Name: Sintesi di particelle doro rivestite di polimeri 10-nm funzionalizzate per il Targeting di endotelio e Drug Delivery (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Scopri la sintesi di nanoparticelle d'oro da 10 nm rivestite con polimeri PEG per applicazioni biomediche. Questo metodo consente il targeting dell'endotelio e il drug delivery con elevata biocompatibilità.

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Questo lavoro è stato supportato dal dipartimento di ingegneria chimica di Northeastern University, fondi di Start-up e una borsa di studio di livello 1 pilota dalla Northeastern University Provost Office, NIH K01 HL125499 e NSF-IGERT concedere NSF/DGE-096843. Gli autori inoltre ringraziare Thomas J. Webster e il suo laboratorio per la loro assistenza, nonché il Nanomedicine Science e Technology Center e dipartimento di scienze farmaceutiche presso la Northeastern University.

1. preparazione o approvvigionamento di soluzioni Stock (che va conservato a temperatura ambiente o congelate fino all'utilizzo)
<ol><li>Preparare una soluzione stock di 1 M di idrossido di sodio (NaOH) sciogliendo 400 mg NaOH in 10 mL di acqua distillata a temperatura ambiente, e mescolando bene i materiali. Nota: Acqua ultrapura è definita come acqua senza impurità quali polveri, batteri, nucleasi, ioni o tracce di sostanze organiche. Un sistema di depurazione viene utilizzato per ottenere l'acqua ultrapura, con conseguente sua resistività di mΩ·cm fino a 18,2, che indica una bassa contaminazione anionica. Non è raccomandato l'uso di acqua ultrapura in bottiglia disponibile in commercio. D'ora in poi, questa acqua ultrapura si riferisce come acqua, se non diversamente specificato.</li>
	<li>Preparare una soluzione stock di 6M NaOH sciogliendo 2,4 g di NaOH in 10 mL di acqua e conservare la soluzione a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare una soluzione stock di 250 mM di acido cloroaurico (HAuCl4) sciogliendo 1 g di secchi HAuCl4 a 10,16 mL di acqua. Diluire 1 mL di 250 mM HAuCl4 con 9 mL di acqua per ottenere la concentrazione di lavoro di 25 mM HAuCl4. Conservare la soluzione di4 HAuCl a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare un tampone di carbonato di 0.1 M a pH 8.8, bicarbonato di sodio 84 mg in 10 mL di acqua di dissoluzione e regolando il pH a 8,8 aggiungendo 6 M NaOH dal punto 1.2. Conservare il tampone di carbonato a temperatura ambiente.</li>
	<li>Mescolare 20 mL di tetrazolium compound, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium sale (MTS), con un agente di stabilizzazione, fenazina ethosulfate (PES) (Vedi Tabella materiali). Conservare la miscela MTS/PES nelle aliquote (per un massimo di 10 cicli di gelo-disgelo) a-20 ° C nel buio.</li>
</ol>2. sintesi dei nuclei di nanoparticelle d'oro
<ol><li>Preparare una soluzione diluita di THPC aggiungendo 12 µ l 80% THPC in acqua per 1 mL di acqua in un tubo del microcentrifuge a temperatura ambiente.</li>
	<li>Fissare un pallone a fondo rotondo da 100 mL sopra il centro di una piastra magnetica. Versare 45 mL di acqua nel pallone e mescolare l'acqua a 300 giri/min utilizzando un piccolo uovo-a forma di ancoretta magnetica. Aggiungere 0,5 mL di NaOH M 1 e 1 mL di soluzione diluita di THPC. Continuare a mescolare la miscela di reazione vigorosamente per 5 min.</li>
	<li>Continuare a mescolare il composto e aggiungere 2 mL di 25 mM HAuCl4 soluzione. Il colore della miscela cambierà da giallo a marrone scuro in pochi secondi, che indica che la formazione di THPC capped AuNPs con una carica negativa. Mescolare il composto per altri 15 minuti consentire la formazione completa dei nuclei d'oro.</li>
</ol>3. aggiunta del polimero Corona intorno le nanoparticelle d'oro
<ol><li>Durante il periodo di 15 min descritto al punto 2.3, preparate il PEG soluzioni sciogliendo ciascuno dei seguenti in 1 mL di acqua in flaconcini di vetro da 4 mL: 30 mg NH2-PEG-SH; 7,5 mg m-PEG-SH; 7,5 mg COOH-PEG-SH. Nota: Le concentrazioni risultante dovrebbero essere 8,8 M NH2-PEG-SH, 3,75 M m-PEG-SH e 3,75 M COOH-PEG-SH.</li>
	<li>Dopo la riduzione della velocità dell'agitatore della soluzione nella beuta di fondo tondo a 100 giri/minuto, aggiungere che le soluzioni di PEG per la soluzione di THPC capped AuNPs goccia a goccia. Continuare a mescolare il composto delicatamente durante la notte, a temperatura ambiente, per garantire un'efficiente rimozione di THPC e la sostituzione di PEG.</li>
	<li>Per il prossimo 72 h, è necessario utilizzare una membrana di cellulosa taglio peso molecolare di 12-14 kDa per Dializzare la miscela agitata contro un secchio di 4 L d'acqua agitata a 60 giri/min. Legare le estremità delle membrane da clips di dialisi e trasferire la soluzione tramite pipetta. Nota: Questo processo di dialisi con la membrana cut-off di 12-14 kDa rimuove solo PEG non reagita, THPC e altri reagenti chimici, di diffusione lungo un gradiente di concentrazione.</li>
	<li>Per mantenere alto gradiente di concentrazione e promuovere la diffusione di continuo, è necessario cambiare l'acqua ogni 2 h per le prime 6 ore e ogni 6-12 h per le rimanenti 66 h. Nota: Lo scopo di questa acqua cambia pianificazione è quello di ospitare la rapida diffusione che si verifica all'inizio a causa della concentrazione inizialmente elevata all'interno del campione. Il processo di dialisi descritto sopra foglie, la soluzione di nanoparticelle semipurificata, perché le nanoparticelle, precipitati, aggregazioni e altre impurità di grandi dimensioni non può passare attraverso i pori della membrana di cut-off di 12-14 kDa.</li>
	<li>Filtrare la soluzione semipurificata nanoparticella in una provetta conica da 50mL utilizzando un filtro da 0,2 µm siringa per rimuovere i rimanenti precipitati, aggregazioni e altre impurità di grandi dimensioni.</li>
	<li>Collocare la provetta conica in un congelatore a-80 ° C e lasciare agire la soluzione purificata PEGylated AuNP (PEG-AuNP) di congelare per circa 5 ore.</li>
	<li>Utilizzare un congelamento essiccatore per lyophilize il PEG-AuNP purificata.</li>
	<li>Memorizzare il secco, purificata PEG-AuNP a 4 ° C fino all'utilizzo.</li>
</ol>4. coniugando fluorofori usando l'estere N-Idrossisuccinimide (NHS) sul NH2 gruppi su PEG-AuNP
<ol><li>Fissare un pallone a fondo rotondo da 50 mL sopra il centro di una piastra magnetica. Riempire il pallone con 18 mL di acqua e mescolare l'acqua a 100 rpm usando un'ancoretta magnetica a forma di uovo.</li>
	<li>Pesare 2 mg del liofilizzato PEG-AuNP in una provetta conica da 4 mL, utilizzando una scala di benchtop di alta precisione. Utilizzare una pistola antistatica per eliminare le cariche elettrostatiche e l'attaccamento della polvere PEG-AuNP alla superficie del tubo. Aggiungere 2 mL di acqua nella provetta. Versare i 2 mL di soluzione di PEG-AuNP nel pallone fondo tondo per ulteriore ricostituzione in un totale di 20 mL di acqua. Continuare a mescolare il composto a 100 rpm usando un'ancoretta magnetica a forma di uovo.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di 0,1 M, pH 8.8 carbonato buffer per i 20 mL del ricostituito AuNP contenuta in un matraccio a fondo arrotondato. Continuare a mescolare.</li>
	<li>Aggiungere 5 µ l di estere NHS fluorescente di 10 mg/mL in solfossido dimetilico. Nota: Qualsiasi colorante fluorescente può essere utilizzato in questo processo. Mescolare il PEG fluorescente durante la notte. Tenerlo a temperatura ambiente e coperto di stagnola.</li>
	<li>Per il prossimo 72 h, rimuovere fluorofori in eccesso utilizzando il protocollo descritto al punto 3.3. Brevemente, Dializzare la miscela agitata con un secchio di 4 L di acqua e una membrana di cellulosa taglio peso molecolare di 12-14 kDa. Cambiare l'acqua ogni 2 h per le prime 6 h e ogni 6-12 h per le rimanenti 66 h.</li>
	<li>Prelevare 1 mL della soluzione PEG-AuNP fluorescente purificata, da utilizzarsi per caratterizzazione descritto nella sezione 5. Congelare e lyophilize la soluzione rimanente per ottenere nanoparticelle fluorescenti nella forma in polvere per conservazione a 4 ° C, come descritto nei passaggi 3.5-3.7.</li>
	<li>Utilizzare un filtro per siringa 0,2 µm per sterilizzare e rimuovere qualsiasi potenziale precipitati una volta ricostituiti per applicazioni della coltura delle cellule.</li>
</ol>5. caratterizzazione di nanoparticelle fluorescenti PEGylated oro
<ol><li>Utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per visualizzare il nucleo delle nanoparticelle di oro e quantificare le dimensioni<ol>
<li>Goccia 10 µ l della soluzione PEG-AuNP fluorescente purificata su una griglia di carbonio rivestito maglia TEM.</li>
		<li>Dopo 5 min, è possibile utilizzare un pezzo di carta da filtro per stoppino accuratamente il liquido in eccesso lontano dal bordo della griglia TEM fino un film contenente il fluorescente che PEG-AuNPs è lasciato alle spalle.</li>
		<li>Mostra il PEG-AuNPs fluorescente a 80 kV e un ingrandimento di 50.000-150, 000. Scatta foto digitali. Nota: Solo il nucleo dell'oro sarà visibile perché la PEG non è elettrone denso il TEM.</li>
		<li>Utilizzando un software di misurazione, impostare la scala di misurazione in correlazione con la barra della scala. Calcolare il diametro di circa 20 Core d'oro e quindi determinare il diametro del nucleo oro medio. Nota: Il sistema di imaging TEM inserisce automaticamente una barra di scala sulle immagini digitali.</li>
	</ol></li>
	<li>Misurazione delle dimensioni delle nanoparticelle idrodinamico utilizzando diffusione dinamica della luce (DLS)<ol>
<li>Trasferire 1 mg di liofilizzato AuNPs rivestite con THPC in una microcentrifuga utilizzando l'approccio descritto al punto 4.2. Trasferire 1 mg di liofilizzato PEG-AuNP in un tubo separato. Aggiungere 1 mL di acqua a ciascuna provetta e trasferire ogni soluzione AuNP a un 1 mL in plastica trasparente.</li>
		<li>Disponga una provetta in un strumento DLS e misurare i diametri idrodinamici sferici utilizzando il software di analizzatore di particelle che è incorporato nel sistema liste di distribuzione.</li>
		<li>Tracciare i diametri idrodinamici misurati utilizzando un formato di istogramma. Nota: L'istogramma raggrupperà le nanoparticelle di dimensione. Il più grande gruppo delle nanoparticelle chiarirà il diametro che meglio descrive le dimensioni del AuNPs sintetizzato in questo protocollo.</li>
	</ol></li>
	<li>Conferma di fluorescenza fluorometrica Nota: Il campione stesso e la cuvetta dal punto 5.2 può essere utilizzati per misurare il segnale fluorescente.<ol>
<li>Rimuovere la provetta da liste di distribuzione e inserire una spettrofluorimetro. Insieme della lunghezza d'onda di eccitazione a 633 nm e leggi la fluorescenza emessa segnali lungo un intervallo di lunghezza d'onda di 650-800 nm.</li>
		<li>Confermare che il picco è di circa 665 nm, che correla al picco di emissione per NHS. Nota: Regolare le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione secondo il fluoroforo utilizzato nel processo.</li>
	</ol></li>
	<li>11 per valutare la biocompatibilità di analisi MTS<ol>
<li>In un fondo chiaro 96 pozzetti sterili per coltura trattato piastra, pipettare 100 µ l di terreno dell'Aquila per volta di Dulbecco (DMEM; completati con 10% fetale bovino del siero e l'1% penicillina/streptomicina) e 3.2 x 103 celle in ogni pozzetto. Nota: In questo studio, le cellule endoteliali del rilievo grasso di ratto sono utilizzate. Un totale di 21 pozzi vengono utilizzati per consentire per 3 repliche per ciascuna delle 7 concentrazioni differenti di nanoparticelle (Vedi punto 5.4.3 per concentrazioni specifiche di interesse).</li>
		<li>Permettono alle cellule di crescere alla confluenza in umidità e 5% CO2 controllata incubatrici a 37 ° C11.</li>
		<li>Preparare microcentrifuga individuali, ciascuna contenente 300 µ l di DMEM con nanoparticelle di varie concentrazioni. Questo studio richiede 7 diversi tubi di DMEM con le seguenti concentrazioni di PEG-AuNP: 0 µ g/mL, 10 µ g/mL, 50 µ g/mL, 100 µ g/mL, 250 µ g/mL, 500 µ g/mL e 1.000 µ g/mL.</li>
		<li>Aspirare il DMEM dal tubo. Riempire i pozzetti in triplice copia con 100 µ l di supporto DMEM contenente 0, 10, 50, 100, 250, 500 o 1.000 µ g/mL di AuNP.</li>
		<li>Consentire le cellule e le nanoparticelle co-Incubare per un periodo predeterminato di tempo, qui per 16 h.</li>
		<li>Verso la fine del periodo d'incubazione, scongelare la miscela di MTS/PES da passo 1,5.</li>
		<li>Dopo l'incubazione, aspirare il DMEM e le nanoparticelle sospese, vagamente collegate dai pozzi. Aggiungere 100 µ l di DMEM fresco insieme a 20 µ l di soluzione MTS/PES per ottenere 1:5 MTS/PES al rapporto di DMEM secondo il protocollo del produttore. Incubare le cellule con MTS/PES a 37 ° C per 2 h. Nota: Questo tempo di incubazione di 2 h è determinato dall'attività metabolica delle cellule endoteliali e può essere aumentato fino a 4 h per altri tipi di cellule. Entro il periodo di 2 h, la MTS è metabolizzato dalle cellule endoteliali in formazano colorata che si mescola con il DMEM. Biocompatibilità di PEG-AuNP e la probabilità di attuabilità delle cellule sarà dimostrati con formazan più colorata. Tossicità di PEG-AuNP e la possibilità che le cellule stanno morendo verrà mostrato con colore meno intenso.</li>
		<li>Eseguire analisi colorimetrica dei pozzetti leggendo l'assorbanza a 492 nm con un lettore di piastra compatibile.</li>
		<li>Per ogni concentrazione di nanoparticelle, calcolare l'assorbanza media da valori di assorbenza in triplice copia. Dividere l'assorbanza media per il valore ottenuto da una media di assorbanza in pozzetti contenenti nanoparticelle di 0 µ g/mL. Nota: Questi pozzi che non contengono nessun AuNPs fungono da controlli per il calcolo percentuale la vitalità cellulare in risposta al trattamento di nanoparticella amministrato in altri pozzi.</li>
	</ol></li>
	<li>Valutazione di microscopia confocal di fluorescenza dell'assorbimento delle nanoparticelle in cellule endoteliali aderente con intatto o disfunzionale glicocalice11<ol>
<li>Seme 1.0 x 104 cellule/cm2 ratto grasso pad cellule endoteliali su lamelle di vetro sterile 12 mm e nutrire le cellule con DMEM completati con 10% fetale bovino del siero e l'1% penicillina/streptomicina. Permettono alle cellule di crescere a pieno confluency di umidità e CO2 controllata incubatori a 37 ° C, per circa 3 giorni.</li>
		<li>Aggiungere trattamenti per modificare il glicocalice, se applicabile. Ad esempio, 2 trattamenti di h delle cellule endoteliali coltivate con 2,5 x 10-6 IU eparinasi enzima degrada il glicocalice fendendo specificamente relativo componente del solfato di heparan. Nota: Glicocalice sano possa essere modellati coltivando le cellule endoteliali, come descritto al punto 5.5.1 senza l'aggiunta di enzimi di degradazione.</li>
		<li>Con il glicocalice endoteliale lasciato intatto o reso disfunzionale, incubare le cellule endoteliali con AuNPs fluorescente a 550 µ g/mL per 16 h o altro tempo desiderato.</li>
		<li>Lavare delicatamente le cellule con 2 mL di albumina di siero bovino di 37 ° C 1% in tampone fosfato salino (PBS; contenente 100 mg/L calcio e magnesio 100 mg/L). Immergere le cellule in 2 mL di 2% paraformaldeide e 0,1% glutaraldeide in PBS e permettono alle cellule di difficoltà per 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di fissaggio aldeide e lavare le cellule con temperatura ambiente PBS per tre cicli di 5 min.</li>
		<li>Prima dell'applicazione di anticorpo primario, esporre le cellule endoteliali al siero di capra 2% in PBS per 30 min a temperatura ambiente per bloccare i siti di legame non specifico. Le cellule devono essere completamente coperti dalla soluzione bloccante.</li>
		<li>Incubare le cellule endoteliali durante la notte con l'anticorpo primario di 1% anti-eparan solfato in siero di capra 2% in PBS a 4 ° C per etichettare il componente di solfato di eparan del glicocalice. Assicurarsi che le celle fisse siano completamente a contatto con la soluzione di anticorpo.</li>
		<li>Il giorno dopo, lavare l'anticorpo con temperatura ambiente PBS per tre cicli di 10 min.</li>
		<li>Incubare le cellule endoteliali con 1:1,000 diluizione dell'anticorpo secondario fluorescente appropriato per 30 min a temperatura ambiente, in scuro o coperto con carta stagnola.</li>
		<li>Lavare l'anticorpo secondario con temperatura ambiente PBS per tre cicli di 10 min.</li>
		<li>Montare il vetrino coprioggetto su vetrini da microscopio utilizzando un mezzo di montaggio anti-dissolvenza contenente 4', 6-diamidino-2-phenylindole, dicloridrato (DAPI) per nuclei di colorazione. Sigillare i bordi del coprivetrino con smalto.</li>
		<li>Immagine la cellula endoteliale fluorescente immunostained campioni con microscopia confocale, utilizzando canali lontano rossi, verde e blu per visualizzare i nuclei, eparan solfato glicocalice e le nanoparticelle, rispettivamente.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Veiseh, O., Gunn, J., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+fabrication+of+magnetic+nanoparticles+for+targeted+drug+delivery+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Design and fabrication of magnetic nanoparticles for targeted drug delivery and imaging.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 62 (3), 284-304 (2010).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Questa tecnica è un metodo efficace per la sintetizzazione personalizzabile, che PEG ultrasmall rivestito AuNPs. Una parte importante di questa procedura è che la formazione iniziale di THPC capped oro nanoparticelle, che possono essere confermate con il cambiamento di colore dal giallo al marrone che si verificherà dopo HAuCl4 è stato aggiunto al contenuto nel pallone fondo tondo (punto 2.3 del protocollo). Nessun cambiamento di colore indica che non vi siano nessun nanoparticelle formate e che i passi iniziali devono essere verificati e ripetuti prima di procedere. Nel caso in cui che il colore cambia in qualcosa di diverso da marrone come il vino rosso o grigio, le particelle risultanti non sarà probabilmente intorno la destinazione 2.5 nm e un nuovo lotto dovrebbe essere fatta pure.
Dopo la formazione del nucleo d'oro, lo scambio di THPC per PEG e le procedure di purificazione contengono diversi passaggi chiave per completamento del protocollo. Una notte di miscelazione permette per la reazione di sostituzione andare fino al completamento. Purificazione non riuscita potrebbe verificarsi se l'acqua di dialisi non è cambiata con la frequenza prescritta. L'aggregazione e la precipitazione delle particelle può verificarsi anche se le particelle sono lasciate in dialisi per più di 72 ore. Altri potenziali problemi potrebbero essere osservati durante la liofilizzazione. Se il PEG ultrasmall rivestito AuNP soluzione non era completamente ghiacciato o se i liofilizzatori non è stato impostato correttamente, i campioni possono essere persi. Consultare il manuale di liofilizzatori, come alcune attrezzature possono richiedere la preparazione del campione diverso.
La facilità di sintesi e la biocompatibilità delle particelle risultanti rappresentano vantaggi per l'utilizzo di questi PEG-AuNPs. Inoltre, queste nanoparticelle hanno il vantaggio di essere in grado di interagire con strutture cellulari su scala nanometrica, come dimostra la capacità di identificare il glicocalice degradate dall'assorbimento di queste nanoparticelle. Questo vantaggio può essere sfruttato per lo sviluppo di nuove terapie di aterosclerosi e misure preventive. Di là di quello che vi presentiamo qui, un altro vantaggio di questo protocollo è che esso consente una vasta personalizzazione delle particelle come pure ha aumentato la stabilità e capacità di archiviazione collegando tiolo contenenti PEG su nanoparticelle d'oro4. L'altra estremità della catena PEG può contenere qualsiasi gruppo funzionale, e una miriade di molecole possa essere coniugata a tali gruppi. In questo protocollo, sono collegati tutti e tre i comuni gruppi funzionali (metil, carbossilico e aminoacidi). Il rapporto del PEG è scelto per definire la priorità prima rilevazione fluorescente, quindi la capacità di incorporare una frazione di targeting secondario utilizzando il gruppo dell'acido carbossilico. I rapporti di questi gruppi possono essere ottimizzati sulla base dell'applicazione, e le lunghezze e le forme dei polimeri possono essere registrati anche.
Per misurare l'assorbimento delle particelle, abbiamo coniugato una sonda fluorescente a uno dei gruppi funzionali. Si noti che qualsiasi coniugazione di là di quello che abbiamo descritto si tradurrà in un cambiamento di proprietà di superficie della nanoparticella. Ogni iterazione delle nanoparticelle nei confronti di componenti aggiuntivi e le reazioni di coniugazione deve essere testati per le proprietà desiderate.
Questo metodo produce ultrasmall nanoparticelle d'oro destinate a superare le proprietà difensive del glicocalice endoteliale extracellulare, che ostacola l'assorbimento delle nanoparticelle convenzionalmente dimensioni. Tuttavia, le piccole dimensioni si presta a difficoltà nella formazione immagine e droga caricamento aspetto. Queste particelle sono notevolmente inferiori rispetto all'intervallo di dimensione tipica delle nanoparticelle, e di conseguenza la superficie disponibile per gli allegati di terapeutica e targeting moiety è notevolmente diminuita. Questo può portare a difficoltà raccogliendo singoli segnali in imaging Application, anche se i cluster di particelle ancora possono essere facilmente identificati, come mostrato nelle immagini confocale. La ridotta superficie per gli allegati di targeting ligandi e terapeutica può richiedere più particelle da somministrare per raggiungere i requisiti di dosaggio di destinazione. Tuttavia, le particelle più piccole sarà più efficiente nella consegna quando prendendo il glicocalice in considerazione.
Queste particelle ultrasmall romanzo sono in grado di consegna nella difficile raggiungere su scala nanometrica aree all'interno del corpo con il minimo disturbo del microambiente. L'aggiunta del PEG permette maggiore biocompatibilità e offre gruppi funzionali per la pesante personalizzazione delle particelle per diverse applicazioni. Le dimensioni più piccole rispetto alle tipiche nanoparticelle viene fornito con alcune lacune, ma se sviluppato in modo strategico, la particella ultrasmall è un promettente approccio per alloggio dei difficili da penetrare, intricate e fragile glicocalice in vascolare consegna di targeting e di droga.

Le nanoparticelle sono state applicate per la somministrazione di farmaci e di imaging per la sua capacità di passare attraverso il corpo per raggiungere le zone di destinazione di interesse1,2. Le particelle possono accumularsi all'interno dei tumori attraverso il sistema vascolare che perde o localizzare dove un ligando bersaglio è overexpressed ed esposti. Oro, in particolare, è diventato un materiale comunemente usato nanoparticelle grazie alle sue proprietà chimiche e fisiche uniche che influiscono sul trasporto e rilascio di terapeutica3. Oro è un materiale di nanoparticella efficace perché la sua superficie può essere modificata per associare ai tioli e ha elevata biocompatibilità a causa della sua bassa tossicità4. AuNPs sono in grado di essere portatori di farmaci biomolecolari grandi e hanno avuto successo nella realizzazione di peptidi, acidi nucleici e proteine, consentendo AuNPs essere favorevole per il targeting2,4.
Purtroppo, l'efficacia di consegna di droga delle nanoparticelle è stata ostacolata dal glicocalice carica negativa, che è il cappotto extracellulare sulla membrana di cellule di mammifero più e ha dimensioni dei pori di fino a 7 nm5,6. Questo formato del poro è minore della maggior parte dei vettori di droga di nanoparticelle, che hanno diametri tipici che vanno da 50-200 nm. In condizioni di malattia, questi pori glicocalice diventano più grandi a causa della degradazione, aumentando la permeabilità attraverso alle cellule endoteliali. Tuttavia, la maggior parte delle nanoparticelle sono ancora troppo grandi per sfruttare questo cambiamento strutturale nel glicocalice. Una implicazione di questa mancata corrispondenza dimensione è che particelle di dimensioni convenzionalmente non interagiscono favorevolmente con le cellule endoteliali che allineano i vasi sanguigni. Questo incide sul rilascio di particelle per via endovenosa amministrate nell'endotelio e può anche essere detto del trasporto di particelle attraverso il sangue del cervello barriera7,8,9,10.
Un approccio per combattere questo problema è di utilizzare le più piccole particelle di passare attraverso i piccoli pori nel glicocalice. Qui, sintetizziamo un 10,5 nm ultrasmall oro di nanoparticelle, che normalmente dovrebbero essere scoraggiato da glicocalice intatto, sano. Una volta che il glicocalice comincia a essere compromessa, nanoparticella dovrebbe facilmente penetrare le cellule attraverso la crescente dimensione dei pori. Il protocollo in questa carta i dettagli di una sintesi di ultrasmall anima oro rivestito con PEG, che aumenta la biocompatibilità e riduce la clearance sistemica4. La PEG può contenere anche diversi tipi di gruppi funzionali, aprendo nuove strade per coniugazione di targeting ligandi, fluorofori e terapeutica. Precedentemente i risultati pubblicati indicano che queste nanoparticelle ultrasmall tendono ad essere preso più favorevole nelle regioni del glicocalice endoteliale perturbato funzione anche senza qualsiasi attivo targeting4,11. Questo indica la fattibilità e l'importanza di utilizzare particelle di dimensione corretta per applicazioni di consegna. Il seguente protocollo presenta la sintesi, purificazione e caratterizzazione del AuNPs rivestite con PEG (PEG-AuNP), con la discussione per la sartoria i gruppi funzionali e coniugazioni per altre applicazioni.

<table><tbody><tr><td>Idrossido di sodio (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>795429</td><td></td></tr><tr><td>Oro (III) Cloruro triidrato (HAuCl4.3H2O)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Tetrakis (idrossimetil) cloruro di fosfenio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>404861</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-tiolo monofunzionale</td><td>Layson Bio Inc.</td><td>MPEG-SH-2000-1g</td><td>Mw: 2.000 Da</td></tr><tr><td>etero bi-funzionale anime-PEG-thiol</td><td>Layson Bio Inc.</td><td>NH2-PEG-SH-3400-1g</td><td>Mw: 3.400 Da</td></tr><tr><td>carbossimetil-PEG-tiolo</td><td>Layson Bio Inc.</td><td>CM-PEG-SH-2000-1g</td><td>Mw: 2.000 Da Membrana</td></tr><tr><td>per dialisi in cellulosa (12-14 kDa)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9777</td><td></td></tr><tr><td>Strumento antistatico Zerostat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z108812</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 (AF647) acido carbossilico estere succinimidilico</td><td>Fisher</td><td>A20006</td><td>Fluorophore</td></tr><tr><td>Fisherbrand Cerchi di carta da filtro semplice di grado qualitativo - Thermo Fisher di grado P5</td><td> Scientific</td><td>09-801-B</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia elettronica</td><td>a trasmissione JEOL USA</td><td>JEOL JEM-1000</td><td>TEM</td></tr><tr><td>Diffusione dinamica della luce</td><td>Brookhaven Instruments Corporation</td><td>Brookhaven 90 Plus Analizzatore di dimensioni delle particelle</td><td>DLS</td></tr><tr><td>Fluorimetro</td><td>Horiba Scientific</td><td>Jobin Yvon Fluromax 4</td><td>Fluorimetro</td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td>MTS</td></tr><tr><td>Lettore di piastre</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax M4</td><td>Lettore di piastre</td></tr><tr><td>10E4 epitopo HS anticorpo monoclonale IgM di topo (anticorpo primario)</td><td>Amsbio</td><td>370255</td><td>Anticorpo primario</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG (anticorpo secondario)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37120</td><td>Anticorpo secondario</td></tr><tr><td>VECTASHIELD mezzo di montaggio con DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>con</td></tr><tr><td>microscopio confocale</td> DAPI <td>Carl Zeiss Meditex AG</td><td>Zeiss LSM 700</td><td>Microscopia confocol</td></tr></tbody></table>

sintesi di particelle d'oro rivestite di polimeri 10-nm funzionalizzate per il targeting di endotelio e drug delivery

Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

Nanoparticelle d'oro (AuNPs) sono stati ampiamente utilizzate nella ricerca medica a causa della loro dimensione, della biocompatibilità e superficie modificabile. Consegna di targeting e droga specifica sono alcune delle applicazioni di questi AuNPs, ma l'assorbimento delle particelle di endoteliale extracellulare proprietà difensive ceste. Per risolvere questo problema, descriviamo un metodo di sintesi per ultrasmall nanoparticelle d'oro migliorare la consegna vascolare, con gruppi funzionali personalizzabili e lunghezze di polimero per ulteriori regolazioni. Il protocollo rendimenti 2.5 nm AuNPs che sono ricoperti con cloruro di tetrachis (idrossimetil) fosfonio (THPC). La sostituzione di THPC con etero-funzionali polietilenglicole (PEG) sulla superficie della AuNP aumenta il raggio idrodinamico a 10.5 nm, fornendo vari gruppi funzionali sulla superficie. L'ultima parte del protocollo include un'aggiunta facoltativa di un fluoroforo per consentire il AuNPs possano essere visualizzati sotto fluorescenza per monitorare l'assorbimento delle nanoparticelle. Dialisi e liofilizzazione sono stati utilizzati per purificare e isolare il AuNPs. Queste nanoparticelle fluorescenti possono essere visualizzate in esperimenti sia in vitro che in vivo a causa della biocompatibile sonde PEG fluorescente e verniciatura. Inoltre, la gamma di queste nanoparticelle dimensioni li rendono un candidato ideale per sondare il glicocalice senza interrompere la funzione di normale vascolarizzazione, che può portare a una migliore consegna e terapeutica.

Il AuNPs sintetizzato, rivestito con THPC o PEG (Figura 1A e Figura 1B, rispettivamente), sono imaged con TEM e le particelle di dimensioni sono misurate utilizzando il TEM e liste di distribuzione per garantire la distribuzione delle dimensioni delle nanoparticelle corretta. La figura 2 Mostra l'immagine TEM di un campione di THPC-AuNP a 80 kV e 150.000 x ingrandimento. I diametri della gamma THPC-AuNP particelle da 2-3 nm, basato sulla barra di calibrazione in immagini TEM. Questa dimensione THPC-AuNP è evidente anche l'istogramma di misurazione della dimensione DLS illustrato nella Figura 2, in cui ha ricoperto il THPC AuNP è indicato per avere un picco a 2,5 nm. PEGilazione non è visibile sotto TEM come i polimeri non sono densi dell'elettrone. Formazione immagine TEM di PEG-AuNP campioni semplicemente conferma la presenza di singole particelle disperse, che è previsto perché la corona di polimeri di PEG intorno le nanoparticelle aiutare nella prevenzione di aggregazione. Per questi esempi di PEG-AuNP, l'istogramma di misurazione dimensione DLS Mostra un cambiamento nel picco, a circa 10.5 nm su liste di distribuzione. Allegati di altri ligandi o farmaci su gruppi funzionali urterà la dimensione della nanoparticella pure e dovrebbero essere presi in considerazione quando si misura il diametro.
L'aggiunta del fluoroforo (Figura 1) è confermato usando un fluorometro misurare il segnale di fluorescenza da un campione di nanoparticelle, come mostrato nella Figura 3. Quando eccitato con una lunghezza d'onda di 633 nm, l'emissione è misurata per avere un massimo tra 672 e 660 nm, che corrisponde a informazioni di prodotto del produttore di massima emissione a 665 nm. Collegamento delle altre sonde fluorescenti di deve essere controllato in modo simile per garantire la risposta fluorescente.
La biocompatibilità delle particelle e attuabilità delle cellule correlate sono valutati usando l'analisi MTS per controllare il metabolismo cellulare relativa di MTS dopo 16 h di incubazione con varie concentrazioni di nanoparticelle. Il fluoroforo coniugati PEGylated AuNPs non dimostra nessuna tossicità significativa, come indicato dai livelli simili di attuabilità delle cellule a tutte le concentrazioni fino a 1 mg/mL (Figura 4A). La biocompatibilità possono cambiare a seconda della terapeutica o il ligando attaccato ai rimanenti gruppi funzionali per personalizzare ulteriormente le particelle. Allegati di droga tendono ad aumentare la tossicità, ma secondo le concentrazioni di lavoro, non può interessare la redditività in modo significativo.
L'assorbimento di PEGylated AuNPs (Figura 1) di cellule aderenti, fluorescente viene valutata utilizzando cellule endoteliali coltivate del ratto cuscinetto adiposo con glicocalice intatto o disfunzionale (Figura 4B). Le condizioni di glicocalice disfunzionale si ottengono aggiungendo dell'enzima eparinasi III alla cultura, conseguente a una degradazione del componente glicocalice eparan solfato e compromettere la matrice12. Figura 4B Mostra i diversi livelli di assorbimento di PEG-AuNPs, come puntini rossi sulla vista della sezione trasversale delle cellule endoteliali rappresentative. Un sano glicocalice scoraggia l'assorbimento di queste nanoparticelle di oro, ma si osserva un aumento sostanza quando l'enzima è autonomo11. Questo risultato evidenzia il potenziale di queste nanoparticelle ultrasmall per consegnare terapeutica alle cellule endoteliali in maniera controllata dalle interazioni distinti che si basano sulla salute di glicocalice.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56760/56760fig1.jpg"> Figura 1: schemi di nanoparticelle di oro. (A) THPC rivestito AuNP nanosphere prima sostituzione PEG. (B) PEGylated AuNP con 3 tipi di terminazioni di PEG, inclusi COOH, NH2e CH3. Onde blu rappresentano il polimero. (C) coniugato nanoparticelle per l'imaging di fluorescenza. Stelle rosse mostrano i fluorophores coniugato a NH2 gruppi funzionali. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56760/56760fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56760/56760fig2.jpg"> Figura 2: dimensioni misure di nanoparticelle di oro. A sinistra: TEM di nanoparticelle d'oro prima dell'aggiunta di PEG a 80 kV e 150.000 ingrandimenti, con barra di scala mostrata. A destra: Istogramma delle dimensioni delle nanoparticelle misurata da DLS prima (AuNP) e dopo il rimontaggio (PEG-AuNP) il THPC con PEG. I risultati DLS per rivestite con THPC AuNP quantificano ciò che è visualizzato da TEM. I risultati di DLS PEG-rivestito AuNP vincere la sfida dell'incapacità di visualizzare PEG di TEM a causa i polimeri non essendo elettrone denso. Un TEM di PEG-AuNP mostrerà solo le nanoparticelle core oro e avranno lo stesso aspetto come un AuNP THPC-ricoperto. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56760/56760fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56760/56760fig3.jpg"> Figura 3: dati di fluorescenza del fluorescente PEG-AuNP. Il picco di fluorescenza a 667 nm partite, l'emissione del fluoroforo coniugato al PEG-AuNP. A.U.: unità arbitrarie.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56760/56760fig4.jpg"> Figura 4: Cell interazioni con il fluorescente PEG-AuNP. (A) trama di redditività (metabolismo MTS) cella per grasso ratto pad cellule endoteliali dopo 16 h di co-incubazione con fluorescente PEG-AuNP. (B) di immagini a sezione trasversale di Confocal di grasso ratto fisso pad di cellule endoteliali macchiate con DAPI per i nuclei (blu) e l'anticorpo contro l'eparan solfato, un componente di glicocalice (verde). Immagine in alto è un glicocalice sano e fondo è uno strato di glicocalice degradate; C'è significativamente più fluorescenza rossa da nanoparticelle nel campione con glicocalice degradati. Barra della scala è 10 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56760/56760fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Descriviamo un metodo di sintesi biocompatibile nanoparticelle d'oro di 10 nm, funzionalizzate di glicole di polietilene rivestimento sulla superficie. Queste particelle possono essere usate in vitro e in vivo per la consegna di terapeutica a scala nanometrica cellulare ed extracellulare spazi che sono difficilmente accessibili con dimensioni delle nanoparticelle convenzionali.

Sintesi di particelle d'oro rivestite di polimeri 10-nm funzionalizzate per il Targeting di endotelio e Drug Delivery

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di sintetizzare nanosfere d'oro rivestite di polimero funzionalizzato di 10 nanometri di diametro, biocompatibili, con un tempo di circolazione prolungato e che possono essere visualizzate con la microscopia a fluorescenza. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in cardiologia sulla permeabilità dell'endotelio in condizioni di malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che crea particelle ultra-piccole biocompatibili che hanno gruppi funzionali disponibili per un'ulteriore personalizzazione.Per prima cosa, in una provetta da microcentrifuga, diluire 12 microlitri di THPC all'80% con un millilitro di acqua ultra pura. Fissare un pallone a fondo tondo da 100 millilitri su una piastra di agitazione magnetica. Aggiungere al pallone 45 millilitri d'acqua e un piccolo agitatore a forma di uovo.Inizia a mescolare l'acqua a 300 giri/min. Aggiungere al pallone 0,5 millilitri di una soluzione di idrossido di sodio a un molare e un millilitro della soluzione diluita di THPC. Continuare a mescolare energicamente la miscela di reazione per cinque minuti.Quindi, aggiungere due millilitri di una soluzione di acido cloroaurico da 25 millimolari alla miscela di reazione mescolando. Verificare che la miscela di reazione gialla diventi marrone scuro in pochi secondi, indicando la formazione di nanoparticelle d'oro con cappuccio THPC e caricate negativamente. Continuate a mescolare il composto per 15 minuti.Mentre la miscela si agita, preparare una soluzione acquosa di ammina eterobifunzionale PEG tiolo, carbossimetilPEG tiolo e metossi PEG tiolo monofunzionale. Una volta che la miscela di reazione delle nanoparticelle d'oro ha mescolato per 15 minuti, ridurre la velocità di agitazione a 100 giri/min. Aggiungere le soluzioni PEG goccia a goccia al composto mescolando.Continuare a mescolare delicatamente il composto per una notte a temperatura ambiente. Quindi, chiudere un'estremità di una membrana di cellulosa MWCO da 12-14 kilodalton con una clip per dialisi. Utilizzare una pipetta per trasferire la miscela di reazione sulla membrana.Chiudere l'altra estremità della membrana con una seconda clip per dialisi. Dializzare la miscela di nanoparticelle con quattro litri di acqua mescolata a 60 giri/min per 72 ore. Cambia l'acqua ogni due ore per le prime sei ore e successivamente ogni sei-12 ore.Quindi, filtrare la miscela di nanoparticelle d'oro pegilato semi-purificata attraverso un filtro a siringa da 0,2 micrometri, in un tubo conico da 50 millilitri. Congelare la soluzione di nanoparticelle purificate a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per circa cinque ore. Liofilizzare le nanoparticelle purificate utilizzando un liofilizzatore.Per iniziare a preparare le nanoparticelle d'oro pegilate fluorescenti, fissare un pallone a fondo rotondo da 100 millilitri su una piastra di agitazione magnetica. Aggiungere 18 millilitri di acqua ultra pura e una piccola ancoretta a forma di uovo al pallone e iniziare a mescolare a 100 giri/min. In un tubo conico da quattro millilitri, unire due milligrammi di nanoparticelle d'oro pegilato liofilizzate con due millilitri di acqua.Quindi, trasferire la soluzione di nanoparticelle nel pallone a fondo rotondo per un'ulteriore ricostituzione. Aggiungere un millilitro di un tampone carbonato molare a pH 8,8, 0,1 alle nanoparticelle ricostituite mescolando. Quindi, aggiungere cinque microlitri di una soluzione da 10 milligrammi per millilitro di un estere fluorescente di anidrossisuccinimmide in dimetilsolfossido.Avvolgere il pallone in un foglio per escludere completamente la luce. Continua a mescolare la miscela di nanoparticelle fluorescenti per una notte a temperatura ambiente. Quindi, dializzare la miscela con quattro litri di acqua per 72 ore utilizzando la procedura descritta nella preparazione delle nanoparticelle d'oro pegilate.Tenere il contenitore coperto con un foglio di alluminio per tutta la durata della dialisi. Mettere da parte un millilitro di nanoparticelle pegilate fluorescenti purificate per la caratterizzazione. Congelare, liofilizzare e conservare le nanoparticelle fluorescenti rimanenti a quattro gradi Celsius.Per visualizzare il nucleo di nanoparticelle d'oro con la microscopia elettronica a trasmissione, posizionare prima 10 microlitri della soluzione di nanoparticelle fluorescenti purificate su una griglia TEM a rete rivestita di carbonio. Lasciare riposare la goccia per cinque minuti. Quindi, utilizzare la carta da filtro per rimuovere con cura il fluido in eccesso dal bordo della griglia TEM, fino a quando sulla griglia rimane solo una pellicola delle nanoparticelle fluorescenti.Immaginate le nanoparticelle a 80 kilovolt, con un ingrandimento da 50.000 a 150.000. Per misurare la dimensione delle nanoparticelle idrodinamiche, posizionare un milligrammo di nanoparticelle d'oro rivestite di THPC liofilizzate in una provetta per microcentrifuga. Aggiungere un millilitro d'acqua a ciascun tubo e trasferire le soluzioni in cuvette di plastica trasparente da un millilitro.Valutare ogni soluzione con la diffusione dinamica della luce e misurare i diametri idrodinamici sferici delle particelle. Quindi, trasferire la cuvetta contenente le nanoparticelle d'oro pegilate fluorescenti in uno spettrofluorimetro. Impostare la lunghezza d'onda dell'esozione a 633 nanometri e leggere i segnali di emissione da 650 a 800 nanometri.Successivamente, per valutare la biocompatibilità a concentrazioni di 7 nanoparticelle, pipettare prima 100 microlitri di una sospensione di cellule endoteliali di ratto in DMEM in ciascuno dei 21 pozzetti di una piastra trattata con coltura di tessuto sterile a fondo chiaro a 96 pozzetti. Incubare le cellule fino a raggiungere la confluenza, quindi ottenere sette soluzioni di nanoparticelle fluorescenti in DMEM con concentrazioni che vanno da zero a 1000 microgrammi per millilitro. Aspirare il DMEM dai pozzi.Mettere 100 microlitri di ciascuna delle sette soluzioni di nanoparticelle in ciascuno dei pozzetti separati in triplicato. Lasciare che le cellule e le nanoparticelle co-incubino per 16 ore. Quindi, aspirare il DMEM e le nanoparticelle sospese o attaccate in modo lasco dai pozzetti.Aggiungere 100 microlitri di DMEM fresco contenente 20 microlitri di una soluzione MTS/PES a ciascun pozzetto. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per due ore. Quindi, valutare la vitalità cellulare mediante analisi clorometrica a 492 nanometri con il lettore di piastre.Successivamente, seminare le cellule endoteliali del cuscinetto adiposo di ratto su un coperchio di vetro sterile da 12 millilitri scivola a 10.000 cellule per centimetro quadrato. Nutrire le cellule con DMEM integrato con il 10% di FBS e l'1% di penicillina streptomicina. Incubare le cellule fino a raggiungere la piena confluenza.Se lo si desidera, modificare il glicocalice endoteliale, quindi incubare le cellule con 550 microgrammi per millilitro di nanoparticelle d'oro fluorescenti per 16 ore. Preparare le cellule per la microscopia a immunofluorescenza. Montare ciascun vetrino coprioggetto su un vetrino da microscopio con supporto di montaggio anti-sbiadimento contenente DAPI.Sigillare i bordi del vetrino coprioggetto con lo smalto per unghie. Imaging delle cellule endoteliali immunocolorate con microscopia confocale. Visualizza i nuclei, l'eparina solfato glicocalice e le nanoparticelle con canali blu, verdi e rossi lontani, rispettivamente.TEM di nanoparticelle d'oro rivestite di THPC, ha mostrato diametri delle particelle da due a tre nanometri. Il TEM delle nanoparticelle pegilizzate ha potuto solo confermare la presenza di particelle disperse, poiché il PEG non è visibile nelle immagini TEM. Il DLS delle nanoparticelle rivestite e pegilate di THPC ha mostrato uno spostamento del diametro delle particelle di picco da 2,5 nanometri a 10,5 nanometri.L'emissione fluorescente aveva un massimo compreso tra 660 e 672 nanometri quando eccitata con luce a 633 nanometri, che era coerente con l'emissione massima prevista a 665 nanometri per la sonda fluorescente utilizzata. Le cellule endoteliali del cuscinetto adiposo di ratto hanno mostrato livelli simili di vitalità dopo 16 ore di co-incubazione con nanoparticelle d'oro pegolate fluorescenti in concentrazioni fino a un milligrammo per millilitro, indicando che non c'è tossicità significativa dalle nanoparticelle. È stato osservato un assorbimento minimo di nanoparticelle nelle cellule endoteliali del cuscinetto adiposo di ratto con glicocalici sani.L'assorbimento si è verificato in modo significativamente maggiore nelle cellule con glicocalici degradati, come dimostrato dall'aumento dei segnali fluorescenti rossi dalle nanoparticelle. Seguendo questa procedura, è possibile apportare ulteriori modifiche, come la coniugazione sui gruppi funzionali aperti, per modificare le particelle per il targeting specifico di un componente dell'endotelio o la somministrazione di un farmaco.

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