Name: Una quantitativa Dot Blot Assay AAV titolazione e suo uso per la valutazione funzionale di Virus Adeno-associato Assembly-attivazione proteine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Scopri il saggio dot blot quantitativo per la titolazione di AAV e il ruolo delle proteine AAP nell'assemblaggio dei capsidi virali. Questo metodo semplice ed economico facilita la ricerca in terapia genica.

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Vi ringraziamo di averci fornito il plasmide pEMBL-CMV-GFP Xiao Xiao presso la University of North Carolina a Chapel Hill. Ringraziamo Christopher Cheng e Samuel J. Huang per una lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal servizio di sanità pubblica concede (NIH R01 NS088399 e T32 EY232113).

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<li>Sonntag, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly-activating+protein+promotes+capsid+assembly+of+different+adeno-associated+virus+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes.</a> J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).</li>
<li>Naumer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+adeno-associated+virus+assembly-activating+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein.</a> J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).</li>
<li>Earley, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+nuclear+and+nucleolar+localization+signals+in+the+adeno-associated+virus+serotype+2+assembly-activating+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein.</a> J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).</li>
<li>Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+and+computational+evolution-based+method+to+study+a+mode+of+co-evolution+of+overlapping+open+reading+frames+in+the+AAV2+viral+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome.</a> PLoS One. 8 (6), e66211(2013).</li>
<li>Earley, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+Virus+%28AAV%29+Assembly-Activating+Protein+Is+Not+an+Essential+Requirement+for+Capsid+Assembly+of+AAV+Serotypes+4%2C+5%2C+and+11%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11.</a> J Virol. 91 (3), (2017).</li>
<li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li>
<li>Clark, K. R., Liu, X., McGrath, J. P., Johnson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+purified+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+are+biologically+active+and+free+of+detectable+helper+and+wild-type+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses.</a> Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).</li>
<li>Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-free+stocks+of+recombinant+adeno-associated+viruses%3A+normal+integration+does+not+require+viral+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression.</a> J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).</li>
<li>Wobus, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+the+adeno-associated+virus+type+2+%28AAV-2%29+capsid%3A+epitope+mapping+and+identification+of+capsid+domains+involved+in+AAV-2-cell+interaction+and+neutralization+of+AAV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection.</a> J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).</li>
<li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titration+of+AAV-2+particles+via+a+novel+capsid+ELISA%3A+packaging+of+genomes+can+limit+production+of+recombinant+AAV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2.</a> Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).</li>
<li>Sommer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+adeno-associated+virus+particles+and+empty+capsids+by+optical+density+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement.</a> Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).</li>
<li>Fagone, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+errors+in+quantitative+polymerase+chain+reaction+titration+of+self-complementary+adeno-associated+viral+vectors+and+improved+alternative+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods.</a> Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 1-7 (2012).</li>
<li>Farkas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+parvovirus+isolated+from+royal+python+%28Python+regius%29+is+a+member+of+the+genus+Dependovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">A parvovirus isolated from royal python (Python regius) is a member of the genus Dependovirus.</a> J Gen Virol. 85 (Pt 3), 555-561 (2004).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In questo rapporto, l'utilità di analisi blot quantitativo dot per studiare AAV AAPs e il loro ruolo nell'assembly del capsid è descritto. Conoscenze acquisite da questi studi possono fornire approfondimenti dettagliati nelle differenze innate nel processo di assemblaggio del capside AAV ed il ruolo funzionale di AAPs tra diversi sierotipi. A questo proposito, il punto croce-complementazione AAV VP3-AAP blot analisi ha rivelato che serpente AAV VP3 visualizzato una rigorosa dipendenza il co-espressione di sue cognate AAP...

Virus adeno-associato (AAV) è un virus a DNA piccolo, senza involucro, a singolo filamento con un genoma di circa 4,7 kilobasi (kb). Il genoma AAV contiene Apri-reading frame (ORF) per i geni rep e cap . Nel 2010, una precedentemente non identificata nonstructural proteina codificata da un ORF + 1 telaio-spostato all'interno del gene di tappo AAV2 fu scoperto da Sonntag et al e trovata a giocare un ruolo critico nell'assemblaggio di proteine monomeriche AAV2 del capside VP in un virale capside1. Questa nuova proteina è stata nominata proteina d'attivazione assembly (AAP) dopo il suo ruolo nella promozione del capsid assemblaggio1.
ORFs per AAP sono stati identificati bioinformatically nel genoma dei tutti i parvovirus del genere Dependoparvovirus, ma non all'interno del genoma dei virus dei diversi generi del parvovirus famiglia1,2. Studi funzionali di questa proteina romanzo erano inizialmente concentrati sull'AAP dal prototipo AAV2 (AAP2), che ha istituito il ruolo essenziale della AAP2 nel targeting completamente smontate proteine VP per il nucleolo per il loro accumulo e la formazione in assemblati capsidi1,3,4. L'incapacità dei capsidi AAV2 di assemblare in assenza di espressione di AAP è stato indipendentemente confermato da più gruppi, compreso il nostro1,2,3,4,5 . Studi successivi su sierotipi AAV 1, 8 e 9 ha confermato il ruolo critico di AAPs nell'assembly del capsid, come proteine monomeriche VP3 di AAV1, 8, e 9 erano in grado di formare un capside completamente assemblato in assenza di co-espressione di AAP2.
Recentemente, attraverso approcci che includono l'uso di quantitativi dot blot analisi, abbiamo studiato la capacità di AAV1 di 12 VP3 monomeri per assemblare in capsidi in assenza di espressione di AAP e la capacità di AAP1 al 12 di promuovere l'Assemblea del VP3 monomeri da sierotipi eterologi. Questo studio ha rivelato che AAV4, 5 e 11 VP3 monomeri possono montare senza AAP. Inoltre, è stato trovato che otto dei dodici sierotipi AAP abbiamo esaminato (cioè, tutti, ma AAP4, 5, 11 e 12) visualizzata una vasta capacità di supportare Assembleia capside eterologhe capsidi di sierotipo AAV, mentre AAP4, 5, 11 e 12 visualizzato un sostanzialmente capacità limitata a questo proposito6. Questi quattro sierotipi sono filogeneticamente distanti dagli altri AAP sierotipi2,3. Inoltre, lo studio ha scoperto significativa eterogeneità nelle localizzazioni subcellulari di diversi AAPs6. Inoltre, lo studio ha suggerito che la stretta associazione di AAP con capsidi assemblati e il nucleolo, il segno distintivo dell'Assemblea di capside AAV2, necessariamente non può essere estesa ad altri sierotipi inclusi AAV5, 8 e 9, che visualizzano nucleolar esclusione di capsidi assemblato6. Così, le informazioni ottenute dallo studio di qualsiasi particolare sierotipo AAP non sono ampiamente applicabile a tutti i biologia AAP. Tale natura sconcertante della biologia AAP sottolinea la necessità di indagare il ruolo e la funzione di ogni AAP da sierotipi AAV sia canonici e non canoniche.
Il ruolo biologico di AAP nell'assembly capside può essere valutato determinando che i titoli di particella virale AAV completamente confezionato prodotta in cellule embrionali umane del rene (HEK) 293 cellule, la linea cellulare più comunemente utilizzati per la produzione di vettore AAV, con o senza proteine AAP espressione. I metodi standard per la quantificazione di AAV sono PCR quantitativa (qPCR)-base saggi7,8 e quantitativa dot blot-based assays9. Altri metodi per la quantificazione della particella virale AAV come analisi enzima-collegata dell'immunosorbente10,11 o densità ottica misura12 non sono ideali per campioni o campioni provenienti da molti diversi sierotipi di AAV contaminata da impurità (lisati grezza o terreni di coltura), che sono spesso i campioni utilizzati per la ricerca AAV. Attualmente, qPCR è più ampiamente usato per la quantificazione dell'AAV; Tuttavia, è necessario riconoscere potenziali avvertimenti del dosaggio qPCR-basato, come l'analisi possono provocare errori sistemici e significativo titolo variazioni13,14. Analisi PCR-based sono interessate da una serie di fattori, quali la presenza di forcine covalentemente chiusi terminale nei modelli di PCR che inibiscono amplificazione13potenzialmente di confusione. Anche un individuo esperto può introdurre potenziali fattori di confondimento in una base di qPCR inconsapevolmente dosaggio13. Al contrario, analisi di quantitativi dot blot sono una tecnica di biologia molecolare classica che non riguarda l'amplificazione del genoma e utilizza un principio molto semplice con un rischio minimo di errori rispetto alle analisi qPCR-based. Il metodo è meno tecnicamente impegnativi; di conseguenza, i risultati del saggio sono ragionevolmente riproducibili anche da individui inesperti.
In questo rapporto, descriviamo i dettagli metodologici di analisi quantitativa dot macchia usiamo ordinariamente per quantificazione di vettore AAV e fornire un esempio di come applicare il dosaggio per studiare il ruolo di promozione di assemblaggio di AAPs in comune con sierotipi (AAV5 e AAV9) e un' in precedenza atipici AAP dal serpente AAV14. In natura, AAV VP e proteine AAP sono espressi in cis da un singolo gene (cioè, VP-AAP cis-complementazione), mentre nel test qui descritto, proteine VP e AAP sono fornite in trans da due plasmidi separati (cioè, VP-AAP Trans-complementazione). Poiché ogni proteina VP o AAP da sierotipi diversi può essere espressa da ogni plasmide indipendente, diventa possibile testare eterologa VP-AAP combinazioni di assemblaggio del capside (cioè, VP-AAP cross-complementazione). Brevemente, AAV VP3 da vari sierotipi è espresso in cellule HEK 293 di transfezione del DNA del plasmide per assemblare un genoma di vettore AAV in presenza o assenza del sierotipo cognato AAP, o in presenza di un sierotipo eterologo AAP. A seguito di produzione, terreni di coltura e lisati cellulari sono sottoposti ad un'analisi della macchia di dot per quantificare il genoma virale all'interno della shell di capside. Il primo passo del dot blot test è quello di trattare i campioni con una nucleasi per rimuovere contaminanti plasmide DNAs e non imballati AAV genomi in campioni. In caso contrario aumenterebbe i segnali di sfondo in particolare quando non purificata i campioni sono analizzati. Ciò allora è seguita da un trattamento con proteasi per rompere capsidi virali e rilasciare nucleasi-resistente genomi virali in soluzioni campione. Genomi virali, prossimi sono denaturati, cancellati su una membrana e ibridati con una sonda di DNA specifico del genoma virale per quantificazione. Con il test di esempio segnalato qui, dimostriamo che serpente AAV VP3 richiede serpente AAP per l'assemblaggio del capside e che serpente AAP non promuovere l'Assemblea del AAV9 capsidi a differenza di molti di AAPs derivato da sierotipi di AAP-dipendente che possono anche promuovere l'Assemblea del capsidi sierotipo eterologa. Infine, segnaliamo un avvertimento importante per qPCR o quantificazione di dot blot-based AAV saggi che la scelta di nucleasi influenza in modo significativo i risultati del saggio.

<table><tbody><tr><td>Benzonase</td><td>MilliporeSigma</td><td>1016970001</td><td>indicato come Serratia marcescen endonucleasi nel testo principale.</td></tr><tr><td>La DNasi I</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>indicata come DNasi I enzima A nel testo principale.</td></tr><tr><td>La DNasi I</td><td>Invitrogeno</td><td>18047019</td><td>indicata come DNasi I enzima B nel testo principale.</td></tr><tr><td>DNasi I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303L</td><td>Indicato come DNasi I Enzima C nel testo principale.</td></tr>Provette per <tr><td>microcentrifuga con O-ring da 1,5 mL Corning</td><td></td><td>430909</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica in polipropilene da 15 mL</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>3 M Acetato di sodio</td><td>Teknova</td><td>S0298</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica in polipropilene da 50 mL</td><td>Corning</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>Cellule AAV-293</td><td>Agilent</td><td>240073</td><td>linea cellulare HEK-293 ottimizzata per il confezionamento di virioni AAV.</td></tr><tr><td>AccuGENE 0,5 M EDTA Soluzione</td><td>Lonza</td><td>51234</td><td></td></tr><tr><td>AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8,0</td><td>Lonza</td><td>51238</td><td></td></tr><tr><td>AccuGENE 10% SDS</td><td>Lonza</td><td>51213</td><td></td></tr><tr><td>AccuGENE 1X TE Tampone</td><td>Lonza</td><td>51235</td><td></td></tr><tr><td>Apparecchio Bio-RAD</td><td></td><td>1706545</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>MilliporeSigma</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Cell Lifter</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>MilliporeSigma</td><td>372978</td><td></td></tr><tr><td>Kit estrattore di DNA</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>295-50201</td><td>Questo viene utilizzato per macchie quantitative su virus purificato. In ogni fase utilizziamo solo metà volume di tutti i reagenti consigliati per lo schema di protocollo 2 nel manuale fornito dal produttore.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle modificato Medio (DMEM)-alto glucosio (4,5 g/L)</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>ElectroMAX DH10B Cells</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18290015</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 Proof</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>VWR</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22095</td><td>Indicato come polisaccarosio 400.</td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 40 CFL</td><td></td></tr><tr><td>Glicogeno</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>Spermatozoi di aringhe DNA</td><td>Invitrogen</td><td>15634-017</td><td></td></tr><tr><td>Provette di ibridazione</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-247-150</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant TL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>ImageQuant TL</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina 200 mM</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato</td><td>MilliporeSigma</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>MicroPulser Electroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Mini colonne di DNA a rotazione rapida</td><td>MilliporeSigma</td><td>11814419001</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-RC2 Vector</td><td>Cell Biolabs Inc</td><td>VPK-422</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina 10K/10K</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td></td></tr> Soluzione <tr><td>salina tamponata con fosfato</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Cassetta di esposizione al fosforo</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Vari</td><td></td></tr><tr><td>schermi di imaging al fosforo</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Vari</td><td></td></tr><tr><td>plasmidi Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>Platino Pfx DNA polimerasi</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>11708013</tr><tr><td>Polietilenimmina</td><td>Polysciences Inc</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidone</td><td>MilliporeSigma</td><td>P5288</td><td></td></tr><tr><td>Prime-It II Kit di etichettatura del primer casuale</td><td>Agilent Technologies</td><td>300385</td><td></td></tr><tr><td>Primer AAP Forward (N25 nucleotidi dal 4° nucleotide nell'AAP ORF, RE1 è un sito enzimatico di restrizione per il clonaggio): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA CGACGATGACAAA-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>Custom Primer</td><td></td></tr><tr><td>Primer AAP Reverse (N25 è l'ultimo 25 nucleotidi dell'AAP ORF, RE2 è un sito enzimatico di restrizione per il clonaggio): TCTT-RE2-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>Custom Primer</td><td></td></tr><tr><td>Primer VP3 Forward (N25 i primi 25 nucleotidi dell'ORF VP3, RE1 è un sito enzimatico di restrizione per il clonaggio): CTAA-RE1-CACC-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>Custom Primer</td><td></td></tr><tr><td>Primer VP3 Reverse (N25 sono gli ultimi 25 nucleotidi dell'AAP ORF, RE2 è un sito enzimatico di restrizione per la clonazione): TCTT-RE2-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>Custom Primer</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K Soluzione</td><td>Invitrogen</td><td>25530-049</td><td></td></tr><tr><td>Enzimi di restrizione</td><td>New England Biolabs</td><td>Vari</td><td></td></tr><tr><td>spermatozoi di salmone DNA</td><td>Invitrogen</td><td>15632011</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di sodio Diidrato tribasico</td><td>MilliporoSigma</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA polimerasi</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td>Eppendorf</td><td>6321000515</td><td></td></tr><tr><td>Piastra trattata con coltura tissutale Corning a 6 pozzetti</td><td></td><td></td><td></td>353046</tr><tr><td>Tris Base</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Tifone FLA 7000</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28955809</td><td></td></tr> Viene utilizzata la modalità UV Crosslinker <tr><td>Phenol Invitrogen</td><td>15513-047</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker</td><td>Spectroline</td><td>XLE-1000</td><td>Optimal, che fornisce un dosaggio di energia UV di 120 mJ/cm2.</td></tr><tr><td>membrana con sonda Zeta</td><td>Bio-RAD</td><td>162-0165</td><td></td></tr></tbody></table>

una quantitativa dot blot assay aav titolazione e suo uso per la valutazione funzionale di virus adeno-associato assembly-attivazione proteine

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

Mentre virus adeno-associato (AAV) è ampiamente accettata come un vettore di attraente per la terapia genica, serve anche come un virus di modello per la comprensione della biologia del virus. Sotto questo aspetto, la recente scoperta di una proteina AAV non strutturali, chiamata proteina d'attivazione assembly (AAP), ha gettato nuova luce sui processi coinvolti nell'assemblaggio delle proteine del capside virale VP in un capside. Anche se molti sierotipi AAV richiedono AAP per assemblaggio, recentemente abbiamo riferito che AAV4, 5, e 11 sono eccezioni a questa regola. Inoltre, abbiamo dimostrato che AAPs e assemblati capsidi di diversi sierotipi di localizzano a diversi compartimenti subcellulari. Questa eterogeneità imprevista nella proprietà biologiche e ruoli funzionali di AAPs tra diversi AAV sierotipi sottolinea che l'importanza degli studi su AAPs derivata da diversi sierotipi. Un saggio di macchia semplice puntino per quantificazione AAV e la sua applicazione per valutare la specificità di dipendenza e sierotipo AAP nell'assembly del capsid i dettagli di questo manoscritto. Per dimostrare l'utilità di questo test di dot blot, abbiamo precisato per caratterizzare capside assembly e AAP dipendenza di serpente AAV, un rettile precedentemente atipico AAV, così come AAV5 e AAV9, che precedentemente sono stati indicati per essere indipendente dalla AAP e AAP-dipendente sierotipi, rispettivamente. L'analisi ha rivelato che il serpente AAV capside assembly richiede serpente AAP e non può essere promosso da AAPs da AAV5 e AAV9. L'analisi inoltre ha mostrato che, a differenza di molti il comune sierotipo AAPs che promuovere l'Assemblea del capside eterologo da cross-complementazione, serpente AAP non promuovere l'Assemblea di capsidi AAV9. Inoltre, ci mostra che la scelta di nucleasi influisce in modo significativo la lettura del test dot blot, e così, scegliendo un enzima ottimo è fondamentale per una valutazione positiva dei titoli di AAV.

Un risultato rappresentativo dei quantitativi dot blot per quantificazione delle scorte di vettore AAV purificate prodotta su larga scala è illustrato nella Figura 1. Con questa analisi di macchia del puntino, il titolo di uno stock di vettore di double-stranded AAV2G9-CMV-GFP è stato determinato. Il vettore è stato purificato mediante due turni di cloruro di cesio (CsCl) ultracentrifugazione di pendenza di densità seguita da dialisi come descritto in precede...

Questo manoscritto dettagli un saggio di macchia semplice puntino per quantificazione dei titoli del virus adeno-associato (AAV) e la sua applicazione per studiare il ruolo dell'Assemblea-attivazione proteine (AAP), una nuova classe di proteine virali non strutturali, trovate tutte le AAV sierotipi, nel promuovere l'assemblaggio di capsidi derivato da sierotipi AAV cognati ed eterologi.

Una quantitativa Dot Blot Assay AAV titolazione e suo uso per la valutazione funzionale di Virus Adeno-associato Assembly-attivazione proteine

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Questo metodo è in grado di determinare i titoli di vac AV purificati e non purificati e di valutare la capacità dell'AAV AAP di promuovere l'assemblaggio di capsi del sierotipo AV affine ed eterologo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di un metodo semplice ed economico che evita gli svantaggi di altri metodi di titolazione AAV. Sebbene questo metodo sia stato comunemente utilizzato per la quantificazione del vettore AAV, può anche essere applicato per affrontare varie domande fondamentali sulla biologia AAV, come mostrato in questo protocollo.Il giorno zero, dopo aver coltivato le cellule HEK 293 al 90% di confluenza, preparare il reagente di trasfezione mescolando i plasmidi in 96 microlitri di PBS senza calcio o magnesio in provette sterili da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Come indicato in questa tabella, la quantità totale di DNA è di due microgrammi per pozzetto. Aggiungere quattro microlitri di soluzione di PEI alla miscela di DNA plasmidico PBS.Il volume finale è di circa 100 microlitri o il 5% del volume del terreno di coltura. Agitare brevemente le provette e incubare la miscela di DNA PEI a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo l'incubazion

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In questo video, dimostriamo un test colorimetrico in vitro per rilevare la presenza di anticorpi neutralizzanti contro i vettori del sierotipo 6 del virus adeno-associato ricombinante che esprimono fosfatasi alcalina (rAAV6) in campioni di siero di pecora. Il test utilizza la reazione tra l'AAV, che codifica per un gene della fosfatasi alcalina placentare umana, e il suo substrato per generare un prodotto viola insolubile.

Saggio degli anticorpi neutralizzanti AAV basato su cellule: una tecnica colorimetrica per rilevare gli anticorpi neutralizzanti contro specifici virus adeno-associati nel siero

In questo video, descriviamo il test del dot blot per quantificare un genoma virale. L'intensità del segnale è direttamente correlata alla quantità di DNA virale nel campione.

Saggio Dot Blot per quantificare il genoma virale

Qui forniamo una procedura dettagliata per la produzione su larga scala di vettori AAV di grado di ricerca utilizzando cellule HEK 293 aderenti coltivate in pile cellulari e purificazione cromatografica di affinità. Questo protocollo produce costantemente &gt;1 x 1013 genomi vettoriali / mL, fornendo quantità vettoriali appropriate per studi su animali di grandi dimensioni.

Produzione di vettori virali adeno-associati in pile cellulari per studi preclinici in modelli animali di grandi dimensioni

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Un protocollo di laboratorio completo e un flusso di lavoro di analisi sono descritti per un test colorimetrico basato su cellule rapido, economico e semplice per rilevare elementi neutralizzanti rispetto ad AAV6.

Un metodo passo-passo per rilevare gli anticorpi neutralizzanti contro l'AAV utilizzando un test colorimetrico basato su cellule

Qui, presentiamo un protocollo per lo sviluppo e la convalida di buone pratiche di laboratorio nella rilevazione conforme di vettori virali adeno-associati in lacrime umane mediante reazione a catena della polimerasi digitale a supporto dello sviluppo clinico di vettori di terapia genica.

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Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per la generazione e la purificazione di vettori virali adeno-associati utilizzando un metodo cromatografico di affinità ottimizzato a base di eparina. Presenta un approccio semplice, scalabile ed economico, eliminando la necessità di ultracentrifugazione. I vettori risultanti mostrano un'elevata purezza e attività biologica, dimostrando il loro valore negli studi preclinici.

Isolamento di vettori virali adeno-associati attraverso un protocollo cromatografico di affinità con eparina a passaggio singolo e semiautomatico

Con la continua evoluzione del campo della terapia genica, c'è una crescente necessità di metodi innovativi in grado di affrontare queste sfide. Qui viene presentato un metodo unico, che semplifica il processo di generazione di vettori AAV ad alto rendimento e ad alta purezza utilizzando una piattaforma di fabbrica cellulare, soddisfacendo gli standard di qualità per gli studi in vivo .

Una procedura semplificata e standardizzata per la generazione di vettori virali adeno-associati ad alto titolo e di alta qualità utilizzando una piattaforma di fabbrica cellulare

La quantificazione precisa delle copie del genoma del vettore del virus adeno-associato (AAV) è fondamentale, ma un protocollo standardizzato deve ancora essere stabilito. Questo protocollo descrive un metodo convalidato per la preparazione di campioni di AAV purificati e per l'esecuzione di una reazione a catena della polimerasi (dd_PCR) digitale per quantificare in modo affidabile il titolo del genoma virale.

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Una quantitativa Dot Blot Assay AAV titolazione e suo uso per la valutazione funzionale di Virus Adeno-associato Assembly-attivazione proteine (Video) | JoVE Journal

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