Conseguenze a lungo termine del comportamento e riproduttive di embrionale esposizione alle sostanze tossiche della basso-dose
6 marzo 2018
L'esposizione a sostanze tossiche ambientali possa avere un impatto acutamente sviluppo con effetti a lungo termine. Protocolli dettagliati sono forniti per illustrare una strategia utilizzando un modello di laboratorio efficace per studiare l'effetto di embrionale precoce esposizione al bisfenolo A. Forniamo analisi comportamentale per monitorare l'efficacia della nostra esposizione tossico bio-saggi e fecondità.
L'obiettivo generale di queste procedure è quello di studiare gli effetti a lungo termine dell'esposizione a basse dosi di BPA nell'embriogenesi precoce. Gli embrioni di C. elegans sono esposti al BPA per un periodo limitato e testati al raggiungimento dell'età adulta per la fecondità e il comportamento di apprendimento. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti gli effetti a lungo termine sullo sviluppo dell'esposizione a sostanze tossiche come i bisfenoli e altri composti che alterano il sistema endocrino.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di testare gli effetti a lungo termine e sottili delle sostanze tossiche sullo sviluppo attraverso saggi comportamentali quantitativi su un modello di laboratorio di invertebrati facile da usare. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla comprensione delle basi dello sviluppo e neurali degli effetti deleteri sulla salute dell'esposizione a sostanze tossiche anche a basse dosi. Abbiamo avuto l'idea di questi esperimenti quando ci siamo resi conto che un certo numero di disturbi complessi o multifattoriali sembravano avere una o l'altra componente dello sviluppo.
Il che può esercitare la sua influenza in parte attraverso l'espressione anomala di geni critici. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di assuefazione al tocco interno possono essere difficili da apprendere esclusivamente attraverso istruzioni basate su testo. Il giorno prima della sincronizzazione, trasferire i vermi N2 su piastre da 100 millimetri contenenti terreni NGM, spalmati con E.coli OP50.
Mediante spezzettatura di una lastra di circa un centimetro quadrato. Lascia che i vermi crescano per tre giorni a 20 gradi Celsius. Dopo tre giorni, quando le piastre sono popolate da adulti maturi e ben nutriti contenenti embrioni visibili, iniziare la sincronizzazione lavando prima ogni piastra con cinque millimetri di tampone M9 e trasferendo il liquido in una provetta da centrifuga conica sterile da 15 millilitri.
Centrifugare a 3.000 volte la gravità per quattro minuti a temperatura ambiente. Dopo la certrifugazione, utilizzare una pipetta da dieci millilitri per rimuovere con cura il surnatante da ogni pellet sciolto di vermi adulti. Quindi aggiungere 5 millilitri di soluzione di ipoclorito appena preparata a ciascun pellet di vermi e mescolare delicatamente.
Centrifugare a 3.000 volte la gravità a temperatura ambiente per quattro minuti. È fondamentale ottenere popolazioni sincronizzate. La preparazione di una nuova soluzione di ipoclorito aiuta a evitare la contaminazione e gli animali non sincronizzati.
Quindi, utilizzare una pipetta da dieci millilitri per rimuovere il surnatante e lavare i sette millilitri di tampone M9. Ripetere questo passaggio due volte. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere circa 100 microlitri di tampone M9 alle uova.
Quindi trasferire circa 50 microlitri di uova in provette da microfuge da due millilitri contenenti BPA diluito in tampone S. Regolare la quantità di tampone S per garantire la corretta concentrazione finale di BPA per provetta, come mostrato nella tabella. Posizionare i tubi su un oscillante o agitatore rotante, muovendosi a 25 inclinazioni al minuto, o 25 giri/min per quattro ore a 20 gradi Celsius.
Dopo quattro ore, posizionare le provette nei portaprovette e lasciare che i vermi si depositino. Scartare il surnatante e trasferire i vermi su piastre NGM seminate con OP50 E.coli. Lascia che i vermi crescano per 60 ore a 20 gradi Celsius.
Esaminare le piastre ogni giorno per verificare la presenza di contaminazioni. Le piastre NGM contaminate sono solitamente scolorite e accompagnate da singole colonie. Controlla i vermi al microscopio per il sovraffollamento.
Innanzitutto, utilizzare un plettro di platino calibro 30 sterilizzato al fuoco per trasferire circa dieci giovani vermi adulti sincronizzati su nuove piastre NGM non seminate. Lasciare i vermi indisturbati per cinque minuti per dare loro il tempo di acclimatarsi al nuovo piatto. Quindi sterilizzare un pelo del sopracciglio attaccato all'estremità di uno spiedino di legno o di uno stuzzicadenti immergendolo in etanolo al 70%.
Pulire con un fazzoletto pulito e privo di lanugine e attendere un minuto affinché l'etanolo evapori. Tocca delicatamente il verme sulla testa usando i peli delle sopracciglia. Ripeti i tocchi, lasciando dieci secondi tra i tocchi per consentire al verme di riprendersi.
Continuare a toccare, attendere intervalli di dieci secondi tra gli interstimoli fino a quando il verme non si muove più all'indietro. Registra il numero di tocchi necessari affinché si verifichi questa assuefazione. Consentire un intervallo di dieci secondi tra i tocchi è importante in quanto ciò consente all'animale di recuperare il tempo e aiuta a ottenere saggi coerenti sul comportamento di assuefazione.
Gli animali adulti che sono stati esposti embrionalmente a un micromolare o a una concentrazione superiore di BPA hanno deposto un numero significativamente inferiore di uova rispetto al controllo rappresentato dalla linea orizzontale. Gli animali adulti derivati da embrioni che sono stati esposti a concentrazioni di BPA fino a 0,1 micromolari mostrano deficit non associativi basati sull'aumento del numero di tocchi anteriori necessari per abituarsi. Durante la preparazione degli embrioni per l'esposizione al BPA, è importante scegliere una piastra con adulti di C. elegans ben nutriti con ovuli maturi visibili al microscopio di dissezione per avere una dimensione del campione sufficiente.
Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della tossicologia ambientale per valutare gli effetti delle tossine e di altri composti che alterano il sistema endocrino sul comportamento e progettare esperimenti meccanicistici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come esporre gli embrioni di C.elegans in fase iniziale al BPA e come testare il comportamento di assuefazione negli adulti risultanti derivati dagli embrioni esposti al BPA.
Panoramica
Questo studio analizza gli effetti a lungo termine dell'esposizione a basse dosi di bisfenolo A (BPA) durante l'embriogenesi precoce, utilizzando C. elegans come organismo modello. La ricerca si concentra su saggi di fecondità e comportamentali per valutare l'impatto del BPA sullo sviluppo e sul comportamento.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Tossicologia ambientale
- Biologia dello sviluppo
- Neuroscienze comportamentali
Sfondo
- L'esposizione a tossici ambientali può avere effetti duraturi sullo sviluppo.
- Il BPA è un composto che interferisce con il sistema endocrino e può influenzare l'espressione genica.
- C. elegans è un modello adatto per lo studio degli esiti dello sviluppo e del comportamento.
- Comprendere questi effetti può contribuire ad affrontare disturbi complessi con componenti di sviluppo.
Scopo dello studio
- Studiare gli effetti dell'esposizione precoce all'embrione al BPA.
- Valutare la fecondità e il comportamento di apprendimento negli adulti di C. elegans.
- Fornire un metodo per valutare gli impatti a lungo termine dei tossicanti.
Metodi Utilizzati
- Sincronizzazione di embrioni di C. elegans per un'esposizione controllata.
- Esposizione a concentrazioni variabili di BPA durante l'embriogenesi.
- Saggi comportamentali per misurare l'abituazione e la fecondità negli adulti.
- Dimostrazione visiva dei metodi per facilitare la comprensione dei passaggi procedurali.
Risultati principali
- Gli adulti esposti al BPA hanno mostrato una fertilità ridotta rispetto ai controlli.
- Persino basse concentrazioni di BPA hanno provocato deficit comportamentali nell'abituazione.
- Saggi quantitativi hanno rivelato sottili effetti a lungo termine dell'esposizione al BPA.
- La metodologia consente la valutazione degli impatti dello sviluppo provocati da agenti tossici.
Conclusioni
- Questa tecnica fornisce informazioni sugli effetti degli agenti tossici ambientali sullo sviluppo.
- I risultati contribuiscono alla comprensione della base neuronale degli effetti sulla salute derivanti dall'esposizione ad agenti tossici.
- Lo studio sottolinea l'importanza della valutazione degli impatti di agenti tossici a basse dosi.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente ai team di ricerca e sviluppo biotecnologici di modellare le conseguenze a lungo termine dello sviluppo e del comportamento derivanti da un'esposizione a basse dosi di sostanze che alterano il sistema endocrino, utilizzando un sistema di invertebrati geneticamente manipolabile. Quantificando la fecondità e il comportamento di abituazione in adulti di C. elegans a seguito di esposizione embrionale a sostanze tossiche, il metodo supporta l'identificazione meccanicistica dei rischi associati a composti ambientali nelle fasi iniziali della validazione del bersaglio. Esso fornisce una piattaforma scalabile e quantitativa per valutare segnali di tossicità neurosviluppare e riproduttiva rilevanti per il profilo predittivo di sicurezza.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dei meccanismi tossicologici che influenzano le vie dello sviluppo e le reti di espressione genica correlate alla disregolazione endocrina.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale di bersagli molecolari coinvolti nella riparazione del DNA, nell'apoptosi e nella plasticità neuronale mediante letture fenotipiche.
- Valore predittivo: Produce dati di risposta alla dose per effetti a basse concentrazioni, utili per definire margini di sicurezza dei bersagli e ridurre i rischi delle ipotesi prima dei test sui mammiferi.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Produce endpoint standardizzati e quantificabili (conteggio delle uova, conteggio dei tocchi di abituazione) adatti per lo screening ad alto contenuto di librerie di composti.
- Riproducibilità: La sincronizzazione degli embrioni e l'esposizione controllata garantiscono condizioni di base costanti tra ripetizioni e laboratori.
- Scalabilità: Il modello di invertebrato semplice permette uno screening economico di molteplici concentrazioni di tossine e analoghi strutturali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Modella deficit comportamentali e riproduttivi persistenti derivanti da un danno subito durante lo sviluppo precoce, rispecchiando gli effetti sanitari latenti dei disendocrini.
- Continuità traslazionale: Collega gli eventi molecolari iniziali embrionali agli esiti fenotipici nell'adulto, supportando lo sviluppo del percorso di esito avverso (AOP).
- Valutazione del rischio: Fornisce dati empirici sulle soglie di effetto a basse dosi per informare i calcoli del margine di esposizione e la modellizzazione preclinica del rischio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta, in cui informazioni meccanicistiche ottenute da modelli semplici guidano la selezione delle proteine bersaglio e la priorizzazione dei composti prima di investire in sistemi mammiferi complessi.
- Biologia della scoperta: Verifica ipotesi riguardo alla perturbazione indotta da agenti tossici nelle reti geniche dello sviluppo e nella funzione neuronale, utilizzando parametri comportamentali e riproduttivi misurabili.
- Screening: Fornisce letture quantitative e normalizzate (fecondità, abituazione) che consentono il confronto tra diverse dosi di agenti tossici e tra classi chimiche diverse.
- Analisi: Genera curve dose-risposta per endpoint apicali, utili per la modellizzazione della dose di riferimento e per l'estrapolazione interspecie.
- Ricerca traslazionale: Collega le alterazioni molecolari precoci a modifiche fenotipiche persistenti, facilitando l'identificazione di biomarcatori per la neurotossicità dello sviluppo.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo screening di agenti tossici, applicabile a bisfenoli, ftalati e altri composti attivi sul sistema endocrino nei programmi di salute ambientale.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica collegando l'esposizione embriogenica a deficit funzionali nell'apprendimento e nella riproduzione nell'adulto.
- Valore operativo: Offre un sistema a basso costo, compatibile con metodiche ad alto rendimento e protocolli standardizzati, facilmente adottabili da diversi gruppi di lavoro.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di prosecuzione o interruzione dello sviluppo identificando precocemente composti bioattivi con potenziale tossicità nello sviluppo.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei composti aggiustata in base al rischio, basata sul potenziale di tossicità nello sviluppo, riducendo l'abbandono in fasi avanzate.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione di C. elegans, nella sincronizzazione degli embrioni e nell'osservazione microscopica del comportamento.
- Presuppone l'accesso a incubatori, agitatori orbitali, provette per microcentrifuga e stereomicroscopi per l'esecuzione del saggio tattile.
- Necessita della standardizzazione della preparazione dell'ipoclorito, della durata dell'esposizione e degli intervalli tra gli stimoli per garantire la validità del saggio.
- Richiede considerazioni adattative quando si estende ad altri tossicanti o a ceppi alternativi di nematodi con profili di sensibilità diversi.
- Limitato ai modelli di invertebrati; i risultati richiedono una validazione ortogonale in sistemi di vertebrati per rilevanza regolatoria.
