Una quantitativa Dot Blot Assay AAV titolazione e suo uso per la valutazione funzionale di Virus Adeno-associato Assembly-attivazione proteine

Questo metodo è in grado di determinare i titoli di vac AV purificati e non purificati e di valutare la capacità dell'AAV AAP di promuovere l'assemblaggio di capsi del sierotipo AV affine ed eterologo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di un metodo semplice ed economico che evita gli svantaggi di altri metodi di titolazione AAV. Sebbene questo metodo sia stato comunemente utilizzato per la quantificazione del vettore AAV, può anche essere applicato per affrontare varie domande fondamentali sulla biologia AAV, come mostrato in questo protocollo.

Il giorno zero, dopo aver coltivato le cellule HEK 293 al 90% di confluenza, preparare il reagente di trasfezione mescolando i plasmidi in 96 microlitri di PBS senza calcio o magnesio in provette sterili da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Come indicato in questa tabella, la quantità totale di DNA è di due microgrammi per pozzetto. Aggiungere quattro microlitri di soluzione di PEI alla miscela di DNA plasmidico PBS.

Il volume finale è di circa 100 microlitri o il 5% del volume del terreno di coltura. Agitare brevemente le provette e incubare la miscela di DNA PEI a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo l'incubazione, centrifugare brevemente le provette in una microcentrifuga per raccogliere il liquido sul fondo.

E aggiungere la miscela di DNA PEI goccia a goccia al terreno di coltura in ciascun pozzetto della piastra di coltura HEK 293. Quindi agitare delicatamente le piastre e rimetterle in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2. La trasfezione della cellula HEK 293 è una componente fondamentale di questo protocollo per la produzione di virus ad alto titolo.

Dovrebbero essere utilizzate celle sane a basso numero di passaggi e si dovrebbe prestare attenzione a non interrompere il monostrato delle cellule. Il primo e il secondo giorno, sotto un microscopio a fluorescenza invertita, osservare le cellule trasfettate con il plasmide PCMVGFP per valutare l'efficienza della trasfezione. Il quinto giorno, pipettare le cellule e il terreno contenente virus su e giù o utilizzare un raschietto cellulare per raschiare tutte le cellule.

Quindi, trasferire la sospensione in tubi conici di polipropilene da 15 millilitri. Conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Per recuperare le particelle virali, scongelare rapidamente le provette congelate in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.

Quindi, agitare vigorosamente i tubi per un minuto per massimizzare il recupero di AAV dalle cellule. Pellettare i detriti cellulari mediante centrifugazione a 3, 700 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Quindi trasferire 200 microlitri di surnatante da ciascuna provetta in provette per microcentrifuga etichettate con tappi a vite per il test dot blot.

Per trattare i campioni con l'endonucleasi Serratia marcescens, preparare i reagenti della miscela A e della miscela B. Aggiungere 10 microlitri di ciascun reagente a ciascuna provetta del campione. Agitare i campioni per cinque secondi e farli girare brevemente per raccogliere il liquido sul fondo delle provette.

Quindi incubare le provette a 37 gradi Celsius per almeno un'ora. Dopo aver centrifugato brevemente i campioni, eseguire il trattamento con proteinasi K preparando il reagente della miscela C e aggiungendo 180 microlitri a ciascuna provetta. Quindi, dopo aver girato e fatto girare brevemente i tubi, incubarli a 55 gradi Celsius per un'ora.

Una volta che i campioni sono tornati a temperatura ambiente, aggiungere 200 microlitri di fenolo-cloroformio e agitare le provette per un minuto. Quindi centrifugare i campioni in una microcentrifuga a 16, 100 volte G e temperatura ambiente per almeno cinque minuti. Trasferire 320 microlitri di strato acquoso o l'80% del volume acquoso del fluido in una nuova provetta standard per microcentrifuga.

Questa fase di trasferimento è di fondamentale importanza in quanto lo stesso volume deve essere prelevato dal campione per mantenere l'accuratezza della quantificazione AAV. Bisogna fare attenzione ad evitare la fase organica durante la rimozione dello strato acquoso. Preparare il reagente della miscela D e aggiungere 833 microlitri a ciascuna provetta.

Dopo aver fatto vorticare i tubi, incubarli a meno 80 gradi Celsius per almeno 20 minuti. Dopo la centrifugazione, versare il surnatante e tamponare le provette una volta su un tovagliolo di carta pulito. Pipettare circa 500 microlitri di etanolo al 70% in ciascuna provetta e agitare le provette per cinque secondi.

Dopo aver centrifugato nuovamente i campioni, versare il surnatante e tamponare una volta i tubi su un tovagliolo di carta pulito. Quindi asciugare i pellet a 65 gradi Celsius prima di risospenderli nel tampone TE. Per eseguire il test di dot blot, preparare gli standard del DNA plasmidico diluendo il DNA plasmidico del genoma vettoriale AAV a 10 nanogrammi per microlitro in acqua o tampone Tris-HCL.

Trasferire un'aliquota di 25 microlitri di DNA plasmidico diluito in una provetta nuova e linearizzarla con un enzima di restrizione appropriato in un volume di reazione di 50 microlitri per un'ora. Aggiungere 450 microlitri di acqua o TE alla provetta contenente lo standard di DNA plasmidico digerito e mescolare accuratamente. Quindi trasferire 70 microlitri di questa miscela in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri con 1.330 microlitri di acqua o TE per creare uno standard plasmidico diluito.

Per impostare l'apparato di puntinatura, utilizzando le forbici, tagliare la membrana assorbente a una dimensione appropriata per il numero di campioni e gli standard. Immergere la membrana con acqua per 10 minuti prima di posizionarla sull'apparecchio per macchie a punti. Quindi, copri i pozzetti inutilizzati.

Aggiungere acqua ai pozzetti in cui verranno caricati i campioni. Applicare il vuoto, tirare l'acqua attraverso i pozzetti, verificare la presenza di errori, quindi serrare nuovamente le viti. Se necessario, ripetere il test.

Applicare 400 microlitri di ogni standard di DNA plasmidico diluito su ciascun pozzetto ed eseguire quattro corsie di diluizioni standard. Utilizzare due aliquote separate del digest standard e caricarle in duplicato. Quindi applicare 200 microlitri per pozzetto di ciascun campione di DNA virale.

Applicare un leggero vuoto per estrarre le soluzioni di DNA attraverso i pozzetti. Quindi, una volta svuotati tutti i pozzetti, rilasciare il vuoto regolando la valvola a tre vie. Aggiungere 400 microlitri di una soluzione alcalina X a ciascun pozzetto.

Quindi attendere cinque minuti prima di riapplicare il vuoto per svuotare i pozzetti. Riapplicare il vuoto e smontare l'apparecchio per macchie a punti. Quindi rimuovere la membrana e risciacquarla con due X SSC.

Posizionare la membrana su un tovagliolo di carta pulito con il lato legato al DNA rivolto verso l'alto per rimuovere il tampone in eccesso. Utilizzare un reticolante UV appropriato per reticolare UV il DNA macchiato alla membrana. La membrana è ora pronta per l'ibridazione.

Metti la membrana in un flacone di ibridazione con il lato legato al DNA rivolto verso l'alto. Sciacquare la membrana con 5-10 millilitri di tampone di ibridazione preriscaldato e gettare il tampone. Quindi aggiungere 10 millilitri di tampone di ibridazione preriscaldato e posizionare la bottiglia in un forno di ibridazione rotante impostato a 65 gradi Celsius.

Ruotare la bottiglia per almeno cinque minuti. Aggiungere rapidamente il DNA spermatico denaturato e la sonda radioattiva al tampone di ibridazione nel flacone e agitarlo per 10 secondi per mescolare. Rimetti la bottiglia nel forno a 65 gradi Celsius e incubala con rotazione a 65 gradi Celsius per almeno quattro ore.

Una volta completata l'ibridazione, arrestare la rotazione. Rimuovere il flacone di ibridazione e quindi versare la soluzione della sonda radioattiva in un tubo conico da 50 millilitri con un tappo a tenuta stagna. Per lavare la membrana, aggiungere da 20 a 30 microlitri di tampone di lavaggio preriscaldato al flacone di ibridazione e ruotarlo per cinque minuti.

Ripetere questo lavaggio altre due volte. Dopo il terzo lavaggio, rimuovere la membrana dal flacone di ibridazione e, con carta assorbente, rimuovere il tampone in eccesso dalla membrana. Quindi posizionare la membrana in un supporto di carta di plastica trasparente.

Con un contatore Geiger, controllare i segnali radioattivi sulla membrana. Dopo aver esposto lo schermo di imaging al fosforo cancellato alla membrana, eseguire la scansione dello schermo utilizzando un sistema di scansione dell'immagine al fosforo e ottenere i dati sull'intensità del segnale di ciascun punto. Eseguire l'analisi dei dati secondo il protocollo di testo.

Questo dot blot quantitativo per la titolazione del vettore AAV 2G9 ha due serie di standard e tre diverse quantità di una preparazione del vettore AAV, inclusi 0,3, 0,1 e 0,03 microlitri in duplicato. Le quantità da dosare sul blot sono determinate empiricamente o sulla base di un test preliminare. È stato determinato mediante interpolazione che aliquote di 0,3, 0,1 e 0,03 microlitri del vettore AAV 2G9 avevano in media un titolo di 5,16, 0,27 nanogrammi equivalenti a microlitri.

Tutte le possibili combinazioni di sierotipi affini ed eterologhi delle proteine VP3 cas-pid e AAP di AAV5, AAV9 e AAV di serpente sono state valutate per l'assemblaggio del capside mediante un saggio quantitativo di dot blot. I risultati di questo grafico mostrano che AAV5 VP3 si assembla indipendentemente dal fatto che AAP sia stato fornito in trans. Inoltre, AAP5 e AAP9 possono promuovere l'assemblaggio del capside AAV9 VP3, sebbene AAP5 funzioni in modo meno efficace di AAP9.

Né AAP5 né AAP9 mostrano un'attività di promozione dell'assemblaggio sul serpente AAV VP3 e il serpente AAP promuove solo l'assemblaggio del serpente AAV VP3. È stata applicata un'analisi dot blot per valutare l'attività nucleasica di tre nucleasi disponibili in commercio in condizioni non ottimizzate contenenti impurità derivate da cellule e terreni di coltura. L'enzima A è risultato non attivo come gli altri due enzimi, dimostrando che la scelta della nucleasi potrebbe influenzare significativamente la lettura del test di dot blot.

Questa tecnica è semplice per la quantificazione del vettore AAV e strumentale nella valutazione del ruolo dell'AAP nel promuovere l'assemblaggio di capsidi AAV derivati da sierotipi affini ed eterologhi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un giorno se eseguita correttamente una volta ottenuti i campioni di analisi negli esperimenti di coltura cellulare. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di pipettare con cura il volume di liquido corretto per garantire l'accuratezza quantitativa.

Dopo il suo sviluppo, l'applicazione del saggio quantitativo del dot blot per studiare l'AAP ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dell'AAV per comprendere ulteriormente il meccanismo dell'assemblaggio del capside dell'AAV. Non dimenticate che lavorare con cellule umane, agenti virali, fenolo-cloroformio e materiali radioattivi può essere estremamente pericoloso. E l'uso di camici da laboratorio, guanti e occhiali protettivi è necessario per limitare l'esposizione.

Questi materiali devono essere maneggiati solo in aree approvate. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come preparare i campioni di dot blot per la quantificazione dell'AAV, impostare l'apparato del dot blot, determinare il titolo AAV e applicare la procedura allo studio della biologia dell'AAV. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri saggi come i saggi di trasduzione vettoriale AAV in cellule di coltura per rispondere a ulteriori domande, come il titolo funzionale di vettorializzato rispetto al titolo di particelle fisiche determinato dal saggio di dot blot.