Sintesi di particelle d'oro rivestite di polimeri 10-nm funzionalizzate per il Targeting di endotelio e Drug Delivery

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di sintetizzare nanosfere d'oro rivestite di polimero funzionalizzato di 10 nanometri di diametro, biocompatibili, con un tempo di circolazione prolungato e che possono essere visualizzate con la microscopia a fluorescenza. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in cardiologia sulla permeabilità dell'endotelio in condizioni di malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che crea particelle ultra-piccole biocompatibili che hanno gruppi funzionali disponibili per un'ulteriore personalizzazione.

Per prima cosa, in una provetta da microcentrifuga, diluire 12 microlitri di THPC all'80% con un millilitro di acqua ultra pura. Fissare un pallone a fondo tondo da 100 millilitri su una piastra di agitazione magnetica. Aggiungere al pallone 45 millilitri d'acqua e un piccolo agitatore a forma di uovo.

Inizia a mescolare l'acqua a 300 giri/min. Aggiungere al pallone 0,5 millilitri di una soluzione di idrossido di sodio a un molare e un millilitro della soluzione diluita di THPC. Continuare a mescolare energicamente la miscela di reazione per cinque minuti.

Quindi, aggiungere due millilitri di una soluzione di acido cloroaurico da 25 millimolari alla miscela di reazione mescolando. Verificare che la miscela di reazione gialla diventi marrone scuro in pochi secondi, indicando la formazione di nanoparticelle d'oro con cappuccio THPC e caricate negativamente. Continuate a mescolare il composto per 15 minuti.

Mentre la miscela si agita, preparare una soluzione acquosa di ammina eterobifunzionale PEG tiolo, carbossimetilPEG tiolo e metossi PEG tiolo monofunzionale. Una volta che la miscela di reazione delle nanoparticelle d'oro ha mescolato per 15 minuti, ridurre la velocità di agitazione a 100 giri/min. Aggiungere le soluzioni PEG goccia a goccia al composto mescolando.

Continuare a mescolare delicatamente il composto per una notte a temperatura ambiente. Quindi, chiudere un'estremità di una membrana di cellulosa MWCO da 12-14 kilodalton con una clip per dialisi. Utilizzare una pipetta per trasferire la miscela di reazione sulla membrana.

Chiudere l'altra estremità della membrana con una seconda clip per dialisi. Dializzare la miscela di nanoparticelle con quattro litri di acqua mescolata a 60 giri/min per 72 ore. Cambia l'acqua ogni due ore per le prime sei ore e successivamente ogni sei-12 ore.

Quindi, filtrare la miscela di nanoparticelle d'oro pegilato semi-purificata attraverso un filtro a siringa da 0,2 micrometri, in un tubo conico da 50 millilitri. Congelare la soluzione di nanoparticelle purificate a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per circa cinque ore. Liofilizzare le nanoparticelle purificate utilizzando un liofilizzatore.

Per iniziare a preparare le nanoparticelle d'oro pegilate fluorescenti, fissare un pallone a fondo rotondo da 100 millilitri su una piastra di agitazione magnetica. Aggiungere 18 millilitri di acqua ultra pura e una piccola ancoretta a forma di uovo al pallone e iniziare a mescolare a 100 giri/min. In un tubo conico da quattro millilitri, unire due milligrammi di nanoparticelle d'oro pegilato liofilizzate con due millilitri di acqua.

Quindi, trasferire la soluzione di nanoparticelle nel pallone a fondo rotondo per un'ulteriore ricostituzione. Aggiungere un millilitro di un tampone carbonato molare a pH 8,8, 0,1 alle nanoparticelle ricostituite mescolando. Quindi, aggiungere cinque microlitri di una soluzione da 10 milligrammi per millilitro di un estere fluorescente di anidrossisuccinimmide in dimetilsolfossido.

Avvolgere il pallone in un foglio per escludere completamente la luce. Continua a mescolare la miscela di nanoparticelle fluorescenti per una notte a temperatura ambiente. Quindi, dializzare la miscela con quattro litri di acqua per 72 ore utilizzando la procedura descritta nella preparazione delle nanoparticelle d'oro pegilate.

Tenere il contenitore coperto con un foglio di alluminio per tutta la durata della dialisi. Mettere da parte un millilitro di nanoparticelle pegilate fluorescenti purificate per la caratterizzazione. Congelare, liofilizzare e conservare le nanoparticelle fluorescenti rimanenti a quattro gradi Celsius.

Per visualizzare il nucleo di nanoparticelle d'oro con la microscopia elettronica a trasmissione, posizionare prima 10 microlitri della soluzione di nanoparticelle fluorescenti purificate su una griglia TEM a rete rivestita di carbonio. Lasciare riposare la goccia per cinque minuti. Quindi, utilizzare la carta da filtro per rimuovere con cura il fluido in eccesso dal bordo della griglia TEM, fino a quando sulla griglia rimane solo una pellicola delle nanoparticelle fluorescenti.

Immaginate le nanoparticelle a 80 kilovolt, con un ingrandimento da 50.000 a 150.000. Per misurare la dimensione delle nanoparticelle idrodinamiche, posizionare un milligrammo di nanoparticelle d'oro rivestite di THPC liofilizzate in una provetta per microcentrifuga. Aggiungere un millilitro d'acqua a ciascun tubo e trasferire le soluzioni in cuvette di plastica trasparente da un millilitro.

Valutare ogni soluzione con la diffusione dinamica della luce e misurare i diametri idrodinamici sferici delle particelle. Quindi, trasferire la cuvetta contenente le nanoparticelle d'oro pegilate fluorescenti in uno spettrofluorimetro. Impostare la lunghezza d'onda dell'esozione a 633 nanometri e leggere i segnali di emissione da 650 a 800 nanometri.

Successivamente, per valutare la biocompatibilità a concentrazioni di 7 nanoparticelle, pipettare prima 100 microlitri di una sospensione di cellule endoteliali di ratto in DMEM in ciascuno dei 21 pozzetti di una piastra trattata con coltura di tessuto sterile a fondo chiaro a 96 pozzetti. Incubare le cellule fino a raggiungere la confluenza, quindi ottenere sette soluzioni di nanoparticelle fluorescenti in DMEM con concentrazioni che vanno da zero a 1000 microgrammi per millilitro. Aspirare il DMEM dai pozzi.

Mettere 100 microlitri di ciascuna delle sette soluzioni di nanoparticelle in ciascuno dei pozzetti separati in triplicato. Lasciare che le cellule e le nanoparticelle co-incubino per 16 ore. Quindi, aspirare il DMEM e le nanoparticelle sospese o attaccate in modo lasco dai pozzetti.

Aggiungere 100 microlitri di DMEM fresco contenente 20 microlitri di una soluzione MTS/PES a ciascun pozzetto. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per due ore. Quindi, valutare la vitalità cellulare mediante analisi clorometrica a 492 nanometri con il lettore di piastre.

Successivamente, seminare le cellule endoteliali del cuscinetto adiposo di ratto su un coperchio di vetro sterile da 12 millilitri scivola a 10.000 cellule per centimetro quadrato. Nutrire le cellule con DMEM integrato con il 10% di FBS e l'1% di penicillina streptomicina. Incubare le cellule fino a raggiungere la piena confluenza.

Se lo si desidera, modificare il glicocalice endoteliale, quindi incubare le cellule con 550 microgrammi per millilitro di nanoparticelle d'oro fluorescenti per 16 ore. Preparare le cellule per la microscopia a immunofluorescenza. Montare ciascun vetrino coprioggetto su un vetrino da microscopio con supporto di montaggio anti-sbiadimento contenente DAPI.

Sigillare i bordi del vetrino coprioggetto con lo smalto per unghie. Imaging delle cellule endoteliali immunocolorate con microscopia confocale. Visualizza i nuclei, l'eparina solfato glicocalice e le nanoparticelle con canali blu, verdi e rossi lontani, rispettivamente.

TEM di nanoparticelle d'oro rivestite di THPC, ha mostrato diametri delle particelle da due a tre nanometri. Il TEM delle nanoparticelle pegilizzate ha potuto solo confermare la presenza di particelle disperse, poiché il PEG non è visibile nelle immagini TEM. Il DLS delle nanoparticelle rivestite e pegilate di THPC ha mostrato uno spostamento del diametro delle particelle di picco da 2,5 nanometri a 10,5 nanometri.

L'emissione fluorescente aveva un massimo compreso tra 660 e 672 nanometri quando eccitata con luce a 633 nanometri, che era coerente con l'emissione massima prevista a 665 nanometri per la sonda fluorescente utilizzata. Le cellule endoteliali del cuscinetto adiposo di ratto hanno mostrato livelli simili di vitalità dopo 16 ore di co-incubazione con nanoparticelle d'oro pegolate fluorescenti in concentrazioni fino a un milligrammo per millilitro, indicando che non c'è tossicità significativa dalle nanoparticelle. È stato osservato un assorbimento minimo di nanoparticelle nelle cellule endoteliali del cuscinetto adiposo di ratto con glicocalici sani.

L'assorbimento si è verificato in modo significativamente maggiore nelle cellule con glicocalici degradati, come dimostrato dall'aumento dei segnali fluorescenti rossi dalle nanoparticelle. Seguendo questa procedura, è possibile apportare ulteriori modifiche, come la coniugazione sui gruppi funzionali aperti, per modificare le particelle per il targeting specifico di un componente dell'endotelio o la somministrazione di un farmaco.