Un metodo efficiente In Vitro trasposizione da un sistema di bellezza dormire trascrizionalmente regolata confezionato in un vettore lentivirale difettoso di integrazione

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di ottenere un'integrazione stabile di un gene di interesse nel genoma umano delle cellule primarie da parte del sistema della Bella Addormentata regolato trascrizionalmente impacchettato in vettori lentivirali difettosi di integrazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della terapia genica come l'integrazione del gene di interesse nelle cellule primarie utilizzando il sistema della Bella Addormentata. I principali vantaggi di questa tecnica sono che il sistema inducibile della Bella Addormentata nel Sonno rilascia in modo efficiente cellule primarie resistenti a diversi metodi di trasfezione.

A dimostrare la procedura sarà Daniela Benati, post-doc nel mio laboratorio. Prima del giorno della trasduzione, i cheratinociti primari umani vengono coltivati come descritto nel protocollo di testo. Per staccare i cheratinociti subconfluenti in coltura, rimuovere il terreno, lavare le cellule con 1X PBS e aggiungere un millilitro di soluzione di lavoro di tripsina preriscaldata a ciascun pozzetto.

Incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti nell'incubatore per colture cellulari. Risospendere accuratamente le cellule di un pozzetto e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga contenente due millilitri di terreno contenente siero. Sciacquare il pozzetto una volta con tre millilitri di 1X PBS e aggiungere la soluzione risciacquata alla provetta da centrifuga con la sospensione cellulare.

Centrifugare a 580 volte g per cinque minuti ed eliminare il surnatante. Lavare le cellule con cinque millilitri di PBS 1X, centrifugare a 580 volte g per cinque minuti e scartare il surnatante. In una provetta di polipropilene da 15 millilitri, diluire 1,6 volte 10 al quinto cheratinociti in un millilitro di terreno CFAD.

Preparare una diluizione per ogni condizione. I tre vettori lentivirali difettosi di integrazione o IDLV sono stati preparati in precedenza come descritto nel protocollo di testo. IDLVTKSB traspone l'iperattivo SB100X regolato da TET.

IDLVrtTA codifica per il modulatore e IDLVT2 trasporta il gene di interesse. GFP in questo esempio affiancato da ripetizioni invertite del trasposone. Diluire i vettori lentivirali in un millilitro di terreno CFAD in presenza di 20 microlitri di polibrene come indicato in questa tabella.

Uno, due e tre sono controlli negativi senza vettori. Quattro e cinque contengono IDLVTKSB e IDLVrtTA. Sei, sette, otto e nove contengono tutti e tre i vettori lentivirali.

Trasdurre le cellule in sospensione aggiungendo ogni diluizione del vettore lentivirale alla corrispondente sospensione di cheratinociti. Rimuovere il terreno dalle cellule di alimentazione 3T3-J2 irradiate letalmente che si sono ritirate un giorno fa e placcare i cheratinociti trasdotti su di esse. Dopo aver trasduto un pozzo, si procede con quello successivo.

Incubare a 25 gradi per 30 minuti. Quindi trasferire le celle a 37 gradi per sei ore. Dopo sei ore, aggiungere un millilitro di terreno CFAD a ciascun pozzetto.

Aggiungere un micromolare di doxiciclina ai pozzetti cinque, otto e nove. Riportare le celle a 37 gradi Celsius. Successivamente, elaborare le celle in ciascun pozzetto come descritto nel protocollo di testo.

Per l'analisi citofluorimetrica, i cheratinociti primari trasdotti staccati al terzo e al sesto giorno devono essere discriminati dallo strato di alimentazione 3T3-J2 marcando le cellule con anticorpo anti-alimentatore coniugato APC monoclonale di topo. Preparare quattro millilitri di tampone di colorazione per ogni campione combinando 5% FBS, 500 millimolare EDTA e 1X PBS. Lavare le cellule staccate con un millilitro di tampone colorante.

Centrifugare a 580 volte g per cinque minuti ed eliminare il surnatante. In una provetta per l'acquisizione della citometria a flusso, risospendere cinque volte 10 alla quarta cellula in 100 microlitri di tampone di colorazione. Aggiungere due microlitri di anticorpo antifeeder a una diluizione da uno a 50 e mescolare bene.

Incubare su ghiaccio al buio per 30 minuti. Dopo 30 minuti, lavare con due millilitri di tampone colorante. Centrifugare a 580 volte g per cinque minuti.

Scartare il surnatante e risospendere in 200 microlitri di tampone colorante. Utilizzare un citometro a flusso configurato con un laser blu, un laser rosso e filtri per il rilevamento della fluorescenza GFP e APC per acquisire i segnali APC e GFP. La frazione cellulare GFP positiva della popolazione cellulare APC negativa indica cheratinociti trasdotti.

Per eseguire la PCR in tempo reale, impostare le reazioni in triplicato in una piastra a 96 pozzetti in un volume di reazione finale di 25 microlitri. Ogni reazione contiene un microlitro di cDNA, 12,5 microlitri di master mix 2X, 1,25 microlitri di primer in una miscela di sonde 20X e 10,25 microlitri di acqua sterile. Eseguire la PCR in tempo reale secondo questo programma PCR, un ciclo a 95 gradi Celsius per 10 minuti, quindi 40 cicli di 95 gradi Celsius per 15 secondi e 60 gradi Celsius per un minuto e mantenere a quattro gradi Celsius.

Infine, analizza i dati PCR in tempo reale come descritto nel protocollo di testo. L'analisi dell'espressione delle cellule HeLa trasdotte con dosi crescenti di trasposizioni in vettori modulatori più o meno doxiciclina ha mostrato che erano necessarie alte dosi di entrambi gli IDLV per indurre fortemente l'espressione di SB100X. L'analisi quantitativa dell'espressione di SB100X su cellule HeLa trasdotte con vettore trasposto in presenza o assenza del vettore modulatore ha rivelato un'attivazione di otto volte sul fondo in presenza di doxiciclina.

Il sistema della Bella Addormentata regolato trascrizionalmente può essere utilizzato anche nelle cellule primarie. L'espressione di SB100X sui cheratinociti trasdotti con trasposti e vettori modulatori ha mostrato un'attivazione di 15 volte nello stato off. L'esperimento di trasposizione eseguito su cheratinociti trasdotti con i tre vettori IDLV più o meno doxiciclina ha indicato che il 12% delle cellule trattate con doxiciclina ha integrato stabilmente almeno una copia di GFP nel loro genoma.

Una volta padroneggiata, la trasduzione vitale nelle cellule primarie può essere eseguita in otto ore, l'analisi citofluorimetrica in due ore e l'analisi dell'espressione in tre ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ottimizzare la combinazione di dosi del vettore utilizzato per trasdurre le cellule primarie e di raggiungere il livello di espressione più elevato della trasposta inducibile della Bella Addormentata. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la PCR quantitativa e la PCR mediata da linker per rispondere a domande aggiuntive come il numero di copie del trasposone per cellula e l'integrazione per l'archiviazione del genoma.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della terapia genica per esplorare l'applicazione del sistema della Bella Addormentata nell'ingegnerizzazione di cellule clinicamente rilevanti. Dopo aver visto il video, dovresti avere una buona comprensione di come trasdurre prima i cheratinociti primari con i vettori IDLV. In secondo luogo, misurare l'espressione delle trasposizioni iperattive in condizioni di doxiciclina e infine seguire la trasposizione mediante citometria a flusso.

Non dimenticare che lavorare con i vettori virali può essere estremamente pericoloso, quindi precauzioni come il BCL per contenere il livello e la scorta usa e getta dovrebbero essere sempre portate con te durante l'esecuzione di queste procedure.