Name: Che unisce la reticolazione chimica e spettrometria di massa dei complessi della proteina intatta per studiare larchitettura delle assemblee multi-unità secondaria della proteina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Scopri la reticolazione chimica e la spettrometria di massa nativa per studiare l'architettura dei complessi proteici multi-subunità. Questo metodo integrato fornisce informazioni strutturali complementari essenziali per la biologia strutturale.

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Ringraziamo i colleghi per utili discussioni. Ringraziamo anche Ilme Schlichting e Karl-Peter Hopfner per la fornitura di complessi proteici. Riconosciamo che il finanziamento dal Ministero federale per formazione e ricerca (BMBF, ZIK programma, 03Z22HN22), il Fondo europeo di sviluppo regionale (EFRE, ZS/2016/04/78115) e il MLU Halle-Wittenberg per C.S. e finanziamenti dal Wellcome Trust (109854/658 Z/15/Z) per A.P.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Sono disponibili protocolli per l'analisi strutturale basati sulla spettrometria di massa dei complessi multi-subunità della proteina. Le due tecniche, descritte nel protocollo, per lo più fornire risultati complementari e sono particolarmente adatte per acquisire conoscenze in dispositivi strutturali all'interno della proteina (-ligando) complessi che sono difficili da studiare mediante tecniche strutturali convenzionali. Spettrometria di massa nativa offre intuizioni stoichiometries proteina così come interazioni proteina analizzando subcomplexes e moduli di interazione stabile. Cross-linking, d'altra parte, produce informazioni sui siti di contatto diretti. A seconda il reticolante utilizzato, una certa flessibilità possa o deve essere inclusi nell'analisi.
I protocolli forniti sono in generale facile da eseguire e non richiede molto tempo. L'intero protocollo può essere eseguito entro una settimana e può essere applicato a quasi tutti i complessi della proteina, anche se una certa quantità di complesso proteico è necessaria per l'analisi di successo. Preparazione del campione è semplice e non richiede specificamente complessi della proteina purificata. Tuttavia, un problema comune è contaminazione del campione durante la preparazione dei campioni per l'identificazione di proteine basati sulla spettrometria di massa. Queste contaminazioni nella maggior parte dei casi includono le cheratine che provengono dalla polvere, dalla pelle o capelli. Di conseguenza, come ad esempio indossare guanti e camici da laboratorio, filtrazione amplificatori acquosi e l'utilizzo di solventi ad alta purezza dovrebbe prestare durante la preparazione dei campioni per l'identificazione di proteine basati sulla spettrometria di massa. Altre proteine contaminanti come chaperoni solitamente vengono introdotti durante la purificazione della proteina, per esempio, quando si utilizzano tag di affinità. In questi casi, purificazione della proteina dovrebbe essere migliorata, ad esempio aumentando i passaggi del lavaggio. In ogni caso, contaminazioni di proteina nel campione sono facilmente identificabili durante la ricerca nel database omettendo il filtro tassonomia (cioè, ricerca contro proteine da tutte le specie). Se solo si osservano alcuni peptidi (cioè, una copertura povera in proteine poteva essere ottenuta), anche se campione sufficiente è disponibile, potrebbe essere necessario utilizzare una proteinasi differente durante la digestione. In generale la tripsina produce un numero sufficiente di peptidi; Tuttavia, in alcuni casi ad esempio proteine di membrana o domini di membrana di proteine, viene ridotto il numero di siti di fenditura triptica e altri enzimi aminoacidi idrofobici di targeting sono una scelta migliore.
In termini di strumentazione, uno strumento particolarmente modificato è richiesto per spettrometria di massa nativa che mantiene le interazioni non-covalenti durante il trasferimento in fase gassosa. Sono stati introdotti diversi tipi di strumenti, compresi gli strumenti Q-ToF e orbitrap. Mentre modificati spettrometri di massa Q-ToF sono commercialmente disponibili per spettrometria di massa nativa da diversi anni, quest'ultimo solo di recente sono stati introdotti e nella maggior parte dei casi richiede modifiche specializzato45. Tuttavia, l'applicazione di strumenti ad alta definizione ha permesso di studiare il legame di ligandi più e loro quantificazione46,47 ed è promettente per applicazioni future.
Per identificare reticolato di-peptidi tramite spettrometria di massa ad accoppiamento cromatografia liquida, possono essere applicate le procedure standard con alcune modifiche. Tuttavia, la ricerca del database è il fattore limitante come software specializzato può raramente a che fare con database di grandi dimensioni e ridotto i database contenenti la subunità proteiche dei complessi sono obbligatori. Gli studi recenti usato massa spettrometria-spaccabili linkers targeting interazioni proteina intera cella lisati48,49. L'uso di linkers chimica che frammentano in esperimenti di spettrometria di massa tandem principalmente produce peptidi lineari (modificati dal reticolante), che possono essere identificati da un'ulteriore frammentazione e ricerca database di peptidi lineari e questo riduce tempo di ricerca e spazio di ricerca computazionale. Tuttavia, per eseguire questi esperimenti, un analizzatore di massa a trappola ionica o uno spettrometro di massa ibrido con una trappola ionica è necessario. In generale, come falsi positivi sono una questione importante, spettri di massa dei peptidi reticolati spesso vengono convalidati manualmente dalla qualità dei loro spettri di frammento che estende enormemente il tempo di analisi di dati. Lo sviluppo di robusti sistemi di punteggio che possono essere applicati senza ulteriori passaggi di convalida sono pertanto possibili applicazioni future. Un modo per migliorare l'analisi dei dati e per ridurre il numero di falsi positivi è stata l'introduzione di calcoli di tasso di falsi scoperta e la loro applicazione al cross-linking di insiemi di dati50.
In generale, le tecniche qui descritte possono essere integrate con ulteriori tecniche di spettrometria di massa (ad es., etichettatura covalente) per aumentare l'output di analisi. Altre modifiche e miglioramenti dei protocolli possono essere facilmente implementati. Come tale comparativo cross-linking34 si dipana cambiamenti conformazionali nell'assembly della proteina. Ulteriori sviluppi nella spettrometria di massa nativo oggi permettono l'analisi delle proteine della membrana51,52 e loro interazioni con i lipidi28,52,53,54 . Nuovi sviluppi di spettrometri di massa ad alta risoluzione per nativo spettrometria di massa hanno esteso l'applicazione e grippaggio del ligand, ad es., associazione dei lipidi alle proteine della membrana, ora possono essere inclusi nella analisi45, 46. in combinazione con approcci di modellazione computazionale, queste tecniche possono fornire modelli strutturali di diversa risoluzione55. Se nessuna struttura di cristallo è disponibile per le subunità di complesse o singole intatte, spettrometria di massa è in grado di fornire approfondimenti prime di interazioni della proteina e la topologia del complesso sconosciuto. A seconda delle tecniche utilizzate e i risultati ottenuti, modelli a bassa risoluzione del complesso sconosciuto possono essere ottenuti56,57,58. Se sono disponibili strutture cristalline o modelli di omologia, le informazioni strutturali ricevute dalla spettrometria di massa possono produrre anche quasi nativa modelli59.
Rispetto ad altre tecniche strutturali, spettrometria di massa ha il vantaggio che esso richiede una quantità di campione basso, si può trattare con campioni eterogenei ed è applicabile ai complessi della proteina di dimensioni illimitate. Inoltre, spettrometria di massa permette l'indagine di sistemi proteici dinamico. Diverse popolazioni della proteina o proteina complessa che esistono in soluzione solitamente vengono analizzati insieme e di conseguenza, a differenza con altre tecniche strutturali che richiedono la selezione di alcune popolazioni, tutte le conformazioni vengono mantenute durante analisi e sono valutabile in un esperimento. Approcci quantitativi di cross-linking sono stati recentemente introdotti34,60,61 e sono promettenti per applicazioni future che descrivono cambiamenti conformazionali in condizioni diverse.

L'indagine strutturale degli assembly di proteina è diventato particolarmente importante per la comprensione dei processi cellulari. Di conseguenza, molti, tecniche sviluppate e migliorate in biologia strutturale1. Tuttavia, queste tecniche a volte sono limitate nella loro applicazione a causa della dimensione, flessibilità o eterogeneità dei complessi della proteina in esame. Spettrometria di massa può affrontare queste sfide e, di conseguenza, è emerso come un potente strumento in biologia strutturale2,3,4,5. Il grande vantaggio di spettrometria di massa, tuttavia, è la capacità di identificare inequivocabilmente proteine anche in miscele complesse ed eterogenee6. A tal fine, proteine solitamente vengono digerite con endoproteinases e la miscela peptidica risultante è separata mediante cromatografia liquida ed eluita direttamente nello spettrometro di massa. Le masse del peptide sono successivamente determinate e ioni precursori sono stati selezionati per ulteriore frammentazione dei peptidi. Le proteine sono quindi identificate di ricerca peptide e corrispondente frammento masse contro un database conosciuto. Questa procedura consente non solo l'identificazione di peptidi e proteine, ma anche loro modificazioni post-traduzionali che causano uno spostamento di massa di peptidi precursori e gli ioni frammento che trasportano la modifica7. Alcune delle molte tecniche di spettrometria di massa strutturale si basano su questo principio4,8. Per esempio, etichettatura tecniche quali idrogeno deuterio cambio9,10, chimica d'etichettatura strategie11,12, o radicale ossidrile piede stampa13,14 , dare spunti l'accessibilità superficiale delle proteine in determinate condizioni.
Un'altra tecnica è (chimica), cross-linking che coinvolge il legame covalente di aminoacidi in prossimità attraverso loro gruppi funzionali. Per questo, reagenti chimici, UV-activatable reagenti o gli aminoacidi sono impiegati15,16. Dopo cross-linking, le proteine sono solitamente idrolizzate con le proteasi e reticolato di-peptidi sono analizzati mediante spettrometria di massa accoppiata di cromatografia liquida. L'identificazione dei prodotti cross-linking di database di ricerca, tuttavia, richiede l'uso di software specializzato che concatenare sequenze peptidiche di varie proteine e regioni più disparate17,18,19. L'uso di linkers chimica ha il vantaggio che può essere impiegato per quasi ogni complesso di proteine di interesse e non richiede l'incorporazione di UV-activatable amino acidi, che può essere raggiunto solo quando esprimenti la proteina di interesse in cellule ospiti. Come tale, cross-linking è uno strumento versatile ed è stato impiegato con successo in molti studi strutturali di proteine anche grandi assemblee20.
Spettrometria di massa di complessi di proteine intatte (a volte chiamato "nativa" spettrometria di massa), d'altra parte, comporta l'analisi di proteine intatte e complessi proteici senza idrolisi in peptidi. Esso rivela la composizione, eterogeneità, stechiometria, topologia e interazioni di subunità della proteina complessi21,22. In combinazione con mobilità dello ione, spettrometria di massa nativa ulteriormente consente la determinazione del loro conformazione23,24. Questo lo rende un potente strumento per l'indagine strutturale dei complessi della proteina che sono difficili da valutare mediante tecniche strutturali convenzionali. Tuttavia, spettrometria di massa nativa richiede buffer di analisi che mantenere interazioni non-covalenti proteina durante la ionizzazione electrospray. Normalmente ciò viene ottenuto utilizzando tamponi acquosi, volatili come ammonio acetato25. Inoltre, strumento modifiche sono necessarie per impedire la dissociazione durante la trasmissione in fase gassosa di spettrometro di massa26. Applicato in questo modo, molti complessi proteici (grande) sono stati analizzati. Gli esempi impressionanti sono gli studi di ribosomi intatto27, ATP sintasi28o virus29.
La combinazione di spettrometria di massa nativa e cross-linking si è rivelata particolarmente riuscita negli studi precedenti. Per esempio, il stoichiometries dei complessi di chaperone, tra cui un dimero di Hsp70 imprevisto, potrebbe essere ottenuta da esperimenti di spettrometria di massa dei complessi della proteina intatta, mentre la reticolazione chimica ha rivelato il regime delle proteine nella gli assembly30,31. In uno studio differente, sono stati studiati gli effetti delle modificazioni post-traduzionali su un intatto trifosfato di adenosina synthase complesso. Spettrometria di massa nativa fornito le comprensioni nella stabilità del complesso della proteina in presenza o assenza di fosforilazione o acetilazione32,33. Un comparativo cross-linking strategia34 poi rivelato cambiamenti conformazionali della proteina complessa nelle diverse condizioni.
Qui, forniamo i protocolli per l'identificazione di proteine di spettrometria di massa, cross-linking (chimica) e spettrometria di massa nativa, tra cui l'analisi dei dati e interpretazione (Figura 1). La combinazione di risultati complementari ottenuti da questi metodi con l'aiuto di due complessi di proteine ben caratterizzati è dimostrata35. Il nostro protocollo può essere applicato a qualsiasi assembly di proteina che può essere purificato a certa purezza e concentrazione. L'approccio è in alcuni casi limitati dalla analisi dei dati di cross-linking dei dati, vale a dire, la dimensione del database impiegato, che determina la necessaria ricerca spazio e nel tempo. Inoltre, convalida manuale di legami incrociati identificati è richiesto spesso e riduce ulteriormente l'output. Spettrometria di massa nativa è limitata principalmente dalla qualità del campione, per esempio, buffer e addotti utilizzato durante la purificazione e la possibilità di scambiarli da tamponi acquosi e volatili. Tuttavia, complessi proteici purificati per l'analisi strutturale di solito hanno la qualità richiesta per l'analisi di successo con i nostri protocolli.

<table><tbody><tr><td><forte>Sostanze chimiche, Reagenti, Materiali di consumo</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-[4-(2-idrossietil)piperazin-1-il]etanosolfonico acido (HEPES)</td><td>Tampone Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td>pH</td></tr><tr><td>Acetonitrile Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A955-1</td><td>solvente</td></tr><tr><td>Amicon Ultra centrifugo dispositivi (MWCO diversi)</td><td>Millipore</td><td>cioè scambio di</td><td>tampone UFC500396, concentrazione</td></tr><tr><td>Soluzione di acetato di ammonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2706</td><td>nativo MS</td></tr><tr><td>Bicarbonato di ammonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9830</td><td>digestione in gel</td></tr><tr><td>Soluzione di ammonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9859</td><td>pH</td></tr><tr><td>Bis(Sulfosuccinimidyl)suberato-d0 (BS3-d0)</td><td>Thermo Scientific</td><td>21590</td><td>reticolante</td></tr><tr><td>Bis(Sulfosuccinimidyl)suberato-d4 (BS3-d4)</td><td>Thermo Scientific</td><td>21595</td><td>reticolante</td></tr><tr><td>Ioduro di cesio</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>203033 calibrazione</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5670</td><td>digestione in-gel</td></tr><tr><td>Capillari (1,0 OD &volte; 0,78 ID &volte; 100 L mm)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0038</td><td>nativo MS</td></tr><tr><td>Disuccinimidil suberato (DSS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>21655</td><td>reticolante</td></tr><tr><td>DL-Ditiotreitolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5545</td><td>digestione in-gel</td></tr><tr><td>DMSO (dimetilsolfossido)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td>solvente</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Fisher Chemicals</td><td>BP2818</td><td>solvente</td></tr><tr><td>Acido formico Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A117-50</td><td>integratore di solventi</td></tr><tr><td>Instant Blue Coomassie soluzione colorante</td><td>expedeon</td><td>ISB1L</td><td>soluzione colorante per elettroforesi su gel</td></tr><tr><td>Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel (1 mm, 10 pozzetti)</td><td>life technologies</td><td>NP0323BOX</td><td>elettroforesi su gel</td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td>Digestione in gel</td></tr><tr><td>Alcool isopropilico, grado HPLC</td><td>Fisher Chemicals</td><td>P750717</td><td>solvente</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A456-212</td><td>solvente</td></tr><tr><td>Micro BioSpin 6 colonne</td><td>BioRad</td><td>732-6222</td><td>scambio di tampone</td></tr><tr><td>NuPAGE Antiossidante</td><td>invitrogeno</td><td>NP0005</td><td>tampone di corsa, elettroforesi su gel</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4 &times;)</td><td>invitrogen</td><td>NP0007</td><td>tampone di caricamento del campione (non riducente) per elettroforesi su gel</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Tecnologie di durata del tampone in esecuzione</td><td></td><td>NP0001</td><td>elettroforesi su gel</td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Tecnologie di durata del tampone in esecuzione</td><td></td><td>NP0001</td><td>Elettroforesi su gel</td></tr><tr><td>NuPAGE Agente riducente del campione (10 &times;)</td><td>invitrogen</td><td>NP0004</td><td>Agente riducente per elettroforesi su gel</td></tr><tr><td>PBS - soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td>tampone</td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 Prestained Standard Protein Marker</td><td>invitrogen</td><td>LC5925</td><td>prestained Protein Marker per elettroforesi su gel</td></tr><tr><td>Acetato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td>precipitazione di etanolo</td></tr><tr><td>Tris(idrossimetil)aminometano (Tris)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>tampone 252859</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TRYPSEQ-RO (11418475001)</td><td>digestione in gel</td></tr><tr><td>Dispositivi centrifughi Vivaspin (diversi MWCO)</td><td>Sartorius</td><td>i.e. VS0101</td><td>scambio tampone, concentrazione</td></tr><tr><td>Acqua per HPLC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270733-2.5L-M</td><td>solvente</td></tr><tr><td><forte>Nome</forte></td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga Heraeus Fresco 21, centrifuga da banco</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002425</td><td></td></tr><tr><td>Flaming / Brown Micropipette estrattore Modello P-1000</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Camera per gelelettroforesi Xcell SureLock MiniCell</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Gold Coater Quorum Q150R S</td><td>Quorum Technologies Ltd.</td><td>Q150RS</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore per gel orizzontale Rotamax 120 T</td><td>Heidolph Instruments</td><td>544-41200-00</td><td></td></tr><tr><td>Q-TOF Spettrometro di massa Ultima, MS Vision Colonna</td><td></td> analitica C18 in fase inversa <td>Waters (Micromass)</td><td></td></tr> <tr><td>Acclaim PepMap (C18, diametro interno 75 mm, 50 cm, dimensione dei pori 3 mm)</td><td>Thermo Scientific</td><td>164570</td><td></td></tr><tr><td>pre-colonna C18 a fase inversa (C18, diametro interno 150 mm, 2 cm, dimensione dei pori 5 mm)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td> bisturi 164213 <td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientifc</td><td>10463989</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga sottovuoto SpeedVac SPD121P</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD121DP-230</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette AA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z680184-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Pulitore ad ultrasuoni USC-TH, bagno di sonicazione</td><td>VWR</td><td>142-0084</td><td></td></tr><tr><td>Sistema nano-LC UltiMate Dionex 3000, accoppiato allo spettrometro di massa ibrido Q-Exactive plus (sorgente nano-ESI)</td><td>Thermo Scientific</td><td>0726030+</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software, Strumenti software, Ricerca nel database</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mascotte</td><td>www.matrixscience.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Massign</td><td>http://massign.chem.ox.ac.uk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MassLynx</td><td>Micromass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MassMatrix</td><td>Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>Cox, J. Nat. Biotechn. 26 (2008)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLink</td><td>Yang, B. Nat Methods 9 (2012)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pXtract strumento di conversione</td><td>http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UniDec</td><td>Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XCalibur</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XiNET</td><td>http://crosslinkviewer.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XLinkX</td><td>Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>xQuest</td><td>Rinner, O. Nat Methods 5 (2008)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xvis</td><td>https://xvis.genzentrum.lmu.de</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

che unisce la reticolazione chimica e spettrometria di massa dei complessi della proteina intatta per studiare l'architettura delle assemblee multi-unità secondaria della proteina

Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies

Le proteine interagiscono con i loro ligandi agli assembly attiva e dinamica della forma che svolgono varie funzioni cellulari. Delucidamento queste interazioni è quindi fondamentale per la comprensione dei processi cellulari. Tuttavia, molti complessi proteici sono assembly dinamici e non sono accessibili mediante tecniche strutturali convenzionali. Spettrometria di massa contribuisce all'indagine strutturale di queste assemblee, e in particolare la combinazione di varie tecniche di spettrometrihe di massa fornisce informazioni preziose nella loro disposizione strutturale.
In questo articolo, descriviamo l'applicazione e la combinazione di due tecniche complementari di spettrometrihe di massa, vale a dire reticolazione chimica accoppiato con spettrometria di massa e spettrometria di massa nativa. Cross-linking chimico coinvolge il legame covalente di aminoacidi nelle immediate vicinanze utilizzando reagenti chimici. Dopo digestione con le proteasi, reticolato di-peptidi sono identificati mediante spettrometria di massa e siti di interazioni di proteine sono scoperti. Spettrometria di massa nativa è d'altra parte l'analisi degli assiemi di proteine intatte in fase gassosa di uno spettrometro di massa. Esso rivela stoichiometries proteina così come interazioni proteina e ligando. Entrambe le tecniche pertanto forniscono informazioni complementari sulla struttura della proteina-ligando assembly e loro combinazione si è rivelata potente negli studi precedenti.

L'analisi strutturale di proteine e complessi che formano è fondamentale per capire la loro funzione. Spettrometria di massa contribuisce notevolmente all'indagine strutturale in quanto può essere applicato a quasi ogni complesso di interesse indipendentemente dalle dimensioni o eterogeneità di esempio. Abbiamo esemplificano il protocollo utilizzando due complessi della proteina ben caratterizzati; in primo luogo, l'etero-dodecamer RvB1/B2 da c. Chloracidobacterium e secondo, il CPS di etero-octamerici complesso da e. coli.
In primo luogo, abbiamo identificato le componenti proteiche dei due complessi. Per questo, le proteine sono state separate da SDS-PAGE (Figura 2) e bande di gel sono stati tagliati dal gel. Dopo digestione in-gel delle proteine, la miscela peptidica è stata analizzata tramite spettrometria di massa accoppiata di cromatografia a fase mobile liquida e masse di frammento e del peptide sono stati sottoposti a ricerca database. Seguendo questo flusso di lavoro, abbiamo identificato tutte le subunità proteiche dei due complessi con confidenza elevata, vale a dire, un numero elevato di peptidi con punteggi di peptide ragionevole è stato osservato producendo copertura alta sequenza per tutte le unità secondarie della proteina (tabella 1 ).
Quindi abbiamo analizzato l'intatta RvB1/B2 complesso mediante spettrometria di massa nativa (Figura 3A). Lo spettro di massa ha rivelato due specie, uno di circa 8.000 m/z e un'altra specie a circa 11.000-12.000 m/z. Le masse calcolate per queste specie corrispondono all'anello di3 di3(RvB2) di esamerica (RvB1) (circa 310 kDa) e il dodecameric del doppio-anello (RvB1)6(RvB2)6 (circa 620 kDa). Entrambe le serie di picco Visualizza due popolazioni; questi provengono da una miscela di His-tag e senza tag subunità RvB2 nei complessi. Una struttura di cristallo per il complesso RvB1/B2 è stata ottenuta in precedenza36 e Mostra la disposizione del doppio-anello (Figura 3B). Lo spettro di massa nativo conferma dunque la stechiometria della dodecamer intatto e rivela inoltre un sub complesso stabile. Inoltre, co-esistenti popolazioni sono identificati.
Per identificare i siti di interazione di proteine nel complesso RvB1/B2, abbiamo reticolato chimicamente il complesso purificato con cross-linker BS3. Abbiamo titolato in primo luogo la quantità di BS3 durante la reazione di reticolazione per determinare la concentrazione ottima. BS3 è ammina specifico e covalentemente catene laterali di collegamenti lisina così come la N-termini di proteine. La reazione di reticolazione è stata seguita da SDS-PAGE (Figura 2A). Il complesso non-cross-linked ha mostrato subunità sia RvB1 e RvB2. Aggiunta di BS3 alla miscela di reazione causata covalente di proteine con conseguente fasce della proteina con peso molecolare più elevato. Il gel di SDS dimostra che una quantità crescente di BS3 produrre una maggiore quantità di specie con collegamenti incrociati mentre subunità proteiche non-cross-linked sono ridotti. Abbiamo quindi tagliare le bande di proteine dal gel e seguito il protocollo fornito sopra per identificare i siti di interazione della proteina. Un esempio di spettro di un reticolato di-peptide è mostrato (Figura 3). Lo spettro Mostra serie y-ione di entrambi i peptidi confermando questa interazione di proteine. In totale, abbiamo ottenuto 14 interazioni di proteine, tra cui quattro legami incrociati tra subunità RvB1 e RvB2 e due legami incrociati tra due copie di RvB2 (tabella 2). I risultati da BS3 cross-linking sono visualizzati in una rete di interazione (Figura 3D) che mostrano interazioni intra-molecolari come interazioni tra differenti subunità proteiche. Legami incrociati intra-molecolari suggeriscono che sia RvB1 che RvB2 subunità piegare in modo che i domini N - e C-terminale sono nelle immediate vicinanze. Nota, che interazioni intra-molecolari non sono distinguibili dalle interazioni inter-molecolari della stessa subunità in questo caso. Inter-molecolari legami incrociati tra le due subunità sono stati anche osservati. Di questi, due inter-molecolari legami incrociati fra RvB1 e RvB2 potrebbero essere visualizzate nella struttura convalida l'approccio cross-linking. L'altri legami inter-molecolari incrociati si trovano nei cicli flessibili che non sono inclusi nella struttura di cristallo. Inoltre abbiamo identificato due legami incrociati in RvB2 contenente le stesse sequenze di peptide. Questi legami incrociati senza ambiguità possono essere classificati come inter-molecolari come essi devono provenire da due copie della stessa proteina (Figura 3D). I nostri esperimenti di cross-linking rivelano siti di interazione di proteine all'interno del complesso, ma anche all'interno la subunità proteiche fornendo intuizioni nella loro disposizione strutturale che potrebbe essere confermata anche con la struttura esistente di cristallo (Figura 3B).
Il secondo complesso di proteine che abbiamo studiato è stato CPS. Lo spettro di massa nativo (Figura 4A) ha rivelato tre complessi proteici tra 6.000 e 12.000 m/z. Il più grande complesso di 640 kDa corrisponde all'etero-istonico intatto. I più piccoli complessi rappresentano due sub-complessi; il dimero delle piccole e grandi unità secondarie CPS (160 kDa) e un etero-tetramero contenente due copie di ogni subunità (320 kDa). Questi sub-complessi forniscono intuizioni prime Assemblea della proteina; cioè, le subunità di grandi e piccole sono in contatto diretto (come rivelato da etero-dimero) e il tetramero potrebbe essere un prodotto di due dimeri. Per ottenere ulteriori informazioni sulla disposizione strutturale nella CPS intatti complessi, abbiamo effettuato la spettrometria di massa tandem (MS/MS) di etero-istonico ed etero-tetramero. In entrambi i casi, la piccola unità secondaria dissociato dal precursore, suggerendo che la piccola unità secondaria si trova nella periferia dell'Assemblea (Figura 4B). Infatti, la piccola unità secondaria è periferica in cristallo disponibile struttura (Figura 4)44.
Cross-linking chimico utilizzando il reticolante BS3 inoltre è stata effettuata. Utilizzando quantità crescenti, il legame covalente delle subunità CPS è stato migliorato. Dopo la digestione delle proteine e l'analisi dei peptidi come descritto in precedenza, molte interazioni della proteina all'interno la grande unità secondaria e un legame incrociato la subunità sono stati ottenuti (tabella 2). Inoltre, simili alla RvB1/B2 complesso, abbiamo trovato due inter-molecolari legami incrociati tra due copie della subunità grande CPS. Questi legami incrociati posizionare le due subunità grande vicenda di fronte ai loro lati C-terminale. In uno studio precedente, che unisce la spettrometria di massa strutturale e modellazione computazionale35, abbiamo identificato tre ulteriori interazioni nella grande unità secondaria che molto probabilmente provengono dall'interfaccia di due copie della subunità grande convalidato da la struttura di cristallo e il modello ottenuto (Figura 4 e tabella 2). Queste interazioni consentono la disposizione del nucleo CPS complesso composto da quattro subunità grande. Tuttavia, nessun Inter-subunità legami incrociati tra le piccole e le grandi unità secondarie sono stati osservati. Esaminando la struttura di cristallo disponibile (Figura 4), diventa evidente che la superficie di interazione tra il nucleo tetramerica del complesso, costituito dalla grande unità secondaria e le subunità piccole periferiche è molto piccola, che potrebbe spiegare l'assenza di interazioni inter-unità secondaria. Ciò è confermato dalla nativa spettrometria di massa che ha mostrato che la piccola unità secondaria si dissocia prontamente dai complessi intatti molto probabilmente a causa di un'interfaccia di piccola associazione. Comunque, interazioni della proteina nella CPS complesso combinata da cross-linking chimico e nativa spettrometria di massa permettono di dedurre la loro disposizione strutturale (Figura 4).
Presi insieme, la combinazione di spettrometria di massa nativa e cross-linking chimico accoppiato con spettrometria di massa identificazione di peptidi con collegamenti incrociati, permette la ricostituzione della disposizione strutturale degli entrambi i complessi di esempio. Mentre reticolazione chimica rivelato disposizione delle subunità della proteina, per esempio le interazioni tra RvB1 e RvB2 o all'interno del nucleo tetramerica della CPS, spettrometria di massa nativa consegnato stoichiometries proteina dei complessi intatti e subcomplexes prevalente. Nel caso di CPS, per i quali ha potuto essere osservati nessun interazioni intermolecolari tra le due subunità di reticolazione chimica, spettrometria di massa nativa suggerisce che ogni subunità interagisce con una subunità piccola (Figura 4). Spettrometria di massa tandem proposto la posizione periferica della subunità piccola nel complesso e una piccola interfaccia tra entrambe le subunità.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig1.jpg"> Figura 1: flusso di lavoro di spettrometria di massa nativa e cross-linking. Entrambe le tecniche offrono risultati complementari. Mentre stoichiometries e moduli di interazione rivela nativa spettrometria di massa, cross-linking fornisce i siti di interazione della proteina all'interno di complessi. Si noti che solo la reticolazione chimica rivela interazioni binarie. (A) il primo passo nella spettrometria di massa nativo è scambio di buffer a un buffer di volatile e acquoso utilizzando unità di filtraggio o gel filtrazione colonne. Spettrometria di massa dei complessi proteici intatto poi rivela loro stechiometria. Negli esperimenti di spettrometria di massa tandem, subunità periferiche sono dissociate. (B) per la reticolazione chimica, il complesso proteico viene incubato con un reagente di cross-linking. Le proteine cross-linked sono poi digerite in peptidi che sono successivamente analizzati mediante spettrometria di massa liquida cromatografia accoppiata. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig2.jpg"> Figura 2: SDS-PAGE di reticolato complessi RvB1/B2 (A) e CPS (B). (A) 2,5 µM RvB1/B2 sono stati caricati per gel di corsia. La concentrazione di BS3 era varia. Non-cross-linked RvB1/B2 Mostra le due subunità a circa 50 kDa. Aggiunta di BS3 causato covalente delle subunità della proteina risultante in fasce della proteina con peso molecolare più elevato. La quantità di specie reticolato è aumentata con le più alte concentrazioni BS3. Condizioni ottimali di cross-linking sono evidenziate (in rosso). (B), 10 µM CPS sono stati caricati per gel di corsia. Il grande (90 kDa) e piccolo (40 kDa) subunità CPS sono ottenute. Aggiunta di BS3 causato covalente delle subunità della proteina risultante in fasce della proteina con peso molecolare più elevato. Condizioni ottimali di cross-linking sono evidenziate (in rosso). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig3.jpg"> Figura 3: spettrometria di massa nativa e reticolazione chimica di RvB1/B2 complesso. (A), lo spettro di massa nativo rivela due specie di RvB1/B2; il dodecamer intatto (cioè, (RvB1)6(RvB2)6) a circa 11.000 a 12.000 m/z e l'esamerica anello (RvB1)3(RvB2)3 a circa 8.000 m/z. Entrambe le specie mostrano due popolazioni derivanti dalla sua etichetta e senza tag RvB2. Lo spettro è stato modificato da35. Struttura (B), il cristallo di RvB1/B2 è mostrata (PDB ID 4WVY). RvB1 e RvB2 alternati subunità formano due anelli di esamerica. (C) spettro di frammentazione di un reticolato di-peptide. N-terminale di RvB1 era reticolato con K23 di RvB1. serie y-dello ione sono stati ottenuti per entrambi i peptidi (rosso e ciano). (D) Intra - e inter - protein interazioni ottenute nel complesso RvB1/B2. Intra-cross-link sono mostrati in rosso, inter-cross-links sono mostrati in blu. L'inserto mostra due inter-molecolari legami incrociati tra subunità RvB1 e RvB2, che potrebbe essere visualizzata nella struttura di cristallo (verde, inserto). Interazioni che provengono da due copie di RvB2 vengono visualizzati come linee tratteggiate blu. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig4.jpg"> Figura 4: nativa spettrometria di massa e la reticolazione chimica di CPS. (A), lo spettro di massa nativo di CPS spettacoli tre complessi. L'etero-dimero (160 kDa), etero-tetramero (320 kDa) e l'etero-istonico (640 kDa). Lo spettro è stato modificato da35. (B) spettrometria totale in Tandem della tetramerica e octamerici CPS complesso rivelata dissociazione della subunità piccola CPS. (C), il cristallo struttura del CPS è mostrata (PDB ID 1BXR). Le subunità grande formano un nucleo tetramerica e le subunità piccole si trovano nella periferia del complesso. Legami inter-molecolari incrociati tra due copie della subunità grande sono mostrati (verde). (D) interazioni delle grandi e piccole subunità CPS. Spettrometria di massa nativa ha rivelato subcomplexes e suggerisce una posizione periferica della subunità piccola. Legami incrociati chimici indicano nel nucleo tetramerica di CPS. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Risultati ricerca Database. Le proteine sono state identificate dalla spettrometria di massa accoppiata di cromatografia a fase mobile liquida e ricerca database. I nomi di proteina, descrizione e numero, nonché di proteine di adesione massa sono date. Il Punteggio di proteina, numero degli spettri osservati per proteina e il numero di sequenze peptidiche osservati sono elencati. I cinque peptidi con punteggi più alti di peptidi mascotte sono elencati per ogni unità secondaria della proteina. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/Table1.xlsx">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Tabella 2: legami incrociati osservati nel RvB1/B2 e CPS. Le subunità dei complessi e i residui di reticolato sono date. Il tipo di legame incrociato (intra - o inter-molecolari) è stato rivelato da sequenze peptidiche sovrapposte o un precedente studio35. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/Table2.xlsx">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

L'architettura dei complessi della proteina è essenziale per la loro funzione. Combinando varie tecniche di spettrometrihe di massa ha dimostrato potente per studiare il loro assemblaggio. Forniamo i protocolli per reticolazione chimica e spettrometria di massa nativa e mostrare come queste tecniche complementari consentono a delucidare l'architettura delle assemblee multi-unità secondaria della proteina.

Che unisce la reticolazione chimica e spettrometria di massa dei complessi della proteina intatta per studiare l'architettura delle assemblee multi-unità secondaria della proteina

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is ...

L'obiettivo generale della combinazione del cross-linking con la spettrometria di massa nativa è quello di ottenere informazioni strutturali complementari su assemblaggi proteici multi-subunità che aiutino a chiarire la loro disposizione tridimensionale. La reticolazione chimica e la spettrometria di massa nativa aiutano a rispondere a domande chiave della biologia strutturale come la composizione, la connettività e la stechiometria. Il vantaggio principale della combinazione di più tecniche è che si ottengono informazioni complementari che non sono disponibili con una sola tecnica.Il nostro flusso di lavoro può essere applicato a qualsiasi altro complesso proteico. Può essere purificato da sali o tessuti o può essere ricostituito da proteine purificate. Innanzitutto, applicare 7,5 microlitri di tampone semplice quadruplo e tre microlitri di agente riducente 10 volte al complesso proteico desiderato.Far girare il campione per un minuto a 16, 200 volte la gravità. Dopo la centrifugazione, riscaldare il campione per 10 minuti a 70 gradi Celsius. Preparare un gel con gradiente dal 4 al 12% per l'elettroforesi e posizionare il gel nella camera di elettroforesi.Diluire il tampone di corsa precedentemente preparato 20 volte con acqua e riempire la camera di elettroforesi. Quindi, aggiungere 0,5 millilitri di antiossigeno nella camera interna. Caricare un marcatore proteico adatto nella prima cavità del gel e i campioni di proteine nelle cavità rimanenti.Quindi, separare le proteine per il tempo appropriato a 200 volt. Per colorare le bande proteiche, trasferire il gel in una scatola colorante e coprire il gel con una soluzione in piedi Coomassie a base acquosa. Incubare il gel per una notte a temperatura ambiente su un agitatore orizzontale.Il giorno seguente, decolorare il gel sostituendo la soluzione colorante con acqua. Ripeti il passaggio precedente circa da tre a cinque volte fino a quando lo sfondo del gel appare chiaro. Ora, taglia le bande proteiche che vengono visualizzate dalla colorazione blu di Coomassie dai gel usando un bisturi.Tagliare con cura le bande proteiche in piccoli pezzi di circa uno per un millilitro. Quindi, lavare le bande proteiche con acqua e acetonitrile. Ridurre i legami disolfuro con DTT, quindi alchilare i residui di cisteina con iodoacetammide.Successivamente, digerire le proteine con la tripsina come descritto nel protocollo di testo. Per estrarre i peptidi, incubare i pezzi di gel con bicarbonato di ammonio e acetonitrile e raccogliere il surnatante contenente peptidi. Successivamente, incubare i pezzi di gel con acido formico al 5% e acetonitrile e raccogliere il surnatante contenente peptidi.Dopo aver raccolto il surnatante contenente peptidi, combinare entrambi i surnatanti ed essiccare i peptidi estratti facendo evaporare i solventi in una centrifuga a vuoto. Una volta che i peptidi sono asciutti, mescolarli con 20 microlitri di soluzione di acetonitrile al 2% e acido formico allo 0,1%. Sciogliere i peptidi con un bagno sonicante per due o tre minuti.Quindi, centrifugare il campione in una centrifuga a 16, 200 volte la gravità per 30 minuti. Dopo aver trasferito il campione in una fiala dell'autocampionatore, iniettare cinque microlitri in un sistema nano LC-MS/MS e caricare la miscela di peptidi su una precolonna C18 a fase inversa per desalinizzare e concentrare i peptidi online. Rimuovere il buffer di stoccaggio da una colonna di centrifugazione ad esclusione dimensionale mediante centrifugazione a 1.000 volte la gravità e quattro gradi Celsius per un minuto.Dopo aver scartato il flusso continuo, lavare la colonna tre volte aggiungendo 500 microlitri di acetato di ammonio da 200 millimolari seguito da centrifugazione. Dopo la centrifugazione, caricare 20 microlitri del campione proteico sulla colonna e centrifugare a 1.000 volte la gravità e quattro gradi Celsius per quattro minuti. Ora, posizionare un capillare rivestito d'oro precedentemente preparato in un supporto per capillare.Aprire la punta di un ago e riempire il capillare con uno o quattro microlitri di campione proteico. Collegare il supporto capillare con la sorgente nano electrospray dello spettrometro di massa e posizionare la punta del capillare a una distanza compresa tra 0,5 e 1,5 centimetri rispetto all'orifizio del cono. Utilizzare da 80 a 150 litri all'ora di gas nanoflow per avviare lo spruzzo e regolare il flusso di gas per mantenere uno spruzzo stabile.Regolare i parametri e la pagina di sintonizzazione dello strumento Q-TOF. Quindi, avvia l'acquisizione facendo clic sul pulsante Acquisisci e combina il maggior numero possibile di scansioni per ottenere un buon spettro di massa. Sciogliere 1,43 milligrammi di BS3 e 100 microlitri di acqua per preparare una soluzione madre da 25 millimolari.Quindi, aggiungi BS3 al complesso proteico. Utilizzare quantità variabili di BS3 per identificare la concentrazione ottimale di reticolante. Incubare le miscele di reazione a 25 gradi Celsius per un'ora in un termomiscelatore.Ora, esegui la pagina SDS delle proteine reticolate con un gel a gradiente dal 4 al 12%. Tagliare le bande di gel e digerire la proteina mediante digestione in gel come descritto in precedenza. Dopo aver ottenuto i peptidi dalla digestione in gel, eseguire la spettrometria di massa accoppiata alla cromatografia liquida come descritto in precedenza.Tutte le subunità proteiche dell'eterododecamero RvB1/B2 e i complessi CPS eteroottamericari sono state identificate con elevata confidenza. Lo spettro di massa di RvB1/RvB2 rivela due specie che corrispondono ai doppi anelli esamerico e dodecamerico. Una struttura cristallina per il complesso RvB1/B2 mostra la disposizione del doppio anello.L'aggiunta di BS3 al complesso RvB1/RvB2 causa il legame covalente delle proteine con conseguente formazione di bande proteiche a peso molecolare più elevato. E quantità crescenti di BS3 producono quantità maggiori di specie reticolate, mentre le subunità proteiche non reticolate sono ridotte. Lo spettro dei dipeptidi reticolati mostra una serie di ioni Y di entrambi i peptidi, confermando questa interazione proteica.I risultati del cross-linking di BS3 sono visualizzati in una rete di interazione che mostra le interazioni intramolecolari e le interazioni tra diverse subunità. Lo spettro di massa nativo di CPS mostra l'eterodimero, l'eterotetramero e l'eteroottamero. La spettrometria di massa tandem del CPS tetramico e ottamerica rivela la dissociazione della piccola subunità CPS.La reticolazione chimica di CPS con il reticolante BS3 mostra diverse reticolazioni intramolecolari tra due copie della grande subunità CPS. La struttura cristallina rivela che la superficie di interazione tra il nucleo tetramico e le piccole subunità periferiche è molto piccola, il che potrebbe spiegare l'assenza di interazioni tra le subunità. Una volta padroneggiato, il nostro flusso di lavoro può essere eseguito per una settimana se eseguito correttamente.Poiché l'assemblaggio delle proteine è troppo complesso, è necessario più tempo per l'analisi dei dati. Seguendo questa procedura, la modellazione computazionale può essere successivamente eseguita per ottenere modelli tridimensionali dei complessi proteici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire esperimenti di reticolazione chimica e spettrometria di massa nativa fino a quando queste due tecniche complementari non aiuteranno a chiarire le strutture degli assemblaggi proteici.

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