Cromatina diffusa i preparativi per l'analisi della progressione di ovocita Mouse dalla profase alla metafase II

L'obiettivo generale di questa preparazione per la diffusione della cromatina è quello di visualizzare cronologicamente i modelli di localizzazione dinamica delle proteine legate alla cromatina e la morfologia cromosomica degli ovociti durante l'oogenesi dei mammiferi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia riproduttiva femminile, come l'appaiamento cromosomico omologo, la sinapsi, la riparazione del DNA e la segregazione cromosomica meiotica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente una chiara marcatura immunologica e la visualizzazione delle proteine associate ai cromosomi e la valutazione della ploidia degli ovociti.

L'ovogenesi è soggetta a errori e la mancata segregazione cromosomica spesso provoca malattie genetiche. Questo metodo può essere utilizzato per migliorare la nostra comprensione delle cause materne di aneuploidia e infertilità. Dopo l'eutanasia di una femmina di topo che si trova da 14 a 19 giorni dopo il coito, praticare un'apertura a forma di V nella cavità addominopelvica.

Quindi rimuovere il corno uterino materno. Quindi separare gli embrioni dalla placenta e sacrificare gli embrioni per decapitazione. Quindi trasferiscili in una piastra di Petri da 35 millimetri contenente tre millilitri di PBS a 37 gradi Celsius.

Quindi sposta un cucciolo in un piatto separato anch'esso caricato con PBS caldo. Dopo l'eutanasia del feto, praticare un taglio lungo la linea mediana ventrale della metà posteriore, lungo la metà anteriore sotto gli arti anteriori e direttamente sopra gli arti posteriori e la coda. Quindi, apri l'addome dell'embrione usando forbici da 3,5 pollici.

Usando una pinza a punta fine, sposta o rimuovi il fegato e le anse dell'intestino, esponendo le gonadi. Ora determina se le gonadi sono maschili o femminili. Le ovaie si trovano immediatamente sotto e dietro il rene, verso la parete posteriore della cavità peritoneale.

Rimuovere entrambe le ovaie utilizzando un paio di pinze a punta fine e trasferirle in un piccolo contenitore contenente PBS che viene mantenuto a 37 gradi Celsius. Procedi rapidamente a raccogliere le ovaie da tutti i feti. Successivamente, in un nuovo piccolo contenitore, immergere completamente ogni serie separata di ovaie in mezzo millilitro di tampone di ipoestrazione appena fatto.

Lasciali incubare a 25 gradi Celsius per almeno 15 minuti, ma non più di 30 minuti. Durante l'incubazione, utilizzare una penna PAP con barriera idrofobica per disegnare due quadrati di 22 x 22 millimetri su un vetrino pulito. Preparare un vetrino per ogni serie di ovaie.

Al termine dell'incubazione, aggiungere una goccia da 50 microlitri di saccarosio da 100 millimolari a un vetrino pulito e trasferire un paio di ovaie nella goccia. Ora usa due aghi calibro 27 per stuzzicare le ovaie e rilasciare le cellule al loro interno. Con una pinza, rimuovere e scartare i pezzi grossi di ovaio.

Quindi pipettare con cura la soluzione di saccarosio per disperdere le cellule rilasciate. Quindi caricare ogni quadrato su un vetrino con 40 microlitri di PFA all'1% con Triton X-100 allo 0,2%. Distribuire la soluzione intorno al quadrato utilizzando la punta di una pipetta o facendo oscillare il vetrino avanti e indietro.

Quindi, per ogni pool di soluzione di saccarosio con cellule, caricare due pozzanghere fissative con 20 microlitri di cellule sospese in modo che ogni vetrino contenga cellule provenienti da una serie di ovaie. Per le raccolte di ovociti MI o MII, preparare prima e sopprimere il topo donatore. Quindi praticare una grande apertura a forma di V nella cavità addominopelvica e utilizzare una pinza per spostare l'intestino per individuare ogni corno uterino.

Trova le ovaie prossimali alla gabbia toracica. Tenere l'ovidotto con una pinza sottile e tagliare il grasso sopra l'ovaio usando le forbici da dissezione. Mentre si tiene ancora l'ovidotto, utilizzare una pinza fine per rilasciare l'ovaio dalla borsa e trasferire le ovaie in una capsula di raccolta contenente terreno mantenuto a 37 gradi Celsius.

Per raccogliere gli ovociti allo stadio GV, utilizzare una siringa da un millilitro con un ago calibro 27 per rilasciare i complessi cumulo-ovocita perforando manualmente i grandi follicoli antrali. Per raccogliere gli ovociti dello stadio MII, fai un foro nell'ampolla dell'ovidotto per rilasciarli piuttosto che fare semplicemente una puntura. Ora raccogli gli ovociti utilizzando una pipetta di vetro azionata a bocca o un capillare, oppure usa una siringa micrometrica manuale.

Alcuni ovociti possono essere circondati da cellule cumuliforme, altri no. Per gli ovociti MI, preparare una ialuronidasi fresca in MEM-alfa/BSA per denudare gli ovociti delle cellule del cumulo circostanti. Per ogni raccolta di ovociti, trattarli in un'incubatrice con 2,5 millilitri di ialuronidasi preparata per tre minuti.

Quindi trasferire gli ovociti MI in un terreno MEM-alfa/BSA caldo appena preparato. Lì, utilizzare una pipetta di vetro azionata a bocca per fornire la forza di taglio necessaria per staccare completamente le cellule del cumulo. In generale, il successo di questa procedura richiede la padronanza della raccolta e della manipolazione degli ovociti utilizzando pipette di vetro o capillari azionati a bocca.

Lasciare che gli ovociti si riprendano nell'incubatrice. Nel frattempo, in una lastra di vetro riscaldata a nove pozzetti, caricare 300 microlitri di soluzione calda di Tyrode. Caricare due pozzetti con 300 microlitri di MEM-alfa/BSA caldo e caricare un pozzetto con 300 microlitri di terreno caldo di Waymouth.

Per rimuovere la zona pellucida, trasferire da cinque a 10 ovociti in stadio MII o MII nel bagno della soluzione di Tyrode per soli 30-45 secondi mentre li si osserva al microscopio da dissezione. Quando la zona pellucida è visibilmente sciolta, trasferire immediatamente gli ovociti nel terreno utilizzando una pipetta pre-bagnata con terreno MEM-alfa/BSA. Quindi trasferire gli ovociti in un secondo bagno di terreno riscaldato.

Dopo il secondo bagno, trasferisci gli ovociti nel terreno caldo di Waymouth e lasciali riposare in un'incubatrice per 30 minuti. Per prepararti a una diffusione della cromatina, usa una penna PAP per disegnare un rettangolo di 11 x 44 millimetri su un vetrino. Quindi rivestire il vetrino con uno strato sottile di PFA all'1% con Triton X-100 allo 0,2% in acqua, quindi far oscillare il vetrino avanti e indietro per distribuire la soluzione.

Quindi tocca la diapositiva per rimuovere l'eccesso. Ora aspirare tra i cinque e i 10 ovociti con una quantità minima di terreno. Quindi trasferire gli ovociti sul vetrino preparato trascinando contemporaneamente la punta di una pipetta attraverso la soluzione fissativa e facendo cadere gli ovociti sul vetrino da circa un centimetro di altezza.

Gli ovociti dovrebbero scoppiare immediatamente, diffondendo la cromatina sul vetrino. Ora incubare i vetrini a temperatura ambiente in una camera umidificata chiusa. Lasciali riposare per una notte in modo che la cromatina aderisca al vetrino.

La raccolta di cromatina embrionale descritta è stata utilizzata per analizzare quantitativamente la formazione di crossover in ovociti prelevati da embrioni C57 neri/6J. I preparati di diffusione della cromatina profase sono stati immunomarcati per rilevare SYCP3, SYCP1 e MLH1 e colorati con DAPI. I cromosomi allo stadio di pachitene avevano 27 focolai MLH1 distribuiti lungo 20 strutture SC completamente assemblate.

Quando la preparazione diffusa era subottimale e i singoli cromosomi erano indistinguibili, la preparazione non è stata inclusa nella valutazione. In buone preparazioni, SMC6 è stato arricchito nella regione dell'eterocromatina pericentromerica e lungo i bracci cromosomici, e i focolai di MLH1 si sono distribuiti lungo la SC allo stadio di pachitene. Il numero di crossover MLH1-positivi da 15 buone preparazioni wild-type è stato di circa 24.

Il metodo di raccolta degli ovociti è stato utilizzato per valutare la morfologia della cromatina negli ovociti dopo la ripresa meiotica. La localizzazione delle proteine, così come la ploidia, è stata facilmente valutata, esponendo potenziali cause di errori di segregazione cromosomica. La topoisomerasi II-alfa può essere osservata lungo i bracci cromosomici e l'eterocromatina pericentromerica.

Negli ovociti MII, i cromatidi fratelli accoppiati potrebbero essere distinti in base alla morfologia cromosomica e centromerica. Una volta padroneggiate, queste tecniche senza o dopo la coltura possono essere completate entro una o due ore per topo. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi complementari, come l'immunomarcatura degli ovociti a cellule intere e l'imaging di cellule vive, per valutare i cromosomi omologhi e i cromatidi fratelli nel contesto della cellula.

Nel complesso, i metodi di diffusione della cromatina qui descritti possono essere facilmente applicati per valutare l'ovogenesi dei mammiferi e le caratteristiche sessualmente dimorfiche della dinamica dei cromosomi e delle proteine durante la meiosi.