Tubercolosi del micobatterio in topi con fluorescenza enzima Reporter di imaging

L'obiettivo generale di questa procedura di imaging a fluorescenza enzimatica reporter è quello di facilitare la rilevazione sensibile e specifica del mycobacterium tuberculosis in modelli animali preclinici per la patogenesi, la terapia e la ricerca sui vaccini. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della tubercolosi, compresi i meccanismi di virulenza delle specie batteriche, nonché la creazione di terapie e la comprensione dei vaccini. Quindi il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di visualizzare lo stesso gruppo di animali in più punti temporali.

Questo riduce notevolmente i costi, ci permette di studiare le interazioni ospite-patogeno e aumenta anche la potenza statistica perché un numero maggiore di animali può essere mantenuto prontamente allo stesso tempo. Per iniziare, coltiva qualsiasi batterio M. tuberculosis in terreno MOADCTW a 37 gradi Celsius a una densità ottica di 0,5 misurata a 600 nanometri. Tutte le procedure che comportano la manipolazione di materiali infettivi devono essere condotte all'interno di cappe di biosicurezza o di altri dispositivi di contenimento fisico approvati.

Una volta pronto, fare una serie da una a 10 diluizioni della coltura nello stesso terreno. Quindi, piastra le diluizioni in triplicato su piastre 7H11 selettive per determinare con precisione l'UFC. Incubare le piastre per quattro settimane a 37 gradi Celsius o fino a quando le colonie possono essere contate con precisione per determinare l'UFC.

Prima di impostare un'inoculazione, assicurarsi sempre che la cappa di biosicurezza fluisca aria a 50 litri al minuto. Per preparare un inoculo in grado di infettare fino a 90 topi, misurare la CFU desiderata in una provetta di falco da 15 millilitri. In genere vengono utilizzati tra 10.000 e 1 milione di UFC.

Quindi pellettare i batteri. Quindi lavare i batteri una volta con 10 millilitri di soluzione fisiologica. Quindi sospenderli in 15 millilitri di soluzione fisiologica.

Quindi, in una cappa di biosicurezza, caricare l'inoculo in un barattolo di vetro che può essere collegato a un nebulizzatore. Quindi collegare l'unità nebulizzatore e regolare il tubo verticale in acciaio inossidabile in modo che l'estremità inferiore si trovi circa un quarto di pollice sotto il menisco della sospensione. Trasferire ora il gruppo nella camera di inoculazione in un contenitore di trasporto a tenuta stagna.

Per procedere, caricare gli animali di peso noto nella camera di inoculazione potenziata. La camera può ospitare fino a 90 topi. Quindi chiudere tutti i fermi della porta.

Quindi collegare il nebulizzatore utilizzando un morsetto in acciaio. Quindi premere il pulsante di avvio sulla camera. E imposta la portata d'aria tra tre e cinque litri al minuto.

L'aria compressa fluirà a circa 22-26 libbre per pollice quadrato e, soprattutto, dovrebbe essere possibile vedere la nebbia dell'inoculo nella camera. Dopo 15 minuti, apparirà una luce rossa sulla parte anteriore del pannello di controllo e un segnale acustico indicherà la fine della corsa. Quindi premere il pulsante di ripristino per azzerare i timer.

Per rilasciare il vuoto, premere il piccolo pulsante rosso sullo sportello della camera. Quindi apri la porta della camera e riporta i topi nelle loro gabbie domestiche. Andando avanti, tieni gli animali nella stanza di contenimento.

Quindi rimetti il barattolo e il contenitore per il trasporto nell'armadio di biosicurezza. Lì, gettare la sospensione batterica rimanente in un contenitore per rifiuti designato. Quindi posizionare il barattolo del nebulizzatore usato all'interno di un sacchetto a rischio biologico e sigillare il sacchetto per il trasporto in autoclave.

Per pulire la camera, spruzzare le superfici interne con fenolo tamponato ed etanolo al 70%. Lasciare che queste soluzioni reagiscano su quelle superfici per 10 minuti. Quindi puliscili accuratamente.

Smaltire tutte le salviette nella spazzatura a rischio biologico. Quindi sterilizzare in autoclave la spazzatura, il contenitore dei rifiuti e i barattoli del nebulizzatore usati. Trasferire gli animali nella sala di imaging.

Lì, anestetizzare un animale secondo il protocollo di testo e iniettarlo con substrato di contrasto mediante iniezione intraperitoneale. Nel software del sistema di imaging, inizializzare il sistema e procedere quando la barra della temperatura diventa verde. Dopo aver inizializzato il sistema, posizionare il mouse nella camera di imaging.

Assicurati che le sue narici siano all'interno del cono del naso in modo che riceva l'anestetico durante l'imaging. Ora torna al computer. Nel pannello di controllo dell'acquisizione, selezionare la fluorescenza, la transilluminazione, per la visualizzazione dell'intero animale, o l'epi-illuminazione per visualizzare i tessuti polmonari.

Per un singolo mouse, impostare il campo visivo su B e il livello della lampada su alto. Per l'esposizione, utilizzare il tempo automatico, il binning medio e due o tre per l'F/Stop. Quindi impostare il filtro di eccitazione a 745 nanometri e i filtri di emissione da 780 a 840 nanometri.

Quindi vai alla configurazione della sequenza e seleziona da nove a 12 punti di transilluminazione nell'area di interesse. Ora premi il pulsante di acquisizione per raccogliere le immagini. L'analisi delle immagini è trattata nel protocollo di testo.

Per analizzare l'entità dell'infezione, sopprimere il topo utilizzando pentobarbital di sodio. Assicurati di controllare la presenza di un riflesso del pedale per assicurarti che l'animale sia soppresso. E poi espiantare i polmoni usando una dissezione standard.

Successivamente, omogeneizzare il tessuto polmonare in un millilitro di PBS. Quindi eseguire una diluizione seriale di dieci volte dell'omogenina utilizzando PBS. Placcare l'omogeneità diluita in triplicato e incubare la piastra a 37 gradi Celsius fino a quando non è possibile contare le colonie.

Quindi utilizzare il punteggio CFU per misurare la gravità dell'infezione. I topi sono stati trattati come descritto. Un substrato REF è stato utilizzato per visualizzare la progressione di M. tuberculosis.

La fluorescenza è stata quantificata utilizzando la transilluminazione. Ed è aumentato dalla seconda alla sesta settimana nei topi infetti. Il leggero calo del segnale nei topi di controllo potrebbe essere attribuito all'aumento della massa corporea e del volume durante il periodo di sei settimane.

La ricostruzione 3D FLIT delle sorgenti di fluorescenza è stata realizzata da più punti di transilluminazione utilizzando la stessa eccitazione e serie di filtri di emissione. Sono state realizzate mappe di efficienza NTF per verificare la qualità della ricostruzione. L'immagine prelevata dallo specifico filtro di eccitazione è stata normalizzata all'immagine di trasmissione realizzata con lo stesso filtro di emissione e un filtro di eccitazione aperto.

Questo fornisce un segnale prodotto dal solo substrato. Non c'è stato quasi nessun errore nella ricostruzione. L'esame dell'efficienza NTF dei dati sia nella vista orizzontale che in quella verticale ha mostrato una stretta correlazione.

Quindi la ricostruzione 3D aveva pochi artefatti, una migliore localizzazione del segnale e una migliore sensibilità rispetto ad altri metodi. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della tubercolosi per esplorare l'efficacia terapeutica dei farmaci contro il micobatterio tubercolosi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come infettare i topi per via aerosol con il mycobacterium tuberculosis con l'imaging ottico di follow-up utilizzando il substrato REF.