Name: Elettroforesi bidimensionale accoppiata con spettrometria di massa per unanalisi del proteoma di tessuto umano Adenoma pituitario (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: Scopri l'elettroforesi bidimensionale accoppiata con spettrometria di massa per analizzare il proteoma di adenoma ipofisario umano. Questo metodo consente l'identificazione di proteine a bassa abbondanza con alta sensibilità.

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Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (Grant n. 81572278 e 81272798 a XZ), le sovvenzioni da Cina "863" Plan Project (Grant No. 2014AA020610-1 a XZ), i fondi di ospedale Xiangya per introduzione di talento (a XZ) e il Hunan Fondazione di scienza naturale provinciale della Cina (Grant No. 14JJ7008 a XZ). Gli autori riconoscono anche il contributo scientifico del Dr. Dominic M. Desiderio in Health Science Center della University of Tennessee. X.Z. continuamente sviluppato e utilizzato metodi 2DE-MS per analizzare il proteoma di adenoma pituitario a partire dal 2001, concepito il concetto per il manoscritto presente, ha scritto e rivisto il manoscritto, coordinato i lavori pertinenti ed è stato responsabile per la sostegno finanziario e il lavoro corrispondente. Y.L. partecipato revisione del manoscritto. Y.H ha partecipato insieme di riferimenti e revisione del manoscritto. Tutti gli autori approvato il manoscritto finale.

<ol><li>Zhan, X., Wang, X., Cheng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pituitary+adenoma+proteomics%3A+new+progresses+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Human pituitary adenoma proteomics: new progresses and perspectives.</a> Front. Endocrinol. 7 (54), (2016).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+analysis+of+human+pituitary+adenomas%3A+Current+status+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives.</a> Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).</li>
<li>Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+and+functional+profiles+of+a+follicle-stimulating+hormone-positive+human+nonfunctional+pituitary+adenoma%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma.</a> Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).</li>
<li>Karppinen, A., Kivipelto, L., Vehkavaara, S., Ritvonen, E., Tikkanen, E., Kivisaari, R., Hernesniemi, J., Setälä, K., Schalin-Jäntti, C., Niemelä, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+from+microscopic+to+endoscopic+transsphenoidal+surgery+for+nonfunctional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22World+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Transition from microscopic to endoscopic transsphenoidal surgery for nonfunctional pituitary adenomas.</a> World Neurosurg. 84 (1), 48-57 (2015).</li>
<li>Liu, X., Ma, S., Dai, C., Cai, F., Yao, Y., Yang, Y., Feng, M., Deng, K., Li, G., Ma, W., Xin, B., Lian, W., Xiang, G., Zhang, B., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiproliferative%2C+antiinvasive%2C+and+proapoptotic+activity+of+folate+receptor+%CE%B1-targeted+liposomal+doxorubicin+in+nonfunctional+pituitary+adenoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Antiproliferative, antiinvasive, and proapoptotic activity of folate receptor α-targeted liposomal doxorubicin in nonfunctional pituitary adenoma cells.</a> Endocrinol. 154 (4), 1414-1423 (2013).</li>
<li>Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+adenoma+nitroproteomics%3A+current+status+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid.+Med.+Cell.+Longev%22%5BJournal%5D)">Pituitary adenoma nitroproteomics: current status and perspectives.</a> Oxid. Med. Cell. Longev. 2013, 580710(2013).</li>
<li>Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+analysis+of+nitrotyrosine-containing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins.</a> Mass Spectrom. Rev. 34 (4), 423-448 (2015).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reference+map+of+a+pituitary+adenoma+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A reference map of a pituitary adenoma proteome.</a> Proteomics. 3 (5), 699-713 (2003).</li>
<li>Desiderio, D. M., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+human+pituitary+proteome%3A+The+characterization+of+differentially+expressed+proteins+in+an+adenoma+compared+to+a+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A study of the human pituitary proteome: The characterization of differentially expressed proteins in an adenoma compared to a control.</a> Cell. Mol. Biol. 49 (5), 689-712 (2003).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+analysis+of+the+human+pituitary+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity analysis of the human pituitary proteome.</a> Clin. Chem. 49 (10), 1740-1751 (2003).</li>
<li>Zhan, X., Evans, C. O., Oyesiku, N. M., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+and+tanscriptomics+analyses+of+secretagogin+down-regulation+in+human+non-functional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22Pituitary%22%5BJournal%5D)">Proteomics and tanscriptomics analyses of secretagogin down-regulation in human non-functional pituitary adenomas.</a> Pituitary. 6 (4), 189-202 (2003).</li>
<li>Moreno, C. S., Evans, C. O., Zhan, X., Okor, M., Desiderio, D. M., Oyesiku, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+molecular+signaling+in+human+clinically+non-functional+pituitary+adenomas+identified+by+gene+expression+profiling+and+proetomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Novel molecular signaling in human clinically non-functional pituitary adenomas identified by gene expression profiling and proetomic analyses.</a> Cancer Res. 65 (22), 10214-10222 (2005).</li>
<li>Zhan, X., Wang, X., Long, Y., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+analysis+of+the+proteomes+in+clinically+nonfunctional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity analysis of the proteomes in clinically nonfunctional pituitary adenomas.</a> BMC Med. Genomics. 7, (2014).</li>
<li>Zhan, X., Giorgianni, F., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+analysis+of+growth+hormone+isoforms+in+the+human+pituitary%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary.</a> Proteomics. 5 (5), 1228-1241 (2005).</li>
<li>Kohler, M., Thomas, A., Püschel, K., Schänzer, W., Thevis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+pituitary+growth+hormone+variants+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of human pituitary growth hormone variants by mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 8 (2), 1071-1076 (2009).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+pituitary+nitroproteome%3A+detection+of+nitrotyrosyl-proteins+with+two-dimensional+Western+blotting%2C+and+amino+acid+sequence+determination+with+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">The human pituitary nitroproteome: detection of nitrotyrosyl-proteins with two-dimensional Western blotting, and amino acid sequence determination with mass spectrometry.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 325 (4), 1180-1186 (2004).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitroproteins+from+a+human+pituitary+adenoma+tissue+discovered+with+a+nitrotyrosine+affinity+column+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry.</a> Anal. Biochem. 354 (2), 279-289 (2006).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+ion-trap+mass+spectrometric+characterization+of+human+pituitary+nitrotyrosine-containing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Linear ion-trap mass spectrometric characterization of human pituitary nitrotyrosine-containing proteins.</a> Int. J. Mass Spectrom. 259, 96-104 (2007).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M., Wang, X., Zhan, X., Guo, T., Li, M., Peng, F., Chen, X., Yang, H., Zhang, P., Li, X., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+proteomic+variations+of+invasive+relative+to+noninvasive+nonfunctional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Identification of the proteomic variations of invasive relative to noninvasive nonfunctional pituitary adenomas.</a> Electrophoresis. 35 (15), 2184-2194 (2014).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+pathway+networks+mined+from+human+pituitary+adenoma+proteomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Signal pathway networks mined from human pituitary adenoma proteomics data.</a> BMC Med. Genomics. 3, 13(2010).</li>
<li>O’Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+two-dimensional+electrophoresis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.</a> J. Biol. Chem. 250 (10), 4007-4021 (1975).</li>
<li>Klose, J., Kobalz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+electrophoresis+of+proteins%3A+an+updated+protocol+and+implications+for+a+functional+analysis+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome.</a> Electrophoresis. 16 (6), 1034-1059 (1995).</li>
<li>Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+two-dimensional+gel+electrophoresis+and+multi-dimensional+liquid+chromatography+as+proteomic+separation+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Chromatogr.+Sep.+Tech%22%5BJournal%5D)">Current status of two-dimensional gel electrophoresis and multi-dimensional liquid chromatography as proteomic separation techniques.</a> Ann. Chromatogr. Sep. Tech. 1 (2), 1009(2015).</li>
<li>Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M. R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L., Humphery-Smith, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+with+gene-product+mapping+of+the+Mollicutes%3A+Mycoplasma+genitalium%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium.</a> Electrophoresis. 16, 1090-1094 (1995).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+spatial+and+quantitative+reproducibility+between+two+second-dimensional+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Differences in the spatial and quantitative reproducibility between two second-dimensional gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 24 (11), 1834-1846 (2003).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spot+volume+vs.+amount+of+protein+loaded+onto+a+gel.+A+detailed%2C+statistical+comparison+of+two+gel+electrophoresis+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Spot volume vs. amount of protein loaded onto a gel. A detailed, statistical comparison of two gel electrophoresis systems.</a> Electrophoresis. 24 (11), 1818-1833 (2003).</li>
<li>Zhan, X. Two-dimensional electrophoresis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhan%2C+X+%22Experimental+Protocols+for+Medical+Molecular+Biology+in+Chinese+and+English%22">Experimental Protocols for Medical Molecular Biology in Chinese and English</a>. Zheng, W. , Peking Union Medical College Press. Beijing. 93-108 (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Electrophoresis+in+Practice%3A+A+guide+to+Methods+and+Applications+of+DNA+and+Protein+Separations%22">Electrophoresis in Practice: A guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations</a>. Westermeier, R. , VCH Wiley. Weinheim. (1997).</li>
<li>Zhan, X., Yang, H., Peng, F., Li, J., Mu, Y., Long, Y., Cheng, T., Huang, Y., Li, Z., Lu, M., Li, N., Li, M., Liu, J., Jungblut, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+many+proteins+can+be+identified+in+a+2DE+gel+spot+within+an+analysis+of+a+complex+human+cancer+tissue+proteome%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?</a> Electrophoresis. , (2018).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano che non esiste alcun conflitto di interessi.

2de, accoppiato con MS metodi tra cui 2DE-MS PMF e 2DE-MS/MS, è stato utilizzato con successo nel nostro programma a lungo termine - l'uso della proteomica per studiare la variazione di proteomica umane NFPA e rete molecolare per la delucidazione dei meccanismi molecolari e scoperta di biomarcatori efficace per NFPAs. Proteomica comparativa basata su 2DE con buona riproducibilità svolge un ruolo importante nell'identificazione di NFPA proteomica variazioni9,10<su...

PA è un tumore comune che si verifica nella ghiandola pituitaria umana nei sistemi di asse ipotalamo-ipofisi-mirati dell'organo, che svolgono un ruolo importante nel sistema endocrino umano. PA comprende clinicamente funzionali e non funzionali PAs (FPA e NFPA)1,2. NFPA è difficile nella diagnosi di stadio precoce e la terapia a causa di livelli di ormone solo leggermente elevati (ad es., LH e FSH) nel sangue rispetto al FPA, che ha aumentato significativamente i livelli di ormoni corrispondenti nel sangue3,4 ,5. Il chiarimento dei meccanismi molecolari e scoperta di biomarcatori efficace è importante significato clinico nella diagnosi, terapia e prognosi di NFPA. Il nostro obiettivo a lungo termine è quello di sviluppare e utilizzare metodi di proteomica per studiare NFPA per la scoperta di biomarcatori affidabili per chiarire i meccanismi molecolari e riconoscere bersagli terapeutici efficaci così come marcatori diagnostici e prognostici. 2-DE accoppiato con metodi MS sono stati ampiamente usati nel nostro programma di ricerca a lungo termine per quanto riguarda umano PA proteoma1,2,6,7, compresa l'istituzione di riferimento proteome Mappe:3,8, analisi di proteine differenzialmente espresse profili9,10,11,12,13, varianti di ormone14 ,15, modificazioni post-traduzionali come la fosforilazione della tirosina e14 nitrazione16,17,18, la variazione di proteomica di invasivo rispetto al non invadente NFPAs19e l'eterogeneità di proteomica di NFPA sottotipi13, che ha condotto alla scoperta di più reti via importante (disfunzione mitocondriale, disregolazione del ciclo cellulare, stress ossidativo e segnalazione MAPK anomalia di sistema) che vengono modificate in NFPA13,19,20.
2DE separa le proteine secondo il loro punto isoelettrico (pI) (messa a fuoco isoelettrica, IEF) e il peso molecolare (tramite elettroforesi del gel di poliacrilammide del sodio dodecil solfato, SDS-PAGE)1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. si tratta di una tecnica di separazione classica e comuni nel campo della proteomica, poiché l'introduzione dei concetti del proteoma e la proteomica in 199524. MS è la tecnica fondamentale per scoprire l'identità delle proteine 2DE-separati, comprese strategie di PMF e MS/MS. Il molto rapido sviluppo degli strumenti di MS, soprattutto negli aspetti della sensibilità di rilevazione e risoluzione, in combinazione con il miglioramento del sistema di LC, migliora notevolmente l'identità delle proteine di basso o bassissimo abbondanza in un proteoma per massimizzare la copertura di un proteoma. Essa contesta anche i nostri concetti tradizionali che solo uno o due proteine sono presenti in un gel 2D spot in un'analisi del proteoma di tessuto umano complesso e offre l'opportunità di identificare proteine multiple in un gel 2D spot in un'analisi del complesso tessuto umano proteoma e massimizzare la copertura del proteoma NFPA.
Qui descriviamo protocolli dettagliati di 2DE-MALDI MS PMF, 2DE-MALDI MS/MS e 2DE-LC-MS/MS che sono state utilizzate con successo nell'analisi del proteoma umano NFPA. I protocolli prevedono la preparazione di campioni, prima dimensione (messa a fuoco isoelettrica, IEF), seconda dimensione (SDS-PAGE), visualizzazione delle proteine (macchiatura d'argento e la macchiatura blu di Coomassie), analisi del gel 2D, digestione della tripsina in-gel, l'immagine purificazione di peptidi triptici, PMF, MS/MS e database bruciante3,8,25,26. Inoltre, questo protocollo si traduce facilmente per l'analisi di altri proteomi di tessuto umano.

<table><tbody><tr><td>Ettan IPGphor 3&nbsp;</td><td>Sistema di focalizzazione isoelettrica</td> <td>GE Healthcare</td><td></td>.</tr><tr><td>Ettan DALTsix ruota multigel</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ettan DALT II System</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA</td><td></td><td>Il sistema di elettroforesi verticale</td></tr><tr><td>Ettan IPGphor strip holder</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ettan DALTsix multigel caster</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA</td><td></td><td>Ruota multigel</td></tr><tr><td>Voyager DE STR MALDI-TOF MS</td><td>ABI, Foster City, CA</td><td></td><td>MALDI-MS PMF</td></tr><tr><td>MALDI-TOF-TOF</td><td>Autoflex III, Bruker</td><td></td><td>MALDI-MS/MS spettrometro di massa</td></tr><tr><td>LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA,</td><td></td> USA <td>Spettrometro di massa ESI-MS/MS</td></tr><tr><td>EASY-NANO LC SYSTEM&NBSP;</td><td>Proxeon Biosystems, Odense, Danimarca</td><td></td><td>Sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni</td></tr><tr><td>PepMap C18 trap column&nbsp;</td><td>300 &mu; m i.d. &volte; Lunghezza 5 mm; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RP C18 colonna</td><td>75 &mu; m i.d., lunghezza 15 cm; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, Stati Uniti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KimWipe</td><td>Kimvipe</td><td></td><td>Asciugamano di carta insolubile</td></tr><tr><td>Watter Realizzato</td><td>da PURELAB strumento</td><td></td><td></td>flessibile</tr><tr><td>Polytron Modello P710/35 omogeneizzatore</td><td>Brinkmann Instruments, Westbury, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDQuest</td><td>Bio-Rad,&nbsp; Hercules, CA</td><td></td><td>Software di analisi di immagini su gel 2D</td></tr><tr><td>SEQUEST&nbsp;</td><td>Thermo Proteome Discoverer 1.3 (versione n. 1.3.0.339)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DataExplore (ver. 4.0.0.0) software</td><td></td><td></td> MS software <td>per l'elaborazione dello spettro</td></tr><tr><td>Software Mascot</td><td></td><td></td><td>software per la ricerca di proteine basato su PMF&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td> Mascot Software <td>per la ricerca di proteine basato su MS/MS</td></tr><tr><td>Software Proteome Discoverer v.1.3 beta</td><td>Software Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur v.2.1</td><td></td><td></td><td>Software di gestione dei dati acquisiti MS/MS&nbsp</td></tr><tr><td>Uniprot versione 201410.1_HUMAN.fasta</td><td></td><td></td><td>Database di proteine umane</td></tr><tr><td>SEQUEST (versione n. 1.3.0.339)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Software per la ricerca di proteine basato su MS/MS I</td></tr><tr><td>MASCOT (versione 2.3.02)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Software per la ricerca di proteine basato su MS/MS Kit standard per</td></tr><tr>microcolonna <td>Millipore</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PeptideMass per</td> microcolonna C18<td>Perspective Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine BCA Pierce</td><td>Termo&nbsp; Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Kit Quant 2D</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6483-56</td><td></td></tr><tr><td>BIS-ACRILAMMIDE</td><td>AMRESCO</td><td>0172</td><td></td></tr><tr><td>ACRILAMMIDE</td><td>AMRESCO</td><td>0341</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Tiourea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>VETEC</td><td>V900119</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>AMRESCO</td><td>0227</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>AMRESCO</td><td>0465</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>AMRESCO</td><td>M146</td><td></td></tr><tr><td>Ammonio Persolfato</td><td>AMRESCO</td><td>M133</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Promega, Madison, WI, USA</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>IPG tampone pH 3-10, NL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6000-87</td><td></td></tr><tr><td>Striscia Stagna Immobilina pH 3-10NL,18cm</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1235-01</td><td></td></tr></tbody></table>

elettroforesi bidimensionale accoppiata con spettrometria di massa per un'analisi del proteoma di tessuto umano adenoma pituitario

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

Adenoma pituitario umano (PA) è un tumore comune che si verifica nella ghiandola pituitaria umana nei sistemi di asse ipotalamo-ipofisi-mirati dell'organo e può essere classificato come PA clinicamente funzionali o non funzionali (FPA e NFPA). NFPA è difficile per diagnosi di stadio precoce e la terapia a causa di a malapena elevando gli ormoni nel sangue rispetto al FPA. Il nostro obiettivo a lungo termine consiste nell'utilizzare metodi di proteomica alla scoperta di biomarcatori affidabili per chiarimento dei meccanismi molecolari di PA e riconoscimento delle efficaci marcatori diagnostici, prognostici e bersagli terapeutici. Efficace elettroforesi bidimensionale (2DE) accoppiato con metodi di spettrometria di massa (MS) sono stati presentati qui per analizzare proteomi PA umani, compresa la preparazione dei campioni, 2D elettroforesi del gel, visualizzazione di proteine, analisi delle immagini, in gel digestione della tripsina, impronta digitale totale del peptide (PMF) e tandem (MS/MS) di spettrometria di massa. 2-dimensional gel elettroforesi matrix-assisted laser desorbimento/ionizzazione spettrometria totale PMF (2DE-MALDI MS PMF), 2DE-MALDI MS/MS e le procedure di MS/MS cromatografia 2DE-liquido (LC) sono state applicate con successo in un'analisi del proteoma NFPA. Con l'uso di uno spettrometro di massa ad alta sensibilità, molte proteine sono state identificate con il metodo 2DE-LC-MS/MS in ogni gel 2D spot in un'analisi del complesso tessuto di PA per massimizzare la copertura del proteoma umano PA.

1. 2DE-MALDI MS PMF: con la procedura sperimentale descritta sopra, sono stati estratti un totale di 150 µ g proteine dai tessuti NFPA FSH-espresso (donna; 50 anni, ACTH (-), GH (-), PRL (-), (-) di LH e FSH (+) e TSH (-)) e schierati con un 18cm IPG strip (pH 3-10 NL) e un gel di SDS-PAGE di grande formato, poi visualizzati con la macchiatura d'argento. Abbiamo ottenuto un modello di gel 2DE riproducibile e buona di NFPA tessuto proteoma (<strong class="...

Qui, presentiamo un'elettroforesi bidimensionale (2DE) accoppiata alla spettrometria di massa (MS) per separare e identificare adenoma pituitario umano tessuto proteoma, che presenta un modello 2DE buona e riproducibili. Molte proteine sono osservati in ogni spot 2DE analizzando nel complesso cancro proteoma con l'uso di MS ad alta sensibilità.

Elettroforesi bidimensionale accoppiata con spettrometria di massa per un'analisi del proteoma di tessuto umano Adenoma pituitario

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

L'obiettivo generale di questa elettroforesi su gel bidimensionale abbinata alla procedura di spettrometria di massa è quello di separare e identificare il proteoma tissutale dell'adenoma ipofisario umano. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dei proteomi. Come l'alto di proteoma.E la scoperta della situazione proteica, della proteina quattro e della proteina spaziosa. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'elettroforesi su gel bidimensionale è facilmente accoppiata con la spettrometria di massa ad alta sensibilità per identificare il proteoma, in particolare le proteine a bassa abbondanza. Situazione proteica, quattro proteine e proteine spaziose.Le implementazioni di questa tecnica tendono verso la PQ itery della terapia animale. A causa della proteina chiave per la proteina spaziosa o il modello proteico è utile nella diagnosi dei pazienti. Mostriamo che una dimostrazione di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi dell'elettroforesi su gel bidimensionale sono difficili da imparare perché richiede tempo, lavoro e ci sono diversi trucchi sperimentali.Per iniziare questa procedura, aggiungere 250 microlitri di una soluzione di campione proteico precedentemente preparata in ciascuna fessura di un supporto per striscia IPG da 13 centimetri. Posizionare una striscia IPG di 18 centimetri, con il lato in gel rivolto verso il basso, su ciascuna soluzione del campione proteico facendo attenzione a evitare bolle. Quindi aggiungere da tre a quattro millilitri di olio minerale per coprire ogni striscia IPG.Quindi, assemblare ciascun supporto per strisce IPG in un sistema di messa a fuoco isoelettrico con l'estremità appuntita sulla piastra posteriore e l'estremità quadrata sulla piastra anteriore. Dopo aver reidratato le strisce IPG per 18 ore a temperatura ambiente, impostare i parametri IEF sul sistema di focalizzazione isoelettrico con un tempo di funzionamento totale di 7,5 ore e 36.875 volt ora. Dopo l'IEF, estrarre ogni striscia di IPG dal sistema di focalizzazione isoelettrico e rimuovere l'olio minerale in eccesso con un tovagliolo di carta insolubile.Quindi avvolgere ogni striscia in un foglio di pellicola trasparente e conservare a meno 80 gradi Celsius. Per lanciare un gel al 12% di PAGINA, aggiungere acqua distillata doppia, tampone tris-cloridrico molare da 1,5 molari, acrilammide al 40%, soluzione madre di bis-acrilammide, persolfato di immodio al 10% e temporizzato in un becher. Mescolare delicatamente la soluzione in gel, facendo attenzione a evitare bolle.Versare delicatamente la soluzione di gel in una camera di colata multipla fino all'altezza prevista del gel di 19 centimetri. Aggiungere immediatamente circa tre millilitri di acqua distillata doppia alla camera di multifusione per coprire ogni gel in risoluzione e lasciare che ogni gel polimerizzi per circa un'ora. Questo passaggio è molto importante per preparare un gel SDS-PAGE di alta qualità e l'acqua deve essere immediatamente aggiunta sulla parte superiore di ogni gel.Preparare due litri di tampone per elettroforesi, quindi aggiungere il tampone a un serbatoio tampone dell'unità di separazione per elettroforesi. Dopo aver tolto le strisce di IPG focalizzate dal congelatore, metterle in un recipiente di plastica contenente un millilitro di tampone di equilibrio riducente e una traccia di blu di bromofenolo ed equilibrarle per 10 minuti con un leggero dondolio. Dopo aver rimosso il tampone di equilibrio riducente, aggiungere quattro millilitri di tampone di equilibrio di escalazione e una traccia di blu di bromofenolo alle strisce IPG ed equilibrarle per 10 minuti con un leggero dondolio.Durante l'equilibrio del gel, smontare la camera di multifusione e rimuovere la cassetta del gel risolutivo preparata. Sciacquare la cassetta del gel tre volte con acqua distillata doppia, quindi rimuovere l'acqua di accesso dalla cassetta del gel con un tovagliolo di carta insolubile e posizionarla in uno stander per gel. Successivamente, sciacquare le strisce IPG equilibrate con tampone per elettroforesi e rimuovere il liquido in eccesso su ciascuna superficie della striscia IPG con un tovagliolo di carta insolubile.Posizionare una striscia IPG sul gel SDS-PAGE risolutivo, facendo in modo che il lato di plastica della striscia IPG entri in contatto con la lastra di vetro più lunga con l'estremità appuntita a sinistra. Ora aggiungi rapidamente tre o quattro millilitri di agarosio caldo all'1% e tampone per elettroforesi SDS per sigillare la striscia IPG sulla parte superiore di ogni gel SDS-PAGE e posiziona il lato superiore della striscia IPG sulla parte superiore della lastra di vetro più corta facendo attenzione a evitare bolle. Questi passaggi sono molto importanti per sigillare la striscia IPG al gel SDS-PAGE.Le soluzioni calde di agarosio devono essere immediatamente aggiunte e la striscia IPG deve essere immediatamente posizionata nella parte superiore del gel SDS. Dopo la polimerizzazione, inserire la cassetta di gel assemblata verticalmente tra le guarnizioni di plastica in un sistema di elettroforesi verticale. Posizionare la parte superiore del gel con la striscia IPG accanto al catodo.Quindi, regolare il livello del tampone per elettroforesi per immergere la cassetta del gel aggiungendo il volume appropriato di tampone al sistema di elettroforesi. Collegare e impostare l'alimentatore in modalità tensione costante e farlo funzionare a 200 volt per circa 370 minuti monitorando il colorante. Al termine della corsa, estrarre la cassetta del gel dal sistema di elettroforesi e rimuovere delicatamente il gel dalla cassetta del gel, facendo attenzione a non strappare il gel.Trasferire con cura il gel in un vassoio contenente 250 millilitri di soluzione di fissaggio e agitare delicatamente il gel per 20 minuti. Successivamente, scartare la soluzione e aggiungere 250 millilitri di metanolo al 50% nel vassoio. Quindi agitare delicatamente il gel per 10 minuti.Dopo aver agitato il gel in acqua bidistillata, aggiungere 250 millilitri di tampone sensibilizzante contenente lo 0,02% di solfato di sodio. Agitare delicatamente il gel per un minuto. Dopo aver agitato due volte il gel in acqua distillata doppia, aggiungere 250 millilitri di soluzione di reazione all'argento e agitare delicatamente il gel per 20 minuti.Dopo aver agitato il gel in acqua doppia distillata, aggiungere 250 millilitri di soluzione di sviluppo e agitare delicatamente fino ad ottenere la colorazione desiderata, che in genere è da uno a tre minuti. Ora aggiungi 250 millilitri di acido acido al 5% per terminare la colorazione e agita delicatamente il gel per 10 minuti. Dopo aver agitato il gel in acqua distillata doppia, aggiungere 250 millilitri di glicerolo all'8,8% e conservare il gel a quattro gradi Celsius fino all'analisi.Un modello di gel bidimensionale riproducibile e buono del proteoma tissutale NFPA è stato ottenuto dall'elettroforesi su gel con circa 1.200 spot proteici rilevati nella mappa su gel bidimensionale che erano distribuiti principalmente nell'area di pH da quattro a otto e massa da 15 a 150 kilodalton. Un totale di 192 proteine ridondanti sono state identificate da 141 macchie di gel su 337 analizzate nell'analisi MALDI-MS PMF e nessuna proteina è stata identificata nei restanti 196 punti. La colorazione con blu commassie ha prodotto un modello di gel bidimensionale riproducibile e di alta qualità del proteoma tissutale NFPA invasivo e circa 1.100 spot proteici rilevati in una mappa gel bidimensionale che sono stati distribuiti principalmente nell'intervallo di pH da quattro a otto e massa da 15 a 150 kilodalton.Con l'analisi MALDI tof MS è stata identificata una media di una proteina per spot. Dove il maggior numero di proteine in ogni punto corrispondente è stato identificato con l'analisi LC-ESI-MS/MS. Questi dati dimostrano chiaramente che ogni spot di gel bidimensionale contiene molte proteine nel complesso proteoma del tessuto tumorale umano.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 32 ore per l'elettroforesi su gel bidimensionale se viene eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di seguire i passaggi, soprattutto secondo il protocollo. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la marcatura stabile per rispondere a ulteriori domande come la codifica delle proteine nel proteoma.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del mix proteico per esplorare su larga scala le modifiche post-traduzionali delle proteine a bassa abbondanza, la specializzazione delle proteine, la spazialità delle proteine e la proteina quattro in condizioni modello, pazienti e sistemi di organi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'elettroforesi su gel bidimensionale accoppiata con la spettrometria di massa, ottenendo un modello di elettroforesi su gel bidimensionale buono e riproducibile e identificando molte proteine in ogni punto. Non dimenticare che lavorare con l'acreomia SDS e la TEMED può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare guanti di plastica.

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In questo video, dimostriamo un metodo di elettroforesi su gel bidimensionale che separa singole proteine da una complessa miscela proteica ottenuta da tessuti tumorali di adenoma ipofisario umano non funzionale (NFPA). Le proteine vengono separate in base alla loro carica elettrica nella prima dimensione e ulteriormente separate in base ai pesi molecolari nella seconda dimensione.

Elettroforesi su gel di poliacrilammide bidimensionale: una tecnica di separazione per l'analisi delle proteine in una miscela proteica complessa basata sulla carica e sul peso molecolare

Fonte: Wulf, M., et.al. Protocollo basato su microdissezione laser per l'analisi LC-MS/MS del profilo proteomico di granuli di neuromelanina. J. Vis. Exp. (2021).Questo video mostra l'analisi di campioni di peptidi da granuli di neuromelanina (NMG) isolati da tessuto cerebrale umano post-mortem. I peptidi vengono prima separati mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) e quindi analizzati mediante spettrometria di massa per determinare i loro rapporti massa/carica (m/z). I...

Analisi LC-MS/MS del profilo proteomico di granuli di neuromelanina isolati da tessuto cerebrale umano

Un protocollo di estrazione proteina comune con tampone di urea / tiourea / SDS per il tessuto cerebrale umano e topi permette indentification delle proteine ​​da 2D-DIGE e la loro successiva caratterizzazione mediante mini 2DE immunoblotting. Questo metodo permette di ottenere risultati più riproducibili e affidabili da biopsie umane e modelli sperimentali.

Protein Consenso Brain-derived, estrazione protocollo per lo studio dei diritti dell&#39;uomo e murini Cervello Proteome Uso Sia 2D-DIGE e Mini 2DE Immunoblotting

Qui si descrive un protocollo che le coppie due tecniche di proteomica, cioè 2-dimensionale elettroforesi (2DE) e spettrometria di massa (MS), per identificare differenzialmente espressi / proteine ​​modificate post-traduzionali tra due o più gruppi di campioni elementari. Questo approccio, insieme a esperimenti funzionali, permette l'identificazione e la caratterizzazione di marcatori prognostici / bersagli terapeutici.

Da un 2DE-Gel Spot Proteine ​​Funzione: Lesson Learned From HS1 nella leucemia linfocitica cronica

Analisi approfondite dei proteomi delle cellule tumorali facilitano l'identificazione di nuovi bersagli farmacologici e biomarcatori diagnostici. Descriviamo un flusso di lavoro sperimentale per l'analisi quantitativa di (fosfo-)proteomi in sottopopolazioni di cellule tumorali derivate da tumori liquidi e solidi. Ciò si ottiene combinando le strategie di arricchimento cellulare con la spettrometria di massa quantitativa basata su Super-SILAC.

Mass quantitativa spettrometrica Profiling di proteomi cancro-cellulari derivate da liquido e tumori solidi

Questo protocollo descrive una procedura per estrarre e arricchire fosfopeptidi da linee cellulari di carcinoma della prostata o tessuti per un'analisi della phosphoproteome via basati sulla spettrometria di massa proteomica.

Fosfopeptide arricchimento accoppiata alla spettrometria di massa privo di etichetta quantitativa per indagare il Phosphoproteome nel carcinoma della prostata

Qui, stabiliamo un metodo proteomico basato sulla spettrometria di massa utilizzando regioni isolate di interesse in sezioni di tessuto fissate in formalina e incluse in paraffina. Questo protocollo viene utilizzato per analizzare il proteoma proveniente da specifiche aree tissutali in sezioni di tessuto archiviate fissate in formalina e incluse in paraffina.

Un approccio semplificato per la proteomica basata sulla spettrometria di massa utilizzando regioni tissutali selezionate

Questo protocollo ha preparato con successo tessuto neovascolare di alta qualità sufficiente da campioni di glioma utilizzando microdissezione a cattura laser per l'analisi proteomica quantitativa dell'angiogenesi tumorale, superando i limiti degli studi che tradizionalmente si concentrano principalmente sui fattori angiogeni e fornendo un profilo proteomico su larga scala dell'angiogenesi del glioma.

Preparazione di tessuti neovascolari da tessuti gliomatici umani per l'analisi proteomica quantitativa dell'angiogenesi tumorale

In questo articolo viene descritto un protocollo dettagliato per quantificare la lunghezza del telomere utilizzando un'analisi del frammento di restrizione terminale modificata che fornisce una misurazione diretta veloce ed efficiente della lunghezza del telomere. Questa tecnica può essere applicata a una varietà di fonti cellulari di DNA per quantificare la lunghezza del telomere.

Analisi di frammento di restrizione terminale modificata per quantificare la lunghezza di telomere utilizzando l&#39;ibridazione in gel

Un nuovo metodo di preparazione del campione è stato sviluppato per ospitare coculture delle cellule e del tessuto per rilevare cambio piccola molecola usando la spettrometria totale imaging.

Acquisizione di piccola molecola comunicazione tra tessuti e cellule mediante spettrometria di massa di Imaging

Scopri l'elettroforesi bidimensionale accoppiata con spettrometria di massa per analizzare il proteoma di adenoma ipofisario umano. Questo metodo consente l'identificazione di proteine a bassa abbondanza con alta sensibilità.

Elettroforesi bidimensionale accoppiata con spettrometria di massa per unanalisi del proteoma di tessuto umano Adenoma pituitario (Video) | JoVE Journal

Elettroforesi bidimensionale accoppiata con spettrometria di massa per un'analisi del proteoma di tessuto umano Adenoma pituitario

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