Isolamento, la cultura e la differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo e dei progenitori degli osteoclasti dai topi

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare e coltivare le cellule stromali del midollo osseo, o BMSC. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle ossa e degli adipociti sulle cellule progenitrici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le BMSC possono essere isolate in modo relativamente rapido, ripetibile ed economico.

La dimostrazione visiva di questo metodo è utile, poiché le fasi di dissezione possono essere difficili da spiegare con il solo testo. Prima di iniziare la procedura di prelievo delle ossa, aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura di cellule staminali del midollo osseo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri per ogni tre ossa da prelevare. E tagliare l'estremità da un puntale per pipetta da 200 microlitri per provetta da microcentrifuga, in modo che ogni puntale possa entrare in un'unica provetta con i coperchi chiusi.

Quindi, posiziona il primo topo di 78 settimane soppresso in posizione supina su una tavola di dissezione e spruzza l'animale con etanolo al 70%. Usa una pinza per creare una tenda di pelle sull'addome e usa le forbici da dissezione sterili per praticare un'incisione cutanea di circa un centimetro. Staccare la pelle per esporre il basso addome e le gambe.

Taglia lungo la cresta iliaca di ciascuna anca per separare le teste del femore dal bacino e fai un'incisione attraverso la linea mediana del bacino per separare le ossa iliache e taglia sotto le articolazioni della caviglia per rimuovere i piedi. Quindi, separare la tibia dal femore tagliando l'articolazione del ginocchio. Quindi, usa salviette prive di lanugine per rimuovere con cura il muscolo dai femori, dalle tibie e dalle ossa iliache.

Quando tutte le ossa sono state raccolte, posizionare i campioni in PBS su ghiaccio e trasferire i campioni in una cappa di coltura sterile. Utilizzando la tecnica sterile, eseguire tagli di uno o due millimetri sia all'estremità prossimale che a quella distale di ciascun osso prima di inserire tre ossa in ciascuna punta della micropipetta modificata nelle provette della microcentrifuga. Prelevare il midollo osseo dalle ossa mediante centrifugazione, confermando se il midollo è stato completamente pellettato sul fondo di ciascuna provetta per microcentrifuga alla fine della centrifuga.

Se tutto il midollo è stato raccolto, le ossa appariranno bianche. Rimuovere i puntali delle micropipette e le ossa dalle provette di raccolta per un corretto smaltimento in biosicurezza. Per piastrare le cellule del midollo osseo, utilizzare prima una siringa da un millilitro dotata di un ago da 25 gauge per risospendere lentamente i pellet e rompere eventuali grumi, e raggruppare i campioni in un'unica provetta conica da 15 millilitri.

Aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura di cellule staminali del midollo osseo per 500 microlitri di campione e filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro da 70 micron in una provetta conica da 50 millilitri per rimuovere eventuali frammenti ossei. Dopo il conteggio, seminare le cellule del midollo osseo a una volta da 10 a una sesta cellula per centimetro quadrato di densità in terreno di coltura fresco per un'incubazione di 72 ore a 37 gradi Celsius e 5% di CO2. Il terzo giorno, sostituire il surnatante con un terreno fresco, cambiando il terreno ogni due giorni fino a quando le cellule raggiungono l'80%-100% di confluenza.

Per preparare una coltura di popolazione cellulare di midollo osseo divisa, piastrate le cellule di midollo osseo raccolte da un topo in una piastra di coltura cellulare di 10 centimetri per 48 ore in un terreno di coltura fresco in un incubatore per colture cellulari. Il secondo giorno di coltura, rimuovere il surnatante contenente cellule staminali ematopoietiche non aderenti e lavare accuratamente la piastra con PBS, senza disturbare le cellule aderenti del midollo osseo. Sostituire il PBS con lo 0,25% di tripsina.

Dopo uno o tre minuti a 37 gradi Celsius, spegnere la reazione con un terreno di coltura cellulare fresco e contare le cellule nella sospensione cellulare risultante. Centrifugare il numero appropriato di celle per la placcatura e risospendere il pellet in un terreno di coltura fresco sufficiente per la densità di placcatura desiderata. Quindi, posizionare le piastre nell'incubatore per colture cellulari fino alla confluenza.

Per indurre la differenziazione degli osteoblasti delle cellule staminali del midollo osseo, sostituire il terreno di coltura cellulare con un terreno di differenziazione ogni due giorni, fino a quando le cellule iniziano a produrre noduli bianchi di mineralizzazione che possono essere osservati macroscopicamente. Per indurre la differenziazione degli adipociti delle cellule staminali del midollo osseo, sostituire il terreno di coltura cellulare di una coltura cellulare confluente del midollo osseo con un terreno di induzione degli adipociti. Dopo due giorni di coltura, sostituire il surnatante con un terreno di induzione degli adipociti fresco, passando al terreno di base degli adipociti il quarto giorno.

Il settimo giorno, confermare che le cellule hanno accumulato goccioline lipidiche e che mostrano un fenotipo simile agli adipociti maturi. Per differenziare le cellule staminali ematopoietiche in osteoclasti, quando una coltura cellulare totale del midollo osseo o una coltura cellulare non aderente diventa aderente, sostituire il terreno di coltura cellulare con un terreno di differenziazione degli osteoclasti. Cambiare il terreno ogni due giorni e controllare la differenziazione degli osteoclasti ogni giorno al microscopio ottico con un ingrandimento di 10x fino a quando gli osteoclasti non si fondono e formano cellule multinucleate, in genere intorno ai giorni da cinque a sette di differenziazione.

Le colture confluenti di BMSC possono essere differenziate in osteoblasti utilizzando un terreno osteogenico composto da acido ascorbico e beta-glicerofosfato. Dopo alcuni giorni di differenziazione, gli osteoblasti iniziano ad esprimere fosfatasi alcalina. E un'ulteriore differenziazione innescherà la produzione di matrice osteoide e, in ultima analisi, la mineralizzazione di questa matrice.

È interessante notare che solo una parte delle cellule si differenzia in osteoblasti in vitro, come rivelato dalla colorazione con cristallovioletto. Indipendentemente dal fatto che vengano utilizzate popolazioni miste o di cellule del midollo osseo divise, solo una parte delle cellule si differenzierà in adipociti, che appaiono come cellule rotonde con più vacuoli lipidici che possono essere colorati con colorante O rosso olio. Le colture di cellule staminali umane integrate con fattore stimolante delle cellule murine e RANKL si fonderanno rapidamente per formare cellule multinucleate che si colorano positivamente per TRAP.

Questi osteoclasti sono in grado di riassorbire la matrice minerale in vitro e possono essere utilizzati per valutare l'attività osteoclastica. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in meno di un'ora, se eseguita correttamente, a seconda del numero di topi. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di sterilizzare gli strumenti e di preparare preventivamente il terreno, in modo da poter lavorare nel modo più rapido e asettico possibile.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare e coltivare le cellule stromali del midollo osseo.