Name: אוסף והפקת האוויר תעסוקתית דוגמאות לניתוח של DNA פטרייתי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: למד שיטה לאיסוף דגימות אוויר תעסוקתיות ולהפקת DNA פטרייתי לזיהוי מגוון מינים בסביבות עבודה. הטכניקה משפרת הערכת חשיפה תעסוקתית ומאפשרת זיהוי מקיף יותר של סיכוני בריאות פוטנציאליים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמך בחלקה על ידי הסכם הסוכנויות בין NIOSH NIEHS (AES12007001-1-0-6).

1. מכינים את הדוגם תרסיס NIOSH
הערה: הדוגם תרסיס NIOSH זה דוגמאות תרסיס בשני שלבים ציקלון שאוסף את bioaerosols באמצעות שני צינורות הדגימה והן מסנן טפלון (PTFE).
<ol><li>לפני הרכבה, בדקו בקפדנות את הדוגם. בדוק הדוגם כדי להבטיח זאת אינו פגום, כל הברגים במקום ואת צמוד הינם ההדבקה איטום סביב התפר הנוצרת על-ידי שני חצאים לא נפגע. בדוק את הדוגם o-ring כדי לוודא שאין כל nicks, סדקים או דמעות ויש לה ציפוי קל מאוד של גריז סיליקון. הערה: הדוגם כולל מסנן PTFE מיקרומטר 3 37 mm פוליסטירן או קלטת פוליפרופילן לסנן שלושה חלקים.<ol>
<li>להרכיב את הקלטת מסנן על-ידי הצבת של תאית או כרית תמיכה מסנן מפלסטיק (כלול עם המסננים) על פני השטח gridded של היצירה הבסיס (ראה איור 1). השתמש במסנן מלקחיים לשים את המסנן על גבי משטח תמיכה מסנן עם הצד אוסף פונה כלפי מעלה.</li>
		<li>חותם הקלטות מסנן באמצעות מכבש ידני או פנאומטי. יד הסגר יאפשר אוויר באזור המסנן ולהפחית את היעילות אוסף. הכנס את פיסת בצורת טבעת (הגלימה סיומת), והשתמש העיתונות לדחוף אותו בחוזקה, באופן שווה. לחץ כלפי מטה הגלימה הרחבה על המסנן מספיק חזק כדי להבטיח אוויר אינה דולפת סביב המסנן. הערה: החלק העליון בקלטת אינו נמצא בשימוש בעת הדגימה אך יש לשמור כדי לכסות את המסנן לאחר סיום דגימה.</li>
		<li>להתאים את הקלטת שהורכב על החלק העליון של הדוגם, ומדחיק ככל האפשר. עטיפת נייר-דבק 19 מ מ (3/4 אינץ ') סביב החלק החיצוני של מסנן קלטת, סמפלר להחזיק בקלטת מסנן במקום ולפעול כחותם גיבוי כדי למנוע דליפות.</li>
		<li>להבריג כל שפופרת בחוזקה באופן מלא סמפלר עד זה תחתונים ולפעול גלישת אטימה קלטת סביב כל שפופרת כחותם משני נגד דליפות. הערה: הרכבת התחתית הראשונה, צינור פוליפרופילן 15 מ"ל, אוספת חלקיקים שאינם respirable עם קוטר אווירודינמי > 4 מיקרומטר. הצינור השני, צינור פוליפרופילן microcentrifuge 1.5 mL, אוספת חלקיקים respirable בין 1 ו- 4 מיקרומטר. חלקיקים קטנים יותר, הנותרים < 1 מיקרומטר, נאספים על PTFE לסנן (ראה איור 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>כיילו את זרימת האוויר דרך הדוגם NIOSH עם צנצנת כיול לפני כל שימוש כמו הבדלים המסננים ואת דוגמי יגרום את זרימת האוויר משתנה.<ol>
<li>לשימוש צנצנת כיול, להכניס סכינים סטריליים מתאים הצנצנת העליון של המסנן את הקלטת, מקם את הדוגם בצנצנת ולאחר לאטום את הצנצנת.</li>
		<li>לחבר את הצנצנת כיול מד זרימה כיול, המשאבה הדגימה. להפעיל את המונה תזרים ולאפשר לו להתחמם לכמה דקות. שימו לב כי מד זרימה תמיד חייב להיות מסנן המצורפת שלה כניסת כדי להימנע מזיהום מד זרימה, את הדוגם.</li>
		<li>להפעיל את המשאבה הדגימה ולאפשר לו לפעול לכמה דקות לחמם ולייצב.</li>
		<li>התאם את המשאבה כדי להגדיר את קצב זרימה נכונה ב- 3.5 L/דקה. הערה: קצב הזרימה הדוגם תרסיס NIOSH מוגדרת בדרך כלל 3.5 L/min. בקצב הזה זרימה, הדוגם תואמת לקריטריונים ACGIH/ISO של חלקיקים respirable הדגימה16. המחירים זרימה אחרים יכולים לשמש אם ניתוק שונים הגדלים הם הרצויה או כדי להקטין את רמת הרעש, אבל להיות מודע כי אם קצב זרימה שונים, ואז הדוגם כבר לא להתאים לקריטריונים דגימה respirable.</li>
		<li>כיול תסתיים, כבה את המשאבה ואת מד זרימת.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. סטטי ואישי תרסיס דגימה
<ol><li>להגדיר את הדוגם תרסיס NIOSH לדיגום גם אזור אישי או סטטי. הערה: סטטי דגימה מתייחסת לשימוש את הדוגם תרסיס בעוד היא מצורפת חצובה או התקן אחר אחזקות (ראה איור 3), כפי לעומת אישי דגימה כאשר סמפלר של משאבת הם רכובים על האדם נחקר (ראה איור 4).<ol>
<li>לדיגום אזור סטטי, לשמור דוגמי קרוב ככל האפשר אל אזור ספציפי הנלמדים. שמור את דוגמי מן האוויר אינלטס, חדר כניסות ומקומות שעשויים להיות בדרך של זרימת האוויר. הערה: ריכוזי תרסיס יכול להשתנות במידה ניכרת אפילו במרחקים קצרים, במיוחד אם המקור תרסיס נמצא חדר ה-17.</li>
		<li>עבור דגימה אישי, להגדיר את הדוגם בתוך אזור הנשימה של האדם. לצרף את הדוגם דש, כתף או בחזה, למקם את המשאבה דגימה במותניים או בתרמיל. הערה: אזור הנשימה נפוץ ההנחה תהיה האונה 30 ס מ סביב האף של האדם שממנו רוב האוויר נמשך במהלך שאיפה17.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ודא כי הדוגם אבובים היא מרחק של אינלטס דוגם, כי שום דבר לא חוסם את פתחי הכניסה או להפריע זרימת האוויר לתוך הדוגם. הדוגם אבובים חייב להיות לא צבט או לפגוע. כל חסימה יגרום המשאבה לעצור.</li>
	<li>להפעיל את המשאבות. לאחר דקה או שתיים, לבדוק אם המשאבות עדיין פועלים. הערה: התנהגות אוויר דגימה לתקופות זמן שנעו מ קטנה כמו 10 דקות עבודה מלא 8 שעות משמרת, בהתאם לסביבה10,18,19. התוצאות שהוצגו איור 6 הן נציג של תקופת 60 דקות דגימה בסביבה מקורה.</li>
	<li>לאחר השלמת הדגימה האוויר, לאסוף את צינורות מדגם מסנן. הוצא את הקלטת איטום, להתיר את הצינורות, קאפ אותם. מקם את החלק השלישי של קלטת מסנן מעל המסנן. לאחסן דגימות ב 4 ° C עד מוכן לעיבוד.</li>
</ol>3. הפקת דנ א גנומי מדגימות האוויר
<ol><li>לחלץ הדנ א (gDNA) מבכל שלב הדוגם NIOSH BC251. לעבד את האוויר דגימה צינורות איסוף וסינון בנפרד כדי לאפשר קביעה של אירוסולים חיידקים respirable ו- respirable לדוגמה. הערה: לחלופין, שלושת השלבים ניתן להיות משולב, חילוץ אם מדגם inoculum הוא קטן מדי.<ol>
<li>Class II בטיחות ביולוגית ארון או זרימה שכבתית נקיים, גילוח ורחיצה כירורגית להסיר את המסנן. נגב את הקלטת דגימה באמצעות אתנול 70% ופריצה בקלטת דגימה לפתוח בעזרת כלי קלטת-פתיחה. השתמש של מרים מסנן כדי לדחוף את הפנקס מסנן ותמיכה כלפי מעלה. לתפוס את המסנן באמצעות מסנן מלקחיים ומניחים אותו בצלחת פטרי סטריליות. לחתוך את המסנן 6 חלקים שווים ומניחים צינור 2 מ"ל מחוזק המכיל 300 מ ג חרוזי זכוכית (0.2 - 0.5 מ מ).</li>
		<li>מקם את הצינור המכיל למסנן של חנקן נוזלי ל 30 s מיד למקם אותו מהמגן מיל חרוז שוכן בגובה 4.5 מטר לשנייה ב-30 s.</li>
		<li>חזור על שלב 3.1.2 פעם או פעמיים עד המסנן משופשף. חתיכות קטנות של מסנן שלם עשויים להישאר. להוסיף 0.5 מ של פירוק מאגר (אוריאה 4 מטר, 200 מ"מ טריס, 20 מ מ NaCl, 200 מ"מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), pH 7.4).</li>
		<li>הוסף mL 0.3 מאגר פירוק 15 mL, 1.5 mL אוויר דגם של צינורות. מערבולת הצינור במשך 10-15 s תוך זקוף, ואז עוד 10-15 s הפוכה. העבר את התוכן של כל שפופרת צינורות 2 מ"ל מחוזק המכיל 300 מ ג חרוזי זכוכית. הערה: רוב החומר שנאסף כל שפופרת סמפלר יצטברו בסמוך לחלקו העליון של הצינור.</li>
		<li>לעבד את כל צינורות מהמגן מיל חרוז-4.5 מטר לשנייה עבור 30 s ו צנטריפוגה אותם g x 20,000 עבור 1 דקות ב- 22 מעלות צלזיוס. להעביר צינורות סטרילי mL 1.5 microcentrifuge supernatants ו centrifuge הצינורות ב g x 20,000 שוב על 1 דקות ב- 22 מעלות צלזיוס. חזור על שלב זה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להוסיף 30 µL של ריאגנט פירוק (ראה טבלה של חומרים) כל צינור, דגירה הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.</li>
	<li>הוספת 0.2 מ של איגוד מאגר (10 מ' שתנן, 6 מ' guanidine-HCl, 10 מ מ טריס-HCl, 20% טריטון X-100, pH 4.4), proteinase K (100 µg/mL) כל צינור, דגירה הצינורות-70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות להוסיף 100 µL של אלכוהול איזופרופיל כדי כל שפופרת.</li>
	<li>להעביר את הפתרונות תמצית לתוך סיב מסנן צינורות זכוכית (קיבולת µL 700) ממוקמת ב 2 mL אוסף צינורות ו centrifuge הצינורות אוסף ב- g x 20,000 עבור 30 s-22 מעלות צלזיוס. למחוק את הצינורות אוסף ולמקם הצינורות מסנן לתוך צינורות חדשים של אוסף 2 מ"ל.</li>
	<li>להוסיף 0.5 mL מעכב הסרת מאגר (5 מ' guanidine-HCl, 20 מ מ טריס-HCl, pH 6.6, 38% אתנול) כל שפופרת, centrifuge הצינורות אוסף ב- g x 20,000 עבור 30 s-22 מעלות צלזיוס. למחוק את הצינורות אוסף ולמקם הצינורות מסנן לתוך צינורות חדשים של אוסף 2 מ"ל.</li>
	<li>להוסיף 0.5 mL שטיפת מאגר (20 מ מ NaCl, 2 מ מ טריס-HCl, pH 7.5, 80% אתנול) כל שפופרת, centrifuge הצינורות אוסף ב- g x 20,000 עבור 30 s-22 מעלות צלזיוס. למחוק את הצינורות אוסף ולמקם הצינורות מסנן לתוך צינורות חדשים של אוסף 2 מ"ל. חזור על תהליך זה.</li>
	<li>Centrifuge צינורות אוסף ב- g x 20,000 עבור 1 דקות נוספות ב 22 ° C כדי להסיר את כל מאגר לשארי שטיפת. למחוק את הצינורות אוסף ולמקם הצינורות מסנן לתוך צינורות אוסף חדש.</li>
	<li>להוסיף 100 µL חם (≥70 ° C) • תנאי מאגר (10 מ מ טריס-HCl, pH 8.5) כדי כל שפופרת, דגירה אותם בטמפרטורת החדר במשך 1-2 דקות צנטריפוגה הצינורות אוסף ב- g 20,000 x עבור 30 s-22 מעלות צלזיוס. העברת הצינורות מסנן ריק שפופרת microcentrifuge mL 1.5 סטרילי ולהחיל מחדש eluates מהשלב 3.8. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 1-2 דקות צנטריפוגה-g x 20,000 עבור 30 s-22 מעלות צלזיוס. הערה: Eluates יכול לשמש באופן מיידי עבור שלב 4 או מאוחסנות ב-20 ° C עד מוכן לשימוש. דנ א גנומי ניתן לאחסן עד שנה ב-20 ° C. מומלץ כי ה-DNA ניתן לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס אם נדרש לאחסון לטווח ארוך.</li>
</ol>4. הגברה של פטריות ribosomal DNA
<ol><li>השתמש תחל פטרייתי אוניברסלי כדי להגביר שלה אזורים 1 ו- 2 מן gDNA שחולצו. הערה: עבור פרוטוקול זה, תחל זוג Fun18Sf (5'-TTGCTCTTCAACGAGGAAT-3') / ITS4R (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') משמשים למתן את הכיסוי הכי גדול של ITS אזורים4,5. ערכות פריימר אחרות, כגון אלה המדגישים את האזורים ITS1 או ITS2 לבד, יכול לשמש.<ol>
<li>להגדיר תגובות שרשרת פולימראז (PCR) עבור כל דגימה בתגובות triplicate 50 µL סטרילי 0.5 mL המבחנות או 96-ובכן PCR צלחות כדלקמן: 5 µL של חילוץ תבנית ה-DNA (מתוך שלב 3), µL 33.3 PCR כיתה מים, µL 5 מאגר x PCR 10 , µL 1.5 של 50 מ מ MgCl2, µL 1 של 10 מ מ 2'-deoxynucleoside 5'-triphosphates, 0.5 µL של 20 מיקרומטר Fun18Sf פריימר לפנים, 0.5 µL של 20 מיקרומטר פריימר ITS4R הפוכה ו- 0.2 µL של הדנ א. אנזימים .</li>
		<li>לבצע תגובות ב הצנטרפוגה תרמי: דנטורציה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; 6 מחזורים של דנטורציה (96 ° C, 30 s) עבור חישול (50 ° C, 45 s) והסיומת פריימר (72 ° C, 3 דקות); 20 מחזורי דנטורציה (96 ° C, 30 s), מחזק (50 ° C, 45 s), והארכת תחל (72 ° C, 1 דקות); ולשמור על הארכת תחל ב-72 מעלות במשך 10 דקות את תערובות התגובה ב 4 ° C עד השלב הבא.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשלב שתגובות PCR triplicate לטהר באמצעות ערכת טיהור המבוסס על רפידה סיליקה. הערה: הליך זה מאפשר הסרת ה-PCR (תחל, dNTPs, אנזימים, מלחים, וכו '.) ורכיבים אחרים מזהמים מהכנות DNA מוגבר.<ol>
<li>לשלב את תגובות 3 עבור כל דגימה (סה כ 150 µL) סטרילי mL 1.5 microcentrifuge צינורות. להוסיף מאגר מחייב (5 מ' guanidine-HCl, 30% אלכוהול איזופרופיל) בווליום 5 x (750 µL) ולערבב את הפתרון על-ידי pipetting למעלה ולמטה עשר פעמים.</li>
		<li>הוסף µL 450 של תערובת ספין עמודות באוסף צינורות, centrifuge הצינורות ב g 17,900 x עבור ביטול ס' 30 את filtrates. להוסיף את µL 450 הנותרים העמודות, צנטריפוגה-g 17,900 x עבור 30 s-22 מעלות צלזיוס. הערה: העמודות ספין מכילים סיליקה קרום המאפשר ספיחה של ה-DNA לעמודות.</li>
		<li>למחוק את filtrates ומוסיפים µL 750 כביסה מאגר (10 מ"מ טריס-HCl, pH 7.5, 80% אתנול) העמודות ספין. Centrifuge את העמודות ב- g x 17,900 עבור 30 s-22 מעלות צלזיוס. הערה: תהליך זה הסרת המזהמים את התגובה PCR שהוזכרו לעיל.</li>
		<li>למחוק את פילטרט של ו centrifuge את העמודות הריקות-g x 17,900 עבור 1 דקות ב- 22 מעלות צלזיוס. הערה: השלב זה כדי להסיר את כל ממסר שטיפה מאגר שעלולות לפגוע יישומים במורד הזרם.</li>
		<li>להעביר את העמודות ספין סטרילי mL 1.5 microcentrifuge צינורות. להוסיף µL 45 • תנאי מאגר (10 מ מ טריס-Cl, pH 8.5), דגירה הצינורות בטמפרטורת החדר במשך 5 דק צנטריפוגה העמודות ספין-g x 17,900 עבור 1 דקות ב- 22 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>השתמש ה-DNA eluted מיד על שלבים 4 ו- 5 או לאחסן ב-20 ° C עד מוכן לשימוש. הערה: amplicons ניתן לאחסן עד שנה ב-20 ° C. מומלץ כי ה-DNA ניתן לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס אם נדרש לאחסון לטווח ארוך.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. אימות של הגברה ITS פטרייתי שימוש בג'ל agarose
<ol><li>הגבס agarose 1% ג'ל המכיל 1 µg/mL אתידיום ברומיד. להמיס agarose רותחים 1 x מאגר טריס-אצטט-EDTA (טה). ברגע הפתרון הוא מקורר עד כ 50 ° C, להוסיף את אתידיום ברומיד ויוצקים לתוך ג'ל יצוק.</li>
	<li>אחרי הג'ל agarose התחזק, לטבול את הג'ל 1 x TAE ולהכין את amplicons שיש לטעון על הג'ל. כדי µL 8 של ה-DNA מוגבר, להוסיף 2 µL של 5 x טעינת מאגר. הערה: אמצעי אחסון אלה ניתן להתאים בהתאם הריכוז של המאגר הטעינה הרצוי.</li>
	<li>לטעון את הדגימות, כל µL 10, על גבי הג'ל יחד עם סולם הדנ א לעיון גודל. הפעל את הג'ל ב-75 V (6 V/ס מ) עבור 90 דקות לדמיין להקות, בדרך כלל קשר בין 750 ו 1,000 זוגות בסיס, באמצעות אולטרה סגול בהיר (ראה איור 5).</li>
</ol>6. רצף וניתוח של אזורים ITS פטרייתי
<ol><li>רצף את gDNA חילוץ או אזורים ITS פטרייתי מוגבר ולנתח את רצפי בשיטות הנוכחי והולמים.</li>
</ol>

<ol><li>Mendell, M. J., Mirer, A. G., Cheung, K., Tong, M., Douwes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+and+allergic+health+effects+of+dampness%2C+mold%2C+and+dampness-related+agents%3A+a+review+of+the+epidemiologic+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Respiratory and allergic health effects of dampness, mold, and dampness-related agents: a review of the epidemiologic evidence.</a> Environ Health Perspect. 119 (6), 748-756 (2011).</li>
<li>Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+fungal+diversity+in+a+water-damaged+office+building%5BTitle%5D)+AND+%22J+Occup+Environ+Hyg%22%5BJournal%5D)">Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building.</a> J Occup Environ Hyg. 14 (4), 285-293 (2017).</li>
<li>Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+fungal+diversity+in+a+water-damaged+office+building%5BTitle%5D)+AND+%22J+Occup+Environ+Hyg%22%5BJournal%5D)">Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building.</a> J Occup Environ Hyg. , (2016).</li>
<li>Pitkaranta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+fungal+flora+in+indoor+dust+by+ribosomal+DNA+sequence+analysis%2C+quantitative+PCR%2C+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of fungal flora in indoor dust by ribosomal DNA sequence analysis, quantitative PCR, and culture.</a> Appl Environ Microbiol. 74 (1), 233-244 (2008).</li>
<li>Rittenour, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+transcribed+spacer+rRNA+gene+sequencing+analysis+of+fungal+diversity+in+Kansas+City+indoor+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Process+Impacts%22%5BJournal%5D)">Internal transcribed spacer rRNA gene sequencing analysis of fungal diversity in Kansas City indoor environments.</a> Environ Sci Process Impacts. 16 (1), 33-43 (2014).</li>
<li>Martin, K. J., Rygiewicz, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal-specific+PCR+primers+developed+for+analysis+of+the+ITS+region+of+environmental+DNA+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fungal-specific PCR primers developed for analysis of the ITS region of environmental DNA extracts.</a> BMC Microbiol. 5, 28(2005).</li>
<li>Monard, C., Gantner, S., Stenlid, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+ITS1+and+ITS2+to+study+environmental+fungal+diversity+using+pyrosequencing%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Utilizing ITS1 and ITS2 to study environmental fungal diversity using pyrosequencing.</a> FEMS Microbiol Ecol. 84 (1), 165-175 (2013).</li>
<li>Op De Beeck, M., Lievens, B., Busschaert, P., Declerck, S., Vangronsveld, J., Colpaert, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+and+validation+of+some+ITS+primer+pairs+useful+for+fungal+metabarcoding+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison and validation of some ITS primer pairs useful for fungal metabarcoding studies.</a> PLoS One. 9 (6), e97629(2014).</li>
<li>Toju, H., Tanabe, A. S., Yamamoto, S., Sato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-coverage+ITS+primers+for+the+DNA-based+identification+of+ascomycetes+and+basidiomycetes+in+environmental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-coverage ITS primers for the DNA-based identification of ascomycetes and basidiomycetes in environmental samples.</a> PLoS One. 7 (7), e40863(2012).</li>
<li>Lemons, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+rRNA+sequencing+analysis+of+evaporative+cooler+indoor+environments+located+in+the+Great+Basin+Desert+region+of+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Process+Impacts%22%5BJournal%5D)">Microbial rRNA sequencing analysis of evaporative cooler indoor environments located in the Great Basin Desert region of the United States.</a> Environ Sci Process Impacts. , (2017).</li>
<li>Cao, G., Noti, J. D., Blachere, F. M., Lindsley, W. G., Beezhold, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+improved+methodology+to+detect+infectious+airborne+influenza+virus+using+the+NIOSH+bioaerosol+sampler%5BTitle%5D)+AND+%22J+Environ+Monit%22%5BJournal%5D)">Development of an improved methodology to detect infectious airborne influenza virus using the NIOSH bioaerosol sampler.</a> J Environ Monit. 13 (12), 3321-3328 (2011).</li>
<li>Soo, J. C., Lee, T., Kashon, M., Kusti, M., Harper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quartz+in+coal+dust+deposited+on+internal+surface+of+respirable+size+selective+samplers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Occup+Environ+Hyg%22%5BJournal%5D)">Quartz in coal dust deposited on internal surface of respirable size selective samplers.</a> J Occup Environ Hyg. 11 (12), D215-D219 (2014).</li>
<li>Wang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+evaluation+of+personal+sampling+methods+for+multiple+bioaerosols%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Field evaluation of personal sampling methods for multiple bioaerosols.</a> PLoS One. 10 (3), e0120308(2015).</li>
<li>Lindsley, W. G., Schmechel, D., Chen, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-stage+cyclone+using+microcentrifuge+tubes+for+personal+bioaerosol+sampling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Environ+Monit%22%5BJournal%5D)">A two-stage cyclone using microcentrifuge tubes for personal bioaerosol sampling.</a> J Environ Monit. 8 (11), 1136-1142 (2006).</li>
<li>Rittenour, W. R., Park, J. H., Cox-Ganser, J. M., Beezhold, D. H., Green, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+DNA+extraction+methodologies+used+for+assessing+fungal+diversity+via+ITS+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Environ+Monit%22%5BJournal%5D)">Comparison of DNA extraction methodologies used for assessing fungal diversity via ITS sequencing.</a> J Environ Monit. 14 (3), 766-774 (2012).</li>
<li>ACGIH. <a target="_blank" href="https://www.acgih.org/forms/store/ProductFormPublic/documentation-of-the-threshold-limit-values-and-biological-exposure-indices-7th-ed">Documentation of the threshold limit values and biological exposure indices. Appendix C: Particle size-selective sampling criteria for airborne particulate matter</a>. , 7th ed, American Conference of Governmental Industrial Hygienists. (2001).</li>
<li>Rodes, C. E., Thornburg, J. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRodes%2C+CE+%22Aerosols+handbook%3A+measurement%2C+dosimetry%2C+and+health+effects%22">Aerosols handbook: measurement, dosimetry, and health effects</a>. Ruzer, L. S., Harley, N. H. , CRC Press. (2005).</li>
<li>Broadwater, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+a+persistent+odor+at+an+aircraft+seat+manufacturer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Occup+Environ+Hyg%22%5BJournal%5D)">Investigating a persistent odor at an aircraft seat manufacturer.</a> J Occup Environ Hyg. 13 (10), D159-D165 (2016).</li>
<li>Couch, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/niosh/nioshtic-2/20049586.html">Health Hazard Evaluation Program: Evaluation of Potential Hazards during Harvesting and Processing Cannabis at an Outdoor Organic Farm. Report No. 2015-0111-3271</a>. , U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, National Institute for Occupational Safety and Health. Cincinatti, OH. (2017).</li>
<li>Feinstein, L. M., Sul, W. J., Blackwood, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+bias+associated+with+incomplete+extraction+of+microbial+DNA+from+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of bias associated with incomplete extraction of microbial DNA from soil.</a> Appl Environ Microbiol. 75 (16), 5428-5433 (2009).</li>
<li>Keswani, J., Kashon, M. L., Chen, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+interference+to+conventional+and+real-time+PCR+for+detection+and+quantification+of+fungi+in+dust%5BTitle%5D)+AND+%22J+Environ+Monit%22%5BJournal%5D)">Evaluation of interference to conventional and real-time PCR for detection and quantification of fungi in dust.</a> J Environ Monit. 7 (4), 311-318 (2005).</li>
<li>Bellemain, E., Carlsen, T., Brochmann, C., Coissac, E., Taberlet, P., Kauserud, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ITS+as+an+environmental+DNA+barcode+for+fungi%3A+an+in+silico+approach+reveals+potential+PCR+biases%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">ITS as an environmental DNA barcode for fungi: an in silico approach reveals potential PCR biases.</a> BMC Microbiol. 10, 189(2010).</li>
<li>Farrelly, V., Rainey, F. A., Stackebrandt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+genome+size+and+rrn+gene+copy+number+on+PCR+amplification+of+16S+rRNA+genes+from+a+mixture+of+bacterial+species%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effect of genome size and rrn gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species.</a> Appl Environ Microbiol. 61 (7), 2798-2801 (1995).</li>
<li>Vesper, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Environmental+Relative+Moldiness+index+for+US+homes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Occup+Environ+Med%22%5BJournal%5D)">Development of an Environmental Relative Moldiness index for US homes.</a> J Occup Environ Med. 49 (8), 829-833 (2007).</li>
</ol>

הממצאים והמסקנות בדו ח זה הם אלה של המחברים, אינם מייצגים בהכרח עמדה רשמית של המכון הלאומי עבור בטיחות תעסוקתית ובריאות, מרכזי עבור מחלות ומניעתן.

קביעת המגוון פטרייתי בתוך סביבה תעסוקתית באמצעות גישות רצף השתפרה הערכת סיכון פטרייתי זיהוי וחשיפה. באמצעות גישה זו אפשרה איתור מינים פטרייתי נוספים רבים אשר לעיתים קרובות לא מזוהים באמצעות תרבות או מבוסס מיקרוסקופיה שיטות ההערכה. שיטת דגימה bioaerosols סביבות תעסוקתית, מקורה, הפקת דנ א גנומי מדגימות האוויר שלו הגברה, רצף מוצג כאן. האישושים פטרייתי הגיוון בשיטות אלה תלויה מאוד: חילוץ מוצלח (1) ושלמה של דנ א גנומי מן האוויר דוגמאות, (2) הגברה של gDNA עם תחל לאפשר השוואה של מוגבר שלו רצפי הפקידה רצפים של מסד הנתונים ואת מג...

חשיפות פטרייתי וסביבות מקורה בעיסוק יכול לגרום morbidities בדרכי הנשימה, כולל רגישות עולה אלרגיות, אסטמה1. זיהוי של מפגעים פטרייתי חשוב עבור הערכת הסיכון ומניעת חשיפה העובדים. מפגעים פטרייתי אלו עשויים להיות תוצאה של זיהום מקורה, חדירה חיצונית אוויר או הפרעה סביבתית, כי התוצאה הובלת חומרים פטרייתי לאזורים איפה העובדים הנוכחי2. שיטות להערכת חשיפה פטרייתי כללו דגימה תרבות בת קיימא, כמו גם זיהוי מיקרוסקופי של נבגי פטריות. גישות אלה יש מספר מגבלות ומשקיפים לעתים קרובות הרבה מינים פטרייתי זה יכול לתרום הנטל הכולל פטרייתי3. גישות התרבות מבדילים רק אלה יצורים פטרייתי קיימא זה יכול להיות מעובד במדיה מזין. זיהוי נבגי פטריות מיני לרמה באמצעות מיקרוסקופ יכול להיות מבולבל על ידי נבגים שיתוף מורפולוגיות דומות. שתי השיטות הן תלויות במידה רבה mycologists לנתח ולזהות המין פטרייתי, עם רבים שנותרו לא מזוהה.
כדי לשפר את מתודולוגיות הקיימים בשימוש זיהוי סיכון מקצועי והערכות לחשיפה, חוקרים רבים הפכו לטכנולוגיות מבוססות-מולקולרית. גישות רצף להערכת גיוון חיידקים בתוך סביבות מקורה בעיסוק חשפו ספקטרום רחב יותר של מינים פטרייתי נתקל לעומת שיטות כמו מיקרוסקופ תרבות בת קיימא3,4 ,5. השיטה המוצגת כאן מתאר את הדגימה האוויר של סביבות תעסוקתית, הפקת דנ א גנומי לצורך זיהוי סכנות פוטנציאליות פטרייתי. זיהוי סיכון מושגת על ידי רצף של גרעיני ribosomal מרווח משועתקים פנימי או ITS, אזורים משתנה מאוד בין פטריות, שימשו בדרך כלל כדי להבדיל בין המינים פטרייתי6,7, 8,9. מינים רבים למצוא במסגרות תעסוקתיות, כמו מינים מסוימים השייכים שלקרוא פטריות בסיסה, לא ניתנים לזיהוי בתרבות קיימא, שקשה להבדיל ברמה המיקרוסקופית. פטריות אלה נצפו בשפע היחסי גבוה בתוך סביבות מקורה בעיסוק מוערך על ידי רצף פטרייתי ITS אזורים3,4,10. רצף שלו סיפק ידע רב יותר לתוך המגוון של פטריות נתקל בתוך סביבות מקורה בעיסוק.
הפרוטוקול המתוארים כאן פרטים השיטות נהגו לאסוף לחלץ, להגביר את האזורים ITS פטרייתי מ bioaerosols לניתוח רצף. גישה זו מנצל את המכון הלאומי לבריאות (NIOSH) ובטיחות תעסוקתית ציקלון בשני שלבים תרסיס סמפלר לאסוף את החלקיקים באוויר. סמפלר זו פותחה כדי לאסוף את bioaerosols נפרדת respirable (≤4 מיקרומטר אווירודינמי קוטר) ו- respirable (> 4 מיקרומטר אווירודינמי קוטר) חלקיקים, המאפשר זיהוי של אורגניזמים פטרייתי בתוך סביבות מקורה ביותר נוטים להיות בשאיפה של העובד11. דוגמי אוויר אחרים, לרבות ציקלון סמפלרים, הינם זמינים על שוק זה יש את היכולת לאסוף את החלקיקים בתוך הטווח respirable (< 4 מיקרומטר) באמצעות מסננים12,13. לעומת זאת, הדוגם תרסיס בשני שלבים ציקלון NIOSH מפריד מינים פטרייתי מבוסס על קוטר אווירודינמי שלהם לתוך צינורות פוליפרופילן, חד פעמיים אשר ניתן לעבד באופן מיידי עבור יישומי הזרם14.
התהליכים של חילוץ דנ א גנומי ותגביר את האזורים ITS פטרייתי מפורטים של פרוטוקול זה. למתודולוגיות החילוץ הציג פותחו במיוחד עבור הפקת דנ א גנומי פטריות וחיידקים, כמו הרבה ערכות מסחרי למטרה בתרבית של תאים, חיידקים או שמרים במיוחד15. צבעי יסוד השתמשו במחקר זה נבחרו בהתבסס על הכיסוי שלהם הכוללת של פטריות 1 שלה והן שלה 2 אזורים4,5. רצף של אזורים אלה מאפשר השוואת הרבה רצפים ITS הפקידה, כולל אלה הרצף האזור 1 שלה, שלה 2 אזור או אזורים 1 שלה והן 2 שלה. המגוון פטרייתי של האוויר דוגמאות שנאספו הגדרה מקורה באמצעות שיטות אלה מוצגים, חשיפת מספר ניכר של רצפי להציב את phyla פטריות שק ו פטריות בסיסה, כמו גם רצפים אחרים השייכים phyla פטרייתי פחות דומיננטי, כגון זוגניות. המגוון הרחב של רצפי פטרייתי מזוהה באמצעות גישה זו לא יילכדו באמצעות מתודולוגיות זיהוי סיכון מסורתיים כמו טיפוח או מיקרוסקופ. רצף של אזורים ITS פטרייתי מספק שיטה משופרת כדי לזהות מפגעים פטרייתי וגם מאפשרים הבנה טובה יותר של חשיפות תעסוקתיות ומקורה פטרייתי.

<table><tbody><tr><td>NIOSH BC251 ביו-אירוסול ציקלון</td><td>NIOSH</td><td>BC251</td><td>דגימת NIOSH עדיין אינה זמינה מסחרית. אנא צור קשר עם וויליאם לינדסלי, דוקטורט (wlindsley@cdc.gov) לקבלת מידע על השגת דגימת NIOSH</td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים של פישרברנד עם מכסי בורג</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-681-373</td><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה פוליפרופילן 1.5 מ"ל לדגימת אוויר; הברגה עליונה של בורג חייבת להתאים להברגה של דגימת NIOSH</td></tr><tr><td>Falcon 15 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים</td><td>קורנינג</td><td>352096</td><td>15 מ"ל צינורות פוליפרופילן לדגימת אוויר</td></tr><tr><td>קלטת ויניל לחדר נקי, קלה להסרה, קלטת</td> מסנן <td>סרט איטום</td>ברוחב 1/4 אינץ' <td>McMaster-Carr</td><td>76505A1</td></tr><tr><td>, סטירן שקוף, 37 מ"מ</td><td>SKC Inc.</td>קלטת דגימה <td>225-3LF</td><td>3 חלקים (ללא פילטר). מכיל: בסיס קלטת, כיסוי מאריך, מכסה קלטת ותקעי כניסה/יציאה</td></tr><tr><td>מסנני ממברנה פלואורופור הידרופוביים PTFE, 3.0 ומיקרו; m, 37 מ"מ</td><td>EMD Millipore</td><td>FSLW03700</td><td>מכיל: 37 מ"מ, 3.0 ומיקרו; m מסנני PTFE ורפידות תמיכה</td></tr><tr><td>מלקחיים מסננים פישרברנד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>09-753-50</td><td>מלקחיים מסננים</td></tr><tr><td>דגם 502 דיוק PanaPress</td><td>PanaVise</td><td>502</td><td>מכבש קלטות פנאומטי בנוי ממכבש סוכת דיוק זה</td></tr><tr><td>סקוטש סופר 33+ סרט חשמלי ויניל</td><td>McMaster-Carr</td><td>76455A21</td><td>סרט 19 מ"מ</td></tr><tr><td>צנצנת כיול רב תכליתית,</td><td>SKC גדול בע"מ</td><td>225-112</td><td>צנצנת כיול</td></tr><tr><td>אוניברסלית PCXR4 מדגם משאבת</td><td>SKC Inc.</td><td>משאבת דגימה</td> <td>224-PCXR4</td></tr><tr><td>מד זרימת מסה 4140</td><td>TSI Inc.</td><td>4140</td><td>מד זרימה</td></tr><tr><td>Roche High Pure PCR ערכת תבנית Roche</td><td>Diagnostics</td><td>ערכת 11796828001</td><td>המשמשת למיצוי DNA גנומי. מכיל: מאגר ליזה, מאגר קשירה, פרוטאינאז K, מאגר להסרת מעכב, מאגר כביסה, מאגר סילוק, צינורות סינון סיבי זכוכית וצינורות איסוף 2 מ"ל</td></tr><tr><td>פישרברנד 2 מ"ל צינורות בורג פוליפרופילן מחוזקים עם כובעים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>15340162</td><td>2 מ"ל צינורות מחוזקים להומוגניזציה של חרוזים</td></tr><tr><td>חרוזי זכוכית, שטופים בחומצה, 212-300 ומיקרו; m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1277</td><td>חרוזי זכוכית</td></tr><tr><td>טחנת חרוזים מדעית פישר מדעי 24 הומוגנייזר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>15-340-163</td><td>הומוגנייזר חרוזים</td></tr><tr><td>מגיב ליזה תאי B CelLytic, 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8740</td><td>מגיב ליזה</td></tr><tr><td>פלטינה טאק פולימראז</td><td>Invitrogen</td><td>10966-018</td><td>מכיל: פולימראז פלטינה טק, מאגר PCR 10X (ללא MgCl2), 50 מ"מ MgCl2, מאריך KB</td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Invitrogen</td><td>18427-088</td><td>10 מ"מ dNTP</td></tr><tr><td>mix QIAquick PCR ערכת טיהור</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>המשמשת לטיהור אמפליקונים פטרייתיים. מכיל: מאגר PB (מאגר קשירה), מאגר PE (מאגר כביסה), מאגר EB (מאגר פליטה), צבע מחוון pH (אופציונלי), וצבע טעינת GelPilot</td></tr><tr><td>ינשוף EasyCast מיני מערכת אלקטרופורזה ג'ל</td><td>Thermo Fisher</td><td>B1 או B2</td><td></td></tr><tr><td>TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder</td><td>Thermo Fisher</td><td>10488-085</td><td>סולם DNA</td></tr></tbody></table>

אוסף והפקת האוויר תעסוקתית דוגמאות לניתוח של dna פטרייתי

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

שיטות מסורתיות של זיהוי חשיפות פטרייתי בסביבות תעסוקתית, כגון תרבות וגישות מבוסס מיקרוסקופיה, יש מספר מגבלות המביאים הדרה של מינים רבים. ההתקדמות בתחום בשני העשורים האחרונים הובילו בריאות תעסוקתית חוקרים לפנות מולקולרי המבוסס על גישות לזיהוי סיכונים פטרייתי. שיטות אלה גרמו הגילוי של מינים רבים בתוך סביבות מקורה בעיסוק זה לא זוהו בשיטות מסורתיות. זה פרטי פרוטוקול גישה לקביעת גיוון פטרייתי בתוך האוויר דוגמאות דרך הפקת דנ א גנומי, הגברה, רצף, זיהוי טקסונומי של פטריות פנימי עיבד אזורים מרווח (ITS). התוצאות שלה רצף זיהוי מינים רבים פטרייתי, כי הם לא זוהה או קשה לזהות לרמה מינים באמצעות תרבות או מיקרוסקופ. בעוד ששיטות אלה אינם מספקים מדדים כמותיים של הנטל פטרייתי, הם מציעים גישה חדשה זיהוי הזארד, יכול לשמש כדי לקבוע הכוללת מינים עושרה ורב -גוניותה בתוך סביבה תעסוקתית.

התפלגות המינים בתוך סביבה יכול להידרש באמצעות השפע היחסי על-ידי קביעת המספר של שיבוטים של כל OTU זיהה בדגימות אוויר. איור 6 הוא תרשים כתר המייצג את המינים taxonomically ממוקמת בתוך סביבה מקורה בעקבות 60 דקות של הדגימה האוויר. זה יכול להיות שנצפו כי הסביבה מכיל מגוון רחב של מינים בתוך שתי הגדולות phyla פטריות, פטריות שק, פטריות בסיסה, וכן מינים השייכים שלקרוא זוגניות (Rhizopus microsporus). שיטות מסורתיות של הערכת מוטים כלפי זני פטריות שק, כמו פטריות ...

קביעת המגוון פטרייתי בתוך סביבה היא שיטה מנוצל בלימודי בריאות תעסוקתית לזהות את הסכנות הבריאותיות. פרוטוקול זה מתאר מיצוי DNA מדגימות האוויר תעסוקתית עבור הגברה ורצף של אזורים ITS פטרייתי. גישה זו מזהה הרבה מינים פטרייתי זה ניתן להתעלם על ידי שיטות הערכה מסורתית.

אוסף והפקת האוויר תעסוקתית דוגמאות לניתוח של DNA פטרייתי

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

המטרה הכוללת של מתודולוגיית דגימת אוויר ומיצוי DNA זו היא להשיג DNA גנומי פטרייתי שניתן להגביר, לרצף ולמקם טקסונומית כדי לזהות סכנות פטרייתיות פוטנציאליות במסגרות תעסוקתיות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הערכת החשיפה התעסוקתית, כגון לאילו סכנות פטרייתיות נחשפים עובדים שעלולות לגרום להשפעות בריאותיות שליליות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להבהיר מיני פטריות שנותרו בלתי מזוהים בשיטות מבוססות תרבית או מיקרוסקופיה באמצעות גישות מבוססות ריצוף.כדי להרכיב את קלטת מסנן דגימת האוויר, הנח כרית תמיכה של מסנן תאית על המשטח המרושת של חלק הבסיס, ולאחר מכן, בעזרת מלקחיים מסננים, הנח מסנן על גבי כרית תמיכת המסנן כשצד האיסוף פונה כלפי מעלה. לאחר ההרכבה, אטמו את קלטת המסנן על ידי הכנסת כיסוי ההארכה ולחיצה עליו בחוזקה ובאופן שווה בעזרת מכבש ידני או פנאומטי. לאחר מכן, התקן את הקסטה המורכבת על גבי דגימת התרסיס של NIOSH ודחף כלפי מטה ככל האפשר.השתמש בחתיכת סרט 19 מילימטר כדי לעטוף את החלק החיצוני של קלטת המסנן והדגימה המחזיקה את קלטת המסנן במקומה ופועלת כאטם גיבוי למניעת נזילות. הברג את צינורות האיסוף בחוזקה ובמלואם לתוך הדגימה עד שהם מגיעים לתחתית ועוטפים את סרט האיטום סביב הצינורות המשמשים כאיטום משני נגד דליפה. כדי לבצע דגימת אירוסול אישית, הנח את הדגימה בתוך אזור הנשימה של האדם.חבר את הדגימה לדש, לכתף או לחזה ולאחר מכן שמור את משאבת הדגימה בגובה המותניים או בתיק גב. הפעל את המשאבות ובדוק לאחר דקה אם המשאבה פועלת. לאחר השלמת דגימת האוויר, אסוף את דגימת האוויר מהנבדק.הסר את סרט האיטום, פתח את הצינורות ואז הניח עליהם מכסה. הנח את החלק השלישי של קלטת המסנן מעל המסנן. ראשית, נגב את קלטת הדגימה עם 70% אתנול, ולאחר מכן השתמש בכלי לפתיחת קלטת כדי לפתוח את קלטת הדגימה תוך כדי עבודה בארון בטיחות ביולוגי Class II.לאחר מכן, השתמש במרים מסנן כדי להרים את כרית התמיכה ולסנן כלפי מעלה. לאחר מכן, השתמש במלקחיים מסננים כדי להסיר את המסנן ולהניח אותו בצלחת פטרי סטרילית. חותכים את המסנן לשש חתיכות שוות בעזרת אזמל סטרילי ואז מניחים אותם בצינור מחוזק של שני מיליליטר המכיל 300 מיליגרם של חרוזי זכוכית של 200 עד 500 מיקרומטר.טבלו את הצינור המכיל פילטר בחנקן נוזלי למשך 30 שניות ולאחר מכן הניחו אותו במהירות בהומוגנייזר של טחנת חרוזים במהירות של 4.5 מטר לשנייה למשך 30 שניות. הוסף 0.5 מיליליטר של מאגר ליזה לצינורות המכילים את החתיכות הקטנות הנותרות של המסנן השלם, ולאחר מכן הוסף 0.3 מיליליטר של מאגר ליזה לצינורות איסוף דגימות האוויר של 15 ו-1.5 מיליליטר ומערבל את הצינורות במצב זקוף והפוך למשך 10 עד 15 שניות בהתאמה. העבירו את מאגר הליזיס מכל צינור איסוף לצינורות מחוזקים של שני מיליליטר המכילים 300 מיליגרם חרוזי זכוכית.עבד את הצינורות בהומוגנייזר טחנת החרוזים למשך 30 שניות, ולאחר מכן צנטריפוגה את הדגימות בכוח הכבידה פי 20,000 למשך דקה אחת ב-22 מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, העבירו את הסופרנטנט בצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מיליליטר ושוב צנטריפוגה את הסופרנטנט בכוח הכבידה פי 20,000 למשך דקה אחת ב-22 מעלות צלזיוס. לאחר הוספת 30 מיקרוליטר של מגיב ליזה, דגרו את הצינורות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.לאחר מכן, הוסף 0.2 מיליליטר של מאגר מקשר ו -100 מיקרוגרם למיליליטר של פרוטאינאז K לשפופרת, ואז השאר את הצינורות לדגירה בתנור בלוק בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לבסוף, הוסף 100 מיקרוליטר איזופרופנול לכל צינור. לאחר מכן, הניחו צינורות סינון סיבי זכוכית בנפח של 700 מיקרוליטר בצינורות איסוף של שני מיליליטר והעבירו לתוכו את תמיסות החילוץ.לאחר ההעברה, צנטריפוגה את צינורות האיסוף בכוח הכבידה פי 20,000 למשך 30 שניות ב-22 מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, הכנס את סיבי מסנן הזכוכית לצינורות איסוף טריים והשליך את צינור האיסוף. לכל צינור יש להוסיף 0.5 מיליליטר של מאגר להסרת מעכבים ולבצע צנטריפוגה בכוח הכבידה פי 20,000 למשך 30 שניות ב-22 מעלות צלזיוס.השלך את צינור האיסוף לאחר הצנטריפוגה והנח את צינורות המסנן בצינורות איסוף חדשים. לאחר מכן, הוסף 0.5 מיליליטר של מאגר כביסה לכל צינור ושוב נתון לצנטריפוגה בכוח הכבידה פי 20, 000 למשך 30 שניות ב-22 מעלות צלזיוס. השליכו את צינור האיסוף והחליפו בטריים לאחר הצנטריפוגה.שוב, הוסף 0.5 מיליליטר של מאגר כביסה לכל צינור וצנטריפוגה בכוח הכבידה פי 20,000 למשך 30 שניות ב-22 מעלות צלזיוס. כדי להסיר כל מאגר כביסה שנותר, סוף סוף צנטריפוגה את צינורות האיסוף בכוח הכבידה פי 20, 000 למשך דקה אחת בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס והשליכו את צינורות האיסוף והחליפו אותם בטריים. לאחר הוספת 100 מיקרוליטר של מאגר פליטה חם, דגרו את הצינורות על ספסל המעבדה בטמפרטורת החדר למשך דקה עד שתיים וצנטריפוגה את צינורות האיסוף בכוח הכבידה פי 20,000 למשך 30 שניות ב-22 מעלות צלזיוס.הנח את צינורות הסינון בצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מיליליטר והחל מחדש את האלואטים לצנטריפוגה עגולה נוספת. השתמש בצינורות PCR של 0.5 מיליליטר כדי להגדיר תגובות של 50 מיקרוליטר בשלוש עותקים עם חמישה מיקרוליטרים של DNA שכבר חולץ עבור כל תגובה, ולאחר מכן תכנת את התרמו-סייקלר והתחל את המחזור. מערבבים את כל שלוש תגובות ה-PCR יחד בצינורות מיקרו-צנטריפוגה סטריליים של 1.5 מיליליטר.הוסף 750 מיקרוליטר של מאגר מחייב וערבב היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים. הוסף 450 מיקרוליטר מהתערובת הכוללת לעמודות סיבוב המוכנסות לצינורות איסוף והתחל לצנטריפוגה בכוח הכבידה פי 17, 900 למשך 30 שניות, ואז השליך את הסינון והוסף את 450 המיקרוליטר הנותרים של התערובת לסבב שני של צנטריפוגה. שוב, השליכו את המסנן והוסיפו 750 מיקרוליטר של מאגר כביסה לעמודי הסיבוב והצנטריפוגה בכוח הכבידה פי 17, 900 למשך 30 שניות ב-22 מעלות צלזיוס.לבסוף, השליכו את המסנן וסובבו מחדש את העמודים הריקים בכוח הכבידה פי 17, 900 למשך דקה אחת ב-22 מעלות צלזיוס. לאחר העברת עמודי הסיבוב לצינורות מיקרו-צנטריפוגה סטריליים של 1.5 מיליליטר, פיפטה 45 מיקרוליטר של מאגר פליטה ודגירה על הצינורות על ספסל המעבדה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה של העמודים בכוח הכבידה פי 17, 900 למשך דקה אחת ב-22 מעלות צלזיוס.טבלו ג'ל אגרוז 1% במאגר TAE מתקפל אחד בתא אלקטרופורזה, ולאחר מכן ערבבו שני מיקרוליטרים של מאגר טעינה פי חמישה עם שמונה מיקרוליטר של DNA מוגבר. לבסוף, טען את כל 10 המיקרוליטרים של הדגימה על הג'ל יחד עם סולם ה-DNA. הפעל את הג'ל ב 75 וולט למשך כ- 90 דקות.ג'ל אגרוז מייצג מדגים הגברה של אזורי מרווח מתועתקים פנימיים של DNA גנומי פטרייתי שמקורו בדגימות אוויר תעסוקתיות. הנתיב בצד שמאל הקיצוני מייצג את נתיב סמן ה-DNA. הרצועות מימין מייצגות את אזורי המרווח המתומללים הפנימיים המוגברים מדגימות אוויר תעסוקתיות שונות בגדלים הנעים בין 750 ל-1,000 זוגות בסיסים.תרשים קרונה מייצג מראה את נוכחותם של מיני פטריות טקסונומיות מגוונות בסביבה פנימית. דגימת הציקלון הביו-אירוסול של NIOSH שימשה בבתים לאיסוף ביו-אירוסולים למשך שעה כדי לקבוע את מיני הפטריות הקיימים. נתונים טבלאיים מייצגים את מדדי המגוון והעושר של מיני פטריות בסביבות פנימיות.הנתונים מראים מדדי עושר גבוהים יותר של Chao-1, מדדי גיוון שאנון ומקדמי אי-דמיון של בריי-קרטיס בסביבות קירור ממוזגות ואידוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לאסוף דגימות אוויר פנימיות ותעסוקתיות ולחלץ DNA גנומי לניתוח אוכלוסיות מיקרוביאליות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בשיטות האספטיות הטובות ביותר למניעת זיהום מיקרוביולוגי של הדגימות.

collection-extraction-occupational-air-samples-for-analysis-fungal

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

ההרס של פלחה ידי זרעים מדביק פטריות גרם מאמצי מחקר רבים כדי להבין טוב יותר הצמח לפתוגן אינטראקציות. ללמוד זרעים פטרייתיים אינטראקציות במעבדה להגדרה, פיתחנו שיטה חזקים כימות של רבייה ביומסה פטרייתי, וזיהום mycotoxin באמצעות bioassays ליבה.

כימות של קולוניזציה Sporogenesis פטרייתי, ולאחר הפקה של mycotoxins שימוש bioassays-Kernel

שני ניתוחים משלימים של חלקיקים ביולוגיים אטמוספריים ממסננים שנדגמו באוויר מתוארים כאן: מיצוי וזיהוי של אנדוטוקסין ושל DNA.

Air-שנדגמו ניתוח סינון עבור אנדוטוקסינים ותוכן DNA

קונסורציומים חיידקים בתוך bumble דבורים כוורות להעשיר ולשמר אבקה של דבורה הזחלים. באמצעות רצף הדור הבא, יחד עם המעבדה, המבוסס על שדה ניסויים, כתב יד זה מתאר פרוטוקולים המשמשים כדי לבדוק את ההשערה כי שאריות פטריות לשנות את microbiome אבקה, ודמוגרפיה המושבה, המוביל בסופו של דבר אל המושבה הפסד.

אמפירית, Metagenomic, שיטות חישוביות להאיר את מנגנוני הבריאות דבורה איזה פשרה קוטלי פטריות

כאן נתאר פרוטוקול כדי לקבוע נטל פטרייתי ריאתי בעכברים עם aspergillosis פולשנית באמצעות כימות של כסף methanamine שונה של Gomori מכתים בסעיפים היסטולוגית. השימוש בשיטה זו הביאה תוצאות דומות עם פחות בעלי חיים לעומת הערכה של הנטל פטרייתי מאת PCR כמותי של ריאות פטרייתית דנ א.

כימות היסטולוגית כדי לקבוע נטל פטרייתי ריאות ב Aspergillosis ניסיוני

הבנת ההרכב הביולוגי של חלקיקי סביבתי חשוב לחקר שלה השפעות משמעותיות על בריאות האדם ואת התפשטות המחלה. . היינו שלושה סוגים של שיטות דגימה bioaerosol, ניתוח הביולוגי של חיידקים באוויר כדאי לחקור את קהילות חיידקים באוויר בתנאים סביבתיים שונים.

הלחנה וניתוח הפצה Bioaerosols בתנאים סביבתיים שונים

כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט כדי ליצור פרופילי טביעת אצבע DNA על ידי הגברת VNTR לוקוס D1S80 מ- DNA תא אפיתל.

יישום של טביעת אצבע DNA באמצעות לוקוס D1S80 בשיעורי מעבדה

פרוטוקול זה מתאר מיצוי של תרכובות אורגניות נדיפות מדגימה ביולוגית בשיטת מיצוי סורבנט בסיוע ואקום, כרומטוגרפיית גז בשילוב עם ספקטרומטריית מסה באמצעות מסילת הכנת דגימות Entech וניתוח נתונים. הוא מתאר גם תרבית של דגימות ביולוגיות ובדיקת איזוטופים יציבה.

לכידת תרכובות אורגניות נדיפות מיקרוביאליות המיוצרות באופן פעיל מדגימות הקשורות לבני אדם עם מיצוי סורבנט בסיוע ואקום

פרוטוקול זה הוא שיטה יעילה ומהירה של culturing שמרים ואת התבנית Aspergillus fumigatus מקבוצות גדולות של דגימות קרקע תוך 7 ימים בלבד. ניתן לשנות את השיטות בקלות כך שיתאימו למגוון של מדיות דגירה וטמפרטורות לפי הצורך לניסויים.

בידוד של שמרים ועובשים הניתנים לעיבוד מאדמות כדי לחקור את מבנה האוכלוסייה הפטרייתית

המאמר הנוכחי נועד לספק פרוטוקולים מפורטים ונאותים לבידוד פטריות אנדופיטיות הקשורות לצמחים, שימור ארוך טווח של מבודדים, אפיון מורפולוגי ומיצוי DNA כולל לצורך זיהוי מולקולרי וניתוחים מטאגנומיים לאחר מכן.

בידוד, אפיון ומיצוי DNA כולל לזיהוי פטריות אנדופיטיות בצמחים מיקוהטרוטרופיים

צורות אמינות ומדויקות של ניתוח DNA שניתן לפרוס בשטח הן קריטיות לתעשיות רבות. מאמר זה מציע שתי שיטות לניתוח מיקרוביאלי סביבתי בשטח: 1) בידוד DNA מיקרוביאלי מדגימות סביבתיות באמצעות ערכת שדה חילוץ ביולוגית, ו-2) ניתוח DNA באמצעות יחידת qPCR בשטח.

ניתוח DNA מיקרוביאלי בשטח באמצעות ערכת שדה חילוץ ביולוגית ויחידת qPCR שדה

למד שיטה לאיסוף דגימות אוויר תעסוקתיות ולהפקת DNA פטרייתי לזיהוי מגוון מינים בסביבות עבודה. הטכניקה משפרת הערכת חשיפה תעסוקתית ומאפשרת זיהוי מקיף יותר של סיכוני בריאות פוטנציאליים.

אוסף והפקת האוויר תעסוקתית דוגמאות לניתוח של DNA פטרייתי

גלה סרטונים נוספים