Misurazione quantitativa della proteina precursore dell'amiloide γ-secretasi-mediata e la fenditura di Notch in Cell-based Luciferase Reporter Assay piattaforme

L'obiettivo generale di questo saggio quantitativo del gene reporter basato su cellule per la gamma-secretasi è quello di esaminare l'effetto differenziale dei presunti modulatori della gamma-secretasi sulla scissione mediata dalla gamma-secretasi. Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel campo della malattia di Alzheimer, come l'identificazione di nuovi modulatori della gamma-secretasi per il trattamento della malattia di Alzheimer. Il vantaggio di questa tecnica è che si tratta di un sistema di analisi altamente efficiente e che può identificare facilmente i modulatori della gamma-secretasi.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della malattia di Alzheimer attraverso la potenziale scoperta di farmaci anti-AD con effetti collaterali minimi. Questo metodo può fornire informazioni sulla selettività del substrato della gamma-secretasi. Può anche essere applicato agli studi di altre malattie, come il neuroblastoma.

Gli individui che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà con un'attenta rimozione e aggiunta di terreni di coltura cellulare alla micropiastra 96, poiché un disturbo eccessivo può complicare i risultati finali. Iniziare questa procedura con la preparazione di cellule NG e CG, come indicato nel protocollo di testo. Contare le cellule NG o CG con un emocitometro.

Quindi, seminare le cellule a 20.000 cellule per pozzetto su micropiastre da 96 pozzetti a un volume finale di 200 microlitri per pozzetto in terreno di crescita. Trasferire le micropiastre in un incubatore ad anidride carbonica umidificato e incubare a 37 gradi Celsius durante la notte. Dopo l'incubazione notturna, rimuovere 100 microlitri di terreno di coltura da ciascun pozzetto.

Aggiungere 100 microlitri per pozzetto di terreno di crescita contenente due microgrammi per millilitro di tetraciclina con 0,2% di dimetilsolfossido, due micromolari CL-387, 785, due micromolari DAPT o altri inibitori ErbB1/ErbB2 correlati. Incubare le cellule trattate e le micropiastre a 37 gradi Celsius per 24 ore. Dopo l'incubazione, rimuovere 150 microlitri per pozzetto di terreno di coltura dalle micropiastre.

Quindi, aggiungere 50 microlitri per pozzetto di reagente per il dosaggio della luciferasi. Quindi, trasferire le micropiastre in un lettore di micropiastre a luminescenza e mantenerle a temperatura ambiente per cinque minuti. Determinare la luminescenza emessa dalla luciferasi della lucciola utilizzando un programma predefinito memorizzato nel lettore di micropiastre di luminescenza.

Innanzitutto, apri il software di controllo dello strumento. Quindi, dal menu Strumenti, selezionare Luminometria. Nell'impostazione Parametri, scegliere Nessun filtro per il filtro di emissione, selezionare Normale per l'apertura di emissione, inserirne uno per il tempo di conteggio e fare clic su OK per impostare la lettura della luminescenza.

Nella scheda Controllo strumento, scorrere l'elenco dei protocolli attivi e selezionare il protocollo prememorizzato per la lettura della luminescenza. Nella scheda Visualizzazione dal vivo, definire la scala dal menu a discesa e selezionare Logaritmo o Lineare per il tipo. Nella scheda Temperatura, selezionare Off per il riscaldamento della piastra.

Infine, fare clic sul pulsante Start per eseguire la lettura della luminescenza. Esporta i risultati in un foglio di calcolo utilizzando l'Explorer incorporato nel software di controllo. Stimare la luminescenza di fondo da cellule CG o NG trattate con terreno di crescita che non include tetraciclina.

Definire un segnale di luminescenza emesso da cellule CG o NG trattate con DMSO allo 0,1% in terreno di crescita contenente un microgrammo per millilitro di tetraciclina da sola come attività gamma-secretasi relativa al 100%. Infine, normalizzare i segnali della luciferasi dalle cellule CG o NG coltivate con terreno di crescita contenente tetraciclina e CL-387, 785 o DAPT al segnale della luciferasi emesso dalle cellule CG o NG trattate con DMSO. Qui sono mostrati risultati rappresentativi che dimostrano le misurazioni quantitative della scissione della gamma-secretasi di APP-C99 nelle cellule CG.

Le cellule sono state trattate con un micromolare di CL-387, 785 o DAPT in presenza di un microgrammo per millilitro di tetraciclina a 37 gradi Celsius per 24 ore. La luminescenza derivata dalla proteolisi mediata dalla gamma-secretasi di C99-GV è stata quantificata dopo l'aggiunta di 100 microlitri per pozzetto di reagente per il saggio della luciferasi. Il segnale della luciferasi emesso dalle cellule trattate con il solo veicolo è stato impostato come luminescenza relativa al 100%.

Di seguito sono riportati i risultati rappresentativi che dimostrano le misure quantitative della scissione della gamma-secretasi di N-delta-E nelle cellule NG. Allo stesso modo, le cellule sono state trattate con un micromolare di CL-387, 785 o DAPT in presenza di un microgrammo per millilitro di tetraciclina a 37 gradi Celsius per 24 ore. La luminescenza derivata dalla proteolisi mediata dalla gamma-secretasi di N-delta-E-GV è stata quantificata dopo l'aggiunta di 100 microlitri per pozzetto di reagente per il saggio della luciferasi.

Il segnale della luciferasi emesso dalle cellule trattate con il solo veicolo è stato impostato come luminescenza relativa al 100%. Una volta padroneggiata, questa tecnica richiede solo un tempo pratico di una o due ore, in attesa del numero di composti da esaminare. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della malattia di Alzheimer per esplorare il modificatore genetico e chimico della gamma-secretasi alla ricerca di nuove terapie per la malattia di Alzheimer.