Rilevamento altamente sensibile e quantitativo delle proteine e loro isoforme dal metodo di messa a fuoco isoelettrica capillare

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca biomedica, come la scoperta di biomarcatori, la scoperta di farmaci, la diagnostica e lo screening di farmaci o anticorpi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è ad alta produttività e può rilevare isoforme proteiche in modo altamente riproducibile. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la diagnosi di molte malattie perché può misurare le proteine colpite o le loro isoforme.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle vie di segnalazione cellulare, può anche essere applicato ad altri sistemi in cui è necessario analizzare proteine specifiche. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto i passaggi di dosaggio sono difficili da imparare a causa dei trucchi, come rimuovere le bolle, caricare la piastra, eccetera. In primo luogo, preparare una miscela di diluente del campione aggiungendo un microlitro di miscela di inibitori DMSO e due microlitri di inibitori della proteasi a 47 microlitri di diluente del campione, in modo che la concentrazione finale di DMSO e inibitori della proteasi sia una X.Diluire lisati proteici precedentemente isolati utilizzando la miscela diluita del campione per ottenere le concentrazioni desiderate.

Successivamente, aggiungere 3.325 microlitri di scala standard, sei microlitri di inibitore della proteasi e tre microlitri di inibitore DMSO a 137.675 microlitri di premix antolite. Vortice il campione almeno 15 secondi e tenere sul ghiaccio. Mescolare le due soluzioni preparate in un rapporto uno a tre in modo che le concentrazioni finali di inibitori della proteasi DMSO e la scala standard del punto isoelettrico siano una X e le proteine nel capillare raggiungano le concentrazioni finali desiderate.

Dopo che le proteine sono state aggiunte alla miscela del campione, tutti i passaggi verranno eseguiti sul ghiaccio o a quattro gradi Celsius. Metti un piatto da 384 po 'sul ghiaccio. Caricare dieci microlitri della miscela di campioni nel pozzo appropriato della piastra, secondo il layout del modello di dosaggio progettato con il software automatizzato del sistema di soffiatura occidentale.

In seguito, diluire gli anticorpi primari e secondari con diluente anticorpale. Quindi, pipetta dieci microlitri di anticorpi primari e 15 microlitri di anticorpi secondari in ogni pozzo. Quindi, mescolare luminol e perossido XDR in un rapporto uno a uno.

Pipetta 15 microlitri del perossido di luminolo si mescolano in ogni pozzo. Una volta aggiunti i campioni e i reagants alla piastra, centrifugare per dieci minuti a 2500 volte G e quattro gradi Celsius per far girare il liquido e rimuovere le bolle. Se le bolle esistono ancora, rimuoverle manualmente utilizzando una punta di pipetta sottile.

Aprire il software di sistema di soffiatura occidentale automatico e fare clic su nuovo dal menu file. Vai al riquadro di layout e assegna posizioni per reagants e campioni nella piastra da 384 pozzi. Fai un compito reagant facendo clic su un pozzo in qualsiasi punto del blocco.

Selezionare un blocco di riga di 12 pozzi ciascuno. Passare quindi alla barra degli strumenti del riquadro di layout e inserire un blocco di righe di esempio, primario, secondario o luminol. Vai al riquadro del protocollo e seleziona una posizione reagant nel piatto.

Quindi, fare clic sulla cella nella colonna di esempio e selezionare il reagant dal menu a discesa. Allo stesso modo, selezionare le posizioni reagant per il primario, secondario e luminol per ogni ciclo. Fare clic sulle cellule una alla volta nella colonna degli anticorpi primari o secondari e, se necessario, modificare i tempi di incubazione.

Quindi, aggiungere cicli facendo clic sul pulsante Aggiungi nella sezione del protocollo. Nel riquadro dei modelli immettere le informazioni relative al campione, ad esempio l'identità degli anticorpi primari e secondari, i numeri di catalogo e le diluizioni. Salvare il nuovo file di dosaggio.

Prima di fare clic sul pulsante start,controlla rapidamente il layout per assicurarti che tutto sia corretto. A questo punto, fare clic su start' per iniziare l'esecuzione. Il software richiederà all'utente di rimuovere i rifiuti, di riempire l'acqua e la scatola capillare, di aggiungere anolite e catolite al vassoio delle risorse, di aggiungere tampone di lavaggio e di caricare la piastra nel vassoio del campione raffreddato.

Una barra di stato dello strumento verrà visualizzata sullo schermo del computer un paio di minuti dopo l'inizio dell'esecuzione. Fare clic nella schermata esegui riepilogo per visualizzare i riquadri di stato e separazione. Per osservare la separazione dell'elettroforesi in un capillare, riprodurre il filmato di separazione per quel capillare facendo clic sul ciclo desiderato e quindi facendo clic sul pulsante di riproduzione nel pannello di controllo.

Aprire il file di esecuzione e selezionare la scheda della schermata di analisi. Fare clic su modifica', quindi su analisi', per modificare l'intervallo di punti isoelettrici. Applicare lo standard del punto isoelettrico appropriato.

Aggiungere un adattamento di picco e aggiungere un nome di picco. Infine, selezionare i dati da utilizzare nella scheda picchi ed esportare i dati per ulteriori analisi. L'elettroferogramma delle chinasi extracellulari fosforilate regolate dal segnale da lisati stimolati dal fattore di crescita endoteliale vascolare è mostrato qui.

C'è un'induzione molto elevata di proteine fosforilate osservate con fattore di crescita endoteliale vascolare. L'inserto mostra il controllo del carico endogeno, HSP 70, che indica un carico simile di campioni sia per campioni non trattati che trattati. In un immunoblot convenzionale, sono state rilevate solo due bande, anche se le proteine della chinasi extracellulare fosforilata regolate dal segnale sono state risolte in quattro picchi mediante analisi di messa a fuoco isoelettrica capillare.

L'elettroferogramma delle chinasi extracellulari regolate dal segnale da lisati stimolati dal fattore di crescita endoteliale vascolare è mostrato qui. L'interno mostra lo stesso controllo di caricamento utilizzato in parallelo. Un'immunoblot convenzionale mostra solo due bande corrispondenti alla chinasi extracellulare regolata dal segnale uno e alla chinasi extracellulare regolata dal segnale due.

Mentre con la messa a fuoco isoelettrica capillare, le proteine della chinasi extracellulari regolate dal segnale sono state risolte in sei picchi, corrispondenti a tutti e quattro i diversi picchi fosforilati e a due picchi non fosforilati. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in poche ore, a seconda del numero di cicli, se viene eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare concentrazioni di anticorpi più elevate rispetto alle immunoblot convenzionali.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto i passaggi di dosaggio sono difficili da imparare a causa di trucchi, come la rimozione di bolle, il caricamento della piastra, eccetera. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come progettare un saggio, preparare campioni, eseguire il saggio e analizzare i dati per osservare diverse isoforme della tua proteina.