8,9,10,11. Questi nanoaggregati mostrano varie bande di risonanza (LSPR) plasmonica di superficie localizzata che influiscono fortemente rafforzate campi elettromagnetici quando sono eccitati a determinate lunghezze d'onda. Così, argento SERS-attivo nanoparticelle presenti in sospensione colloidale e alcuni dati immediatamente possa essere ottenuto. Nel caso di semplice nanostrutture, che hanno accordi, forme e dimensioni specifiche, la dipendenza di LSPR della SERS lampeggiante può celare altre dependences7; vale a dire, se la nanostruttura buona o cattiva a LSPR viene utilizzata, i parametri sarà costanti, e le altre dipendenze pertanto saranno nascosto. Analisi della legge di potenza sono stato utilizzato per scoprire varie dipendenze della SERS lampeggiante da argento colloidale nanoaggregati4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11.

<table><tbody><tr><td>Nitrato d'argento, 99,8%</td><td>Wako</td><td>194-00832</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trisodico diidrato, 99. %</td><td>Wako</td><td>191-01785</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione acquosa di poli-L-lisina, 0,1%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>3,3'-disolfopropiltiacianina trietilammina</td><td>Hayashibara Biochemical Laboratories</td><td>NK-2703</td><td>un tipo di coloranti</td></tr> <tr><td>tiacianina3,3'-dietil-5,5'-dicloro-9-metiltiacarbocianina sale di iodio</td><td>Hayashibara Biochemical Laboratories</td><td>SMP-9</td><td>un tipo di coloranti tiacarobocianina</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio, 99,5%</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>Condensatore Dimroth</td><td>Iwaki</td><td>61-9722-22</td><td>perchased from AS ONE</td></tr><tr><td>Agitatore magnetico</td><td>Corning</td><td>DC-420D</td><td></td></tr><tr><td>Bagno</td> <td>d'olioAdvantech</td><td>OS-220</td><td></td></tr><tr><td>Lastra di vetro</td><td>Matsunami</td><td>S-1112</td><td>Soffiatore per vetrini per microscopio</td></tr><tr><td></td><td>Hozan</td><td>Z-288</td><td>Spolverino d'aria</td></tr><tr><td>Penna bloccante per liquidi</td><td>Daido Sangyo</td><td></td><td>LIQUID BLOCKER (Super Pap Pen). Penna barriera idrofobica pronta all'uso progettata per applicazioni di immunoistochimica</td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Olympus</td><td>IX-70</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo</td><td>Olympus</td><td>LCPlanFl 60&times;</td><td>NA 0,7</td></tr><tr><td>Condensatore a campo scuro</td><td>Olympus</td><td>U-DCD</td><td>NA 0.8&ndash; 0.92</td></tr><tr><td>Telecamera CCD digitale raffreddata</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA-AG</td><td>controllata dal software Aqua Cosmos</td></tr><tr><td>Software per la telecamera CCD digitale raffreddata</td><td>Hamamatsu</td><td>AquaCosmos</td><td>utilizzata anche per la derivazione dei profili temporali dai punti lampeggianti nel video&nbsp;</td></tr><tr><td>Telecamera CCD a colori</td><td>ELMO</td><td>TNC-C920</td><td>non utilizzata per l'analisi</td></tr><tr><td>DPSS laser</td><td>RGB sistema laser</td><td>NovaPro532-75</td><td>&lambda; = 532 nm; 60 mW (corrisponde a una densità di potenza di 600 W/cm2)</td></tr><tr><td>Filtro interferenze</td>: <td>Semrock</td><td>LL01-532-12.5</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-lungo</td>: <td>Semrock</td><td>BLP01-532R-25</td><td></td></tr><tr><td>Software per la distinzione e il conteggio degli eventi luminosi/scuri</td>, <td>cameriera</td><td></td><td>programmata da C++</td></tr><tr><td>Software per il montaggio tramite una legge di potenza</td><td>: LightStone</td><td>Origin6.1</td><td></td></tr></tbody></table>

osservazione e analisi del lampeggiante superficie-enhanced raman scattering

Observation and Analysis of Blinking Surface-enhanced Raman Scattering

Da una singola molecola in un incrocio di nanoaggregati argento, lampeggiante superficie-enhanced Raman scattering (SERS) è osservato. Qui, un protocollo è presentato su come preparare il SERS-attivo argento nanoaggregati, registrare un video di alcuni punti lampeggianti dell'immagine microscopica e analizzare le statistiche di lampeggiante. In questa analisi, una legge di potenza riproduce le distribuzioni di probabilità per eventi luminosi rispetto alla loro durata. Le distribuzioni di probabilità per eventi oscuri sono dotate di una legge di potenza con una funzione esponenziale. I parametri della legge di potere rappresentano il comportamento molecolare negli Stati sia chiaro e scuri. Il modello di random walk e la velocità della molecola su tutta la superficie d'argento può essere stimati. È difficile stimare anche quando si utilizzano medie, funzioni di autocorrelazione e super-risoluzione SERS imaging. In futuro, analisi di legge di potenza dovrebbero combinarsi con imaging spettrale, perché le origini del lampeggiante non possono essere confermate da questo metodo di analisi da solo.

Dall'argento nanoaggregati con poli-L-lisina preparato dal protocollo 1.2, si osservano macchie multicolore lampeggiante da SERS e superficie-enhanced fluorescenza, come illustrato nella Figura 111. Al contrario, monotoni punti colorati lampeggiante da SERS sono stati osservati per i nanoaggregati d'argento con le molecole di colorante preparate dal protocollo 1.37,8,</sup...

Questo protocollo descrive l'analisi del lampeggiante superficie-enhanced Raman scattering dovuto il cammino casuale di una singola molecola su una superficie d'argento utilizzando leggi di potenza.

Osservazione e analisi del lampeggiante superficie-enhanced Raman Scattering

From a single molecule at a silver nanoaggregate junction, blinking surface-enhanced Raman scattering (SERS) is observed. Here, a protocol is presented on ...

L'obiettivo generale di questa analisi del Blinking Surface-enhanced Raman Scattering è quello di studiare il comportamento di singole molecole su superfici di nanoparticelle metalliche. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nell'interfaccia e nella scienza dei coralli sul comportamento di lavoro delle interfacce solido-liquido Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile raccogliere molti dati perché è possibile osservare contemporaneamente circa una dozzina di punti lampeggianti in un video. Per iniziare questa procedura, lavare due vetrini da microscopio con detersivo liquido e acqua di rubinetto.Sciacquare i vetrini con acqua distillata e lasciarli asciugare all'aria. Successivamente, applicare una soluzione acquosa di poli-l lisina allo 0,1% su un vetrino asciutto. Lasciare riposare la soluzione sul vetrino per due o tre secondi.Quindi, utilizzare un soffiatore d'aria compressa per rimuovere la soluzione in eccesso e asciugare il vetrino. Quindi, applicare una sospensione di nanoparticelle di argento colloidale sul vetrino. Lasciare riposare la sospensione per due o tre secondi.Asciugare il vetrino con aria compressa. Quindi, utilizzare una penna barriera idrofobica per racchiudere completamente un'area di 26 millimetri per 26 millimetri sul vetrino. Lasciare asciugare la barriera.Far cadere l'acqua distillata sullo scivolo per riempire l'area chiusa. Coprire il vetrino con il secondo vetrino pulito e asciutto per evitare l'evaporazione dell'acqua. Posizionare il gruppo vetrino sul tavolino portacampioni del microscopio invertito.Illuminare il vetrino con luce bianca attraverso un condensatore a campo scuro. Metti a fuoco punti di vari colori passando da un obiettivo 2x a un obiettivo 60x. Successivamente, utilizzare un laser a onda continua a stato solido a 532 nanometri pompato a diodi, un filtro di interferenza passa-banda e una lente per illuminare il campione con un raggio attenuato a un angolo di 30 gradi rispetto alla superficie del campione.Spostare l'illuminazione laser al centro della vista e regolare leggermente la direzione z del tavolino di campionamento per affinare la messa a fuoco sui punti. Osservare gli aggregati come macchie monotone su uno sfondo uniforme. Quindi, spegnere il laser e inserire un filtro lungo sul bordo passante dopo la lente dell'obiettivo.Illuminare il campione con il laser a un angolo di 30 gradi rispetto alla superficie del campione, attraverso il filtro di interferenza e la lente esterna. Sposta il tavolino nelle direzioni x e y per trovare i punti lampeggianti. Quindi, utilizzare una fotocamera CCD digitale con un tempo di fotogramma compreso tra 61 e 120 millisecondi per acquisire un video di 20 minuti degli spot.Per iniziare l'analisi, aprire il video acquisito nel software della telecamera CCD. Fare clic e trascinare per selezionare le aree con e senza punti lampeggianti. Eseguire un'analisi temporale per ricavare un profilo temporale dell'intensità del segnale per le macchie e le aree scure.Acquisisci profili per tutti i punti lampeggianti e le aree scure di interesse in questo modo. Quindi, generare distribuzioni di probabilità per eventi luminosi e scuri in relazione alla loro durata. Macchie lampeggianti multicolori sono state osservate da SERS di nano aggregati d'argento, preparati con vetrini rivestiti di poli-l lisina.Il segnale lampeggiante è attribuito al cammino casuale di singole molecole alle giunzioni dei nano aggregati d'argento. I segnali provenienti dal singolo nanoaggregato hanno mostrato intensità variabili nel tempo, a differenza della fluorescenza lampeggiante di un punto quantico. La soglia per gli eventi luminosi è stata impostata su tre deviazioni standard al di sopra dell'intensità della linea di base e le durate degli eventi luminosi e scuri sono state determinate per ogni punto.La distribuzione di probabilità degli eventi luminosi è stata tracciata rispetto alla durata dell'evento come una linea e un grafico logaritmico, mentre la distribuzione di probabilità degli eventi oscuri è stata tracciata rispetto alla durata come una curva. Poiché le durate degli eventi oscuri erano generalmente più lunghe delle durate pari luminose, gli esponenti della legge di potenza per gli eventi luminosi tendevano ad essere più piccoli di quelli per gli eventi oscuri. Tempi di troncamento più brevi per gli eventi oscuri indicavano una passeggiata casuale molecolare più veloce, una barriera di energia più elevata da uno stato non emissivo a uno stato emissivo, o una combinazione di entrambi.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come osservare e analizzare i fenomeni SERS lampeggianti.

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Osservazione e analisi del lampeggiante superficie-enhanced Raman Scattering

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