Name: Tubercolosi del micobatterio in topi con fluorescenza enzima Reporter di imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Scopri l'imaging con fluorescenza enzimatica reporter per rilevare Mycobacterium tuberculosis nei topi. Questo metodo consente studi longitudinali sulle interazioni ospite-patogeno e sullo sviluppo di terapie.

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Gli studi sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e regolamenti stabiliti dall'istituzionale Animal Care e uso Comitato della Texas A & M University. Revisione e approvazione da un ufficiale di sicurezza biohazard o comitato presso il vostro Istituto può essere richiesti.
Attenzione: Tutte le procedure richiedono BSL3 contenimento. Il personale sono tenuto a indossare dispositivi di protezione individuale in ogni momento. Tutte le manipolazioni vengono eseguite all'interno il gabinetto di biosicurezza (BSC) e tutti i diesis sono smaltiti in contenitori. Superfici di lavoro e BSC sono puliti con tamponata etanolo fenolo e 70% prima di iniziare il lavoro e dopo il lavoro. Le procedure normalmente sarebbero stato fatto a livello di biosicurezza 3 con il Mycobacterium tuberculosis, ma per l'illustrazione e scopi delle riprese, gli autori dimostrano queste procedure a livello di biosicurezza 2 con batteri meno virulenti.
1. ceppi e condizioni della coltura
Nota: Ceppo di M. tuberculosis CDC1551 è utilizzato in questo studio, ma qualsiasi ceppo di M. tuberculosis può essere utilizzato nello stesso modo.
<ol><li>Crescere i batteri in M-OADC-TW (7h 9 brodo completato con glicerolo 0,5%, destrosio 10% acido oleico complessa senza catalasi e 0.05% Tween-80) media in piedi a 37 ° C per un OD600 di 0,5 (~ 0.2 x 107 CFU).</li>
	<li>Diluire la cultura in M-OADC-TW (serie di 01:10 diluizioni dei batteri). Piastra le diluizioni dei batteri (105, 106, 107, 108) in triplice copia sul selettivo 11 piastre 7 H per consentire la determinazione di CFU.</li>
	<li>Incubare le piastre per quattro settimane a 37 ° C o fino a quando non possono essere accuratamente contate le colonie.</li>
	<li>Centrifugare l'inoculo batterico a 8.534 x g per 5 min ottenere una pallina. Lavare la pallina una volta con 10 mL di soluzione fisiologica (0,9% NaCl) e risospendere il pellet in 15 mL di soluzione fisiologica (0,9% NaCl).</li>
</ol>2. l'infezione aerosol dei topi utilizzando una camera di Madison
<ol><li>Consentire topi raggiunga il nuovo ambiente per una settimana.</li>
	<li>Pesare i topi prima di caricarli nella camera.</li>
	<li>Inserire tre cavi nella ciabatta: il potere della camera principale, la pompa del vuoto e il compressore d'aria, in quell'ordine.</li>
	<li>Svitare con cura il barattolo di vetro. Portare il vaso di vetro per la biosicurezza e aggiungere l'inoculo di sfida sospesa in 15 mL di soluzione fisiologica (0,9% NaCl) per raggiungere ~ 104 - 106 CFU di batteri nei polmoni.</li>
	<li>Chiudere il coperchio del vaso di vetro nella cappa di biosicurezza. Collegare il vaso a unità nebulizzatore e regolare il tubo verticale in acciaio, in modo che l'estremità inferiore (assunzione) è circa un quarto di pollice sotto il livello del fluido nel vaso.</li>
	<li>Tutti gli animali necessari per l'esperimento (la camera può contenere fino a 90 topi) nel vano di carico e chiudere tutti i fermi sulla porta.</li>
	<li>Verifica principale (camera) Misuratore di flusso aria. Assicurarsi che il centro del galleggiante (palla) eseguito circa 50 L/min come misurato sulla scala di sinistra.</li>
	<li>Premere il tasto Start sul pannello di controllo della camera. Impostare la velocità di flusso d'aria attraverso il misuratore di portata aria compressore (il metro più piccolo a sinistra) come 4 L/min sulla scala. Controllare visivamente per assicurarsi che l'inoculo di sfida è essere nebulizzato.</li>
	<li>Dopo 15 min, quando appare la luce rossa sulla parte anteriore del pannello di controllo e un segnale acustico indica la fine della corsa, premere il pulsante Reset in basso a destra del pannello di controllo di azzerare il timer.</li>
	<li>Tenere premuto il pulsantino rosso sulla porta della camera per rilasciare il vuoto.</li>
	<li>Aprire la porta della camera e rimuovere gli animali. Posizionare i topi indietro nelle loro gabbie.</li>
	<li>Togliete il vaso del nebulizzatore di vetro e mettere in un contenitore di trasporto sigillata, a tenuta stagna. Posizionare il contenitore all'interno del cabinet di bio-sicurezza e scartare la sospensione di sfida in un contenitore per rifiuti designato.</li>
	<li>Posizionare il vaso di nebulizzatore usato all'interno di un sacchetto di biohazard e sigillare il sacchetto per il trasporto all'autoclave.</li>
	<li>Al termine della procedura l'infezione, spruzzare all'interno della camera di etanolo fenolo e 70% tamponata e fare la camera a riposare per 10 min.</li>
	<li>Quindi, pulire molto accuratamente tutte le superfici interne accessibili. Smaltire tutti gli asciugamani di carta contaminati, ecc. nel cestino biohazard. Autoclave nel Cestino, contenitore per rifiuti e utilizzato nebulizzatore vasetti.</li>
	<li>Sistemare gli animali torna nella camera di contenimento fino al punto di tempo imaging.</li>
	<li>Il giorno dell'imaging, è possibile trasferire gli animali in un contenitore secondario alla camera imaging.</li>
</ol>3. animale anestesia
<ol><li>Anestetizzare i topi con isoflurano utilizza un sistema di anestesia di gas su misura.</li>
	<li>Pesare ognuna della due cartuccia filtro carbone situato sopra l'apparecchio di anestesia.</li>
	<li>Sostituire con una nuova cartuccia se il peso è di 50 g sopra il peso iniziale.</li>
	<li>Controllare l'apparecchio vaporizzatore per garantire sufficiente isoflurano per la procedura.</li>
	<li>Collocare il supporto del cono di naso all'interno della camera di formazione immagine. Inserire il numero di coni di naso necessaria per la procedura e sigillare le aperture rimanenti con i bloccanti del cono di naso.</li>
	<li>Accendere l'alimentazione di ossigeno dal cilindro ad alta pressione e impostarlo a 55 psi.</li>
	<li>Accendere la pompa di evacuazione situata di fronte l'unità di anestesia e impostarlo a 8 L/min.</li>
	<li>Accendere il commutatore di ossigeno che si trova di fronte l'unità di anestesia.</li>
	<li>Attivare il flusso di gas alla camera di induzione di anestesia per impostare il flusso del gas a 1,5 L/min Disabilita il flusso del gas.</li>
	<li>Attivare il flusso di gas alla camera di formazione immagine per impostare il flusso del gas a 0,25 L/min Disabilita il flusso del gas.</li>
	<li>Accendere il vaporizzatore di isoflurano e impostarla a 2-2,5%. Regolare il livello di isoflurane secondo il numero e il peso degli animali essendo utilizzati per l'esperimento ruotando la manopola sul vaporizzatore di isoflurane (2-2,5% per un mouse pesa ~ 20 g; 4% per una cavia di un peso di 300 g).</li>
	<li>Posizionare i topi in camera di anestesia e chiudere il coperchio. Attivare il flusso del gas nella camera di induzione di anestesia.</li>
	<li>Lasciare i topi nella camera di induzione di anestesia per 5-10 minuti fino a quando completamente anestetizzato.</li>
	<li>Una volta che i topi sono anestetizzati, applicare una pomata ottica agli occhi per proteggerli durante la formazione immagine.</li>
	<li>Disporre i topi in decubito sternale o ventrale in modo tale che i nasi sono collocati nel cono di naso per facilitare l'anestesia dei topi durante la procedura di imaging.</li>
</ol>4. imaging di fluorescenza (REF) enzima reporter
<ol><li>Iniettare il substrato (20 µM, 2,5 µ l/g di peso) di iniezione intraperitoneale in infetti, come pure i topi di controllo. I topi sono sotto anestesia all'interno della camera imaging per meno di 1 min.</li>
	<li>Avviare il sistema di imaging.</li>
	<li>Inizializzare il sistema facendo clic su Inizializza. Attendere che la barra di temperatura diventa verde. Nota: La camera imaging è costituito da una piattaforma riscaldata per mantenere la temperatura corporea dell'animale durante la formazione immagine.</li>
	<li>Per l'imaging di impostazione di acquisizione, selezionare fluorescenti | Trans-illuminazione per animale intero o Epi-illuminazione per tessuti polmonari, struttura e sovrapposizione nel pannello di controllo di acquisizione.</li>
	<li>Campo di vista impostata B per singolo mouse e livello di lampada ad alto.</li>
	<li>Impostare il tempo di esposizione di auto, binning medie, 2-3 per il f/stop e filtro di eccitazione a 745 nm ed emissione filtri da 780 nm a 840 nm.</li>
	<li>Per l'installazione di sequenza, fare clic sulla sequenza di installazione, selezionare punti di Trans-illuminazione di 9-12 nell'area del polmone.</li>
	<li>Fare clic su Acquisisci per acquisizione di immagini.</li>
	<li>Inserire il mouse post-l'imaging gabbia.</li>
	<li>Monitorare i topi fino a completamente recuperato o sacrificare per quantificare CFU se imaging presso un punto di tempo dell'esperimento. Eseguire un punteggio di Karnofsky modificato per monitorare il benessere dei topi post-imaging.</li>
</ol>5. analisi di REF imaging
<ol><li>Aprire il software di imaging.</li>
	<li>Caricare i file immagine facendo clic sull'icona Sfoglia.</li>
	<li>Per unmixing spettrale, fare clic su Spectral Unmixing nella tavolozza degli strumenti e fare clic sugli spettri per unmix necessaria. Fare clic su start unmixing.</li>
	<li>Per la ricostruzione della superficie ottica, clicca sulla topografia di superficie.</li>
	<li>Selezionare l'orientamento alla dorsale, soggette a mouse pelliccia e, fare clic su genera superficie.</li>
	<li>Ritagliare l'immagine e imposta immagine di soglia per una regione di interesse. Fare clic su Chiudi.</li>
	<li>Per la registrazione dell'organo, vai alla scheda di registrazione in 3D dal menu a discesa di strumenti ottici.</li>
	<li>Registro di organi di interesse in un Atlante di organo.</li>
	<li>Regolare la dimensione dell'organo o posizione alla topografia superficiale generata utilizzando strumento di trasformazione inserita/disinserita situato sugli strumenti pannello-registrazione.</li>
	<li>Vai alla tomografia fluorescente (FLIT) ricostruzione 3D e selezionare analizzare sulla scheda e selezionare le immagini per essere inclusi per analisi, tipo all'efficienza di trasmissione fluorescenza normalizzata (NTF) immagine, fare clic su Start.</li>
	<li>Verifica su Seleziona tutto e ricostruire nella scheda Anteprima dati.</li>
	<li>Per la quantificazione di fluorescenza, vai strumenti regione di interesse (ROI), di aggiungere cubo ROI all'organo di interesse e regolare le dimensioni del cubo per coprire l'organo di interesse. Fare clic su misura 3D ROIs.</li>
	<li>Nella finestra di misurazione del ROI, vai a misure ROI 3D, selezionare il tipo di dati all'unità di voxel e misurazioni di fonte a pmolM-1cm-1.</li>
	<li>Salvare e/o esportare il risultato di analisi FLIT ricostruzione 3D in un file di dati o di figura.</li>
</ol>6. quantificazione dei batteri di CFU
<ol><li>Eutanasia i topi tramite l'iniezione intraperitoneale di 0,1 mL sodio pentobarbital (390 mg/mL).</li>
	<li>Controllo per pedale riflesso comprimendo le pastiglie dei piedi dei topi per accertarsi che non vi è nessuna reazione riflessa.</li>
	<li>Explant il tessuto polmonare da topi con delle forbici, pinze sterili. Omogeneizzare il tessuto polmonare in 1 mL di tampone fosfato salino (PBS): 1x.</li>
	<li>Effettuare diluizioni seriali 10 volte dell'omogeneato del polmone in PBS 1X sterile.</li>
	<li>Per la placcatura, spot tre aliquote di 20 µ l della diluizione rispettiva sulla piastra di agar.</li>
	<li>Incubare le piastre in un incubatore a 37 ° C e monitor per la crescita batterica.</li>
	<li>Conteggio delle colonie in ogni spot dopo il tempo di incubazione e rapidi come CFU / mL correggendo per volume e diluizione utilizzando la seguente equazione: CFU / mL = (C/V) x M Dove C = conteggi di Colonia per spot, V = volume di campione inoculato su ogni piatto (mL) e M = fattore di moltiplicazione (reciproco della diluizione utilizzata). Nota: Se vengono contate le 11 colonie in uno spot per un volume di campione di 0,002 mL ad una diluizione del campione di 10-4, utilizzando l'equazione, il conteggio delle colonie sarà calcolato come (11/0,02) x 104 = 5.5 x 106 CFU / mL</li>
</ol>

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Quando si utilizza tecniche di imaging, quali REF, non ci sono strategie chiave che consentono la generazione di dati affidabili e coerenti. Imaging ottico produce luce diffusa nei tessuti che possono influenzare la profondità di penetrazione, dato che è difficile da catturare la luce emessa in tutte le direzioni. Uso di un fluoroforo infrarosso vicino (NIR) substrato per REF imaging avendo una lunghezza d'onda di eccitazione e di emissione in Querange di 700-900 nm facilita l'assorbimento minimo del segnale fluorescente da tessuti di mammiferi. Il substrato personalizzato progettato fu costruito collegando un fluoroforo NIR, IRDye 800Cw a un quencher, QC IRDye-1, da un anello di lattame permettendo tempra basati sul trasferimento di fluorescenza risonanza energia. IRDye ha tessuto eccellente penetrazione e le caratteristiche di dispersione della luce e non ha alcun effetto nocivo evidente su mammiferi36, viene eliminato dal sangue e organi da 24 h. fluorescenza segnale significativamente aumenta cominciano 4 h dopo amministrazione di substrato, raggiungendo maximal livelli 6 h dopo la somministrazione.
La dose infettiva batterica, modalità di somministrazione della dose infettante e il substrato così come tempo-punti di imaging post infezione eseguendo studi pilota dovrebbe essere standardizzata prima di intraprendere grandi e complessi, esperimenti. Studi pilota possono ridurre notevolmente i tempi e i costi quando un gran numero di animali di imaging poiché una procedura standard può essere ottimizzata prima di fare l'esperimento chiave. Batteriche carichi dovrebbero essere determinati in organi/tessuti di interesse seguendo imaging di tutto il corpo utilizzando trans-illuminazione ed ex vivo formazione immagine del polmone usando epi-illuminazione per convalidare l'origine del segnale e determinare la qualità di correlazione con numeri batterici presenti8. Studi pilota fornirà approfondimenti la soglia di rilevazione, gamma dinamica della tecnica nonché la determinazione delle condizioni sperimentali ottimali per l'imaging.
I vantaggi principali dell'utilizzo di REF imaging come rispetto ad altre strategie di fluorescente e bioluminescenti sono sua alta sensibilità e abilità all'immagine naturale M. tuberculosis ceppi. REF imaging utilizza l'enzima cataliticamente robusto BlaC che è conservata in tutti gli isolati clinici di M. tuberculosis e ceppi di tubercolosi-complesso. La grande sensibilità di REF imaging è a causa del rapido tasso catalitico di BlaC in combinazione con conservazione del prodotto fluorescente fenduto dalla cellula ospite. Continuamente il segnale aumenta fino a quando il substrato è disponibile con conseguente accumulo quasi illimitata del segnale all'interno delle cellule infettate e tessuti. Questa maggiore sensibilità di REF imaging come rispetto ad approcci alternativi di imaging permette di rilevazione specifica di M. tuberculosis entrambi in vitro e in vivo8,23,24, 29.
REF di imaging può essere utilizzato per il rilevamento di batterico senza modificazioni genetiche che permette la sua applicazione diretta a qualsiasi modello di infezione, di animali o laboratorio8,37 o materiali clinici umani29,38 . REF può essere utilizzato per rilevare e immagine una vasta gamma di agenti patogeni39,40, poiché substrati fluorogenici possono essere sviluppati per numerosi obiettivi enzimatici oltre a BlaC come proteasi, chinasi, ureases e β-galattosidasi. Tuttavia, attenzione dovrebbe pensare alla destinazione al fine di garantire Visualizza caratteristiche ottimali per l'imaging. BlaC rappresenta un enzima buon modello per caratteristiche che garantiranno la riuscita applicazione di questa strategia. REF imaging fornisce una lettura immediata sulla carica batterica presente nei polmoni durante le infezioni, che accelera notevolmente i progressi nello studio della patogenesi di tubercolosi, poiché la determinazione dei numeri batterici normalmente richiede tre-sei settimane, ma anche in più rapida crescita organismi questo approccio vi farà risparmiare moltissimo tempo. REF potrebbe anche essere utilizzato per discriminare carcinomi da tubercolosi, un problema chiave nella diagnosi delle lesioni nodulari in pazienti41,42. REF serve come un nuovo strumento per accelerare la formazione immagine traslazionale tubercolosi e può essere applicato anche agli esseri umani, consentendo potenzialmente rapido pronostico dei risultati terapeutici.

Il tasso di crescita lenta di M. tuberculosis è un ostacolo importante nella diagnosi rapida di tubercolosi1,2,3. Mentre la cultura basata diagnosi vogliono settimane per produrre risultati, vetrino ha limiti diagnostici4 bambini5 e pazienti co-infetti con virus dell'immunodeficienza umana6,7. Tecnologie di imaging ottiche sono stati recentemente riconosciute come un'alternativa ai tradizionali metodi diagnostici per la tubercolosi8,9. Fluorescenza e bioluminescenza può essere utilizzati per immagine otticamente M. tuberculosis in animali vivi in tempo reale10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19. Imaging ottico ha il vantaggio di una valutazione rapida e specifica di un'infezione con la tubercolosi di M.20,21,22.
Delineiamo dettagli per imaging ottico di M. tuberculosis in topi dal vivo utilizzando REF. Questo metodo è molto sensibile e specifico23,24 e, simile ad altri metodi ottici, è meno costoso rispetto ad altri metodi di imaging25, compreso tomografia computata (CT)26, magnetica la tubercolosi (TB) resonance imaging (MRI)27e F-fluorodesossiglucosio tomografia a emissione di positroni/CT (F-FDG PET/CT)28. REF utilizza personalizzati substrati fluorescenti o bioluminescenti che al momento della scissione di un enzima batterico, producono un prodotto fluorescente8,29. Quindi, ha il vantaggio di non richiedere un reporter micobatterica ricombinante ceppo30,31. Il substrato FRET descritto è composto di un fluorocromo e un quencher collegati da un anello β-lattamico che viene idrolizzato dalla BlaC (β-lattamasi), naturalmente costitutivamente espresso da tubercolosi-complesso Mycobacterium8, 32. i batteri direttamente generano segnale a causa di attività catalitica REF che permette l'amplificazione di molti ordini di grandezza e rivelazione sensibile di M. tuberculosis.
Il substrato REF utilizzato in questo studio ha tessuto eccellente penetrazione negli animali vivi e ridotto sfondo a causa della sua lunghezza d'onda. Con questo substrato di lunghezza d'onda è possibile raggiungere una soglia di rilevazione per M. tuberculosis di quasi 100 Colonia formando unità (CFU) in vitro e < 1000 CFU nei polmoni dei topi in vivo (animale intero)8, 33. REF può essere utilizzato come strumento diagnostico per espettorato, materiali clinici ed anche direttamente in pazienti con micro sistemi endoscopici16,32,33,34 dovuto la sua alta sensibilità e specificità. REF può essere applicato a qualsiasi ceppo clinico di tubercolosi, perché utilizza un enzima batterico prodotto naturalmente, BlaC, per rilevazione presente in tutti i ceppi. Queste caratteristiche rendono REF imaging in generale uno strumento prezioso nella ricerca pre-clinica tubercolosi per facilitare terapeutico e valutazione del vaccino, nonché analisi della patogenesi, ma anche, in definitiva, possono essere applicate alla diagnosi di tubercolosi pazienti.

<table><tbody><tr><td>Isoflurano</td><td>VETONE</td><td>501027</td><td></td></tr> CNIR800 <tr><td>Soluzione Fatal Plus</td> sintetizzata <td></td> su misura Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd <td></td><td></td></tr><tr><td>7H9 Brodo di Middlebrook</td><td>BD</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>OADC Arricchimento di Middlebrook</td><td>BD</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> Sporcidina RE-1284F <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7H11 Middlebrook Agar</td><td>BD</td><td>212203</td><td></td></tr><tr><td>Madison Camera</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>XGI-8-gas Sistema di anestesia</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Software di imaging</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coni nasali trasparenti</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M. tubercolosis ceppo CDC1551</td><td>topi</td> femmina ATCC <td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/C, 5-7 settimane</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tubercolosi del micobatterio in topi con fluorescenza enzima reporter di imaging

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Fluorescenza di enzima reporter (REF) utilizza substrati specifici per enzimi presenti negli organismi bersaglio di interesse per formazione immagine o rilevazione di fluorescenza o bioluminescenza. Utilizziamo BlaC, un enzima espresso costitutivamente da tutti i ceppi di M. tuberculosis . REF permette rapida quantificazione dei batteri nei polmoni dei topi infettati. Lo stesso gruppo di topi possa essere imaged in molti punti di tempo, notevolmente riducendo i costi, l'enumerazione dei batteri più rapidamente, permettendo osservazioni romanzo nelle interazioni ospite-patogeno e aumentando il potere statistico, poiché più animali per gruppo sono facilmente mantenuti . REF è estremamente sensibile a causa della natura catalitica del reporter enzimatica BlaC e specifico a causa del trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza personalizzato (FRET) o substrati fluorogenici utilizzati. REF non richiedono ceppi ricombinanti, garantendo interazioni ospite-patogeno normale. Descriviamo l'imaging dell'infezione di tubercolosi del M. usando un substrato FRET con emissione massima a 800 nm. La lunghezza d'onda del substrato permette imaging sensibile dei tessuti profondi nei mammiferi. Ci illustrerà l'infezione aerosol dei topi con M. tuberculosis, anestesia dei topi, l'amministrazione del substrato REF e imaging ottico. Questo metodo è stato applicato con successo alla valutazione di efficacia di antibiotici targeting per M. tuberculosise interazioni ospite-patogeno.

REF imaging dei topi infettati con la tubercolosi di M. insieme a controllo non infetti del mouse sono mostrati in Figura 1A. I topi infetti ha prodotto una significativamente (P = 0,0057) segnale di fluorescenza maggiore dai polmoni alle post-infezione 6 settimane, rispetto al controllo sulla gestione di substrato. Un corso tipico di tempo per studiare l'efficacia terapeutica contro M. tuberculosis mediante REF potrebbe essere imaging in settimana 1, 2, 4, 6, 15, 24 post-infezione. L'intensità di fluorescenza è quantificato utilizzando epi-illuminazione per tessuti polmonari (Figura 1B). Il segnale costantemente crescente dalla settimana 2 alla settimana 6 nei polmoni dei topi infettati suggerisce che REF è stato in grado di rilevare M. tuberculosis in vivo. Un calo del segnale di fondo dei topi di controllo in un secondo tempo (Figura 1B) potrebbe essere attribuito all'aumento nel corpo massa e volume dei topi in un periodo di 6 settimane, riducendo in tal modo la penetrazione di lunghezza d'onda di eccitazione. Ricostruzione 3D di FLIT delle fonti di fluorescenza in topi infettati con M. tuberculosis è rappresentato in Figura 2A. Le sequenze di immagini vengono acquisite in più punti trans-illuminazione del mouse utilizzando la stessa eccitazione e la serie di filtri di emissione. Queste sequenze di immagini vengono quindi utilizzate per la ricostruzione 3D di fuga alla CHETICHELLA per distribuzione sorgente fluorescente all'interno del soggetto animale. Figura 2 A-D di seguito viene illustrato le diverse direzioni (coronali, sagittali e transaxial) di tomografia del mouse con la registrazione dell'organo polmone. Efficienza NTF mappe per controllare la qualità di ricostruzione sono rappresentati in Figura 2,E. NTF permette di sottrarre le perdite di luce di sfondo dalle immagini di trans-illuminazione attraverso un'immagine supplementare catturata con filtro a densità neutra. L'immagine presa con il filtro di eccitazione specifico (Figura 2E-misurato) è normalizzato all'immagine di trasmissione misurata con lo stesso filtro di emissione e un filtro di eccitazione aperta (Figura 2E simulato) per dare il segnale prodotto dal substrato da solo. Il simile misurato e simulato il profilo di efficienza NTF in sia orizzontale (Figura 2,F) e verticale (Figura 2G) profili con quasi 0% percentuale di errore (Figura 2E-% errore) fornisce la prova di una ricostruzione 3D di buona qualità con riduzione artefatti e localizzazione del segnale migliorata e sensibilità.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig1.jpg"> Figura 1 . Imaging di M. tuberculosis con rif. (A) in vivo imaging dei topi non infetti e infettati con la tubercolosi di M. a 2, 4 e 6 settimane post-infezione. La barra dei colori rappresenta l'intensità del segnale fluorescente in fotoni al secondo per cm2 da basso (giallo) a alta (rosso). (B) quantificazione dell'intensità di fluorescenza da topi infettati con M. tuberculosis. Valori di fluorescenza per entrambi controllo (nero) e infetto (rosso) è rappresentato insieme all'errore standard per ogni punto di tempo. Il significato dei risultati è stato determinato da studenti t-test, i valori di p del &lt; 0,05 sono stati considerati significativi. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56801/56801fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig2.jpg"> Figura 2 . 3D FLIT ricostruzione delle sorgenti di fluorescenza in topi infettati con M. tuberculosis. Tomografia del mouse rappresentata in direzioni diverse; A) coronale, B) sagittale e C) transaxial con registrazione dell'organo D) del polmone. La regione di interesse (ROI) 3D è rappresentata come un cubo rosso nel polmone per misurazioni di origine. (E) efficienza NTF mappe di misurato e simulato per verificare la qualità di ricostruzione. Il profilo di efficienza misurato e simulato NTF è stato confrontato, providing di buona qualità di ricostruzione 3D (efficienza simile misurato e simulato NTF). Segnale verticale orizzontale F) e G) profili che rappresentano misurato (blu) e simulata la curva di efficienza NTF (rossa). Le barre orizzontali e verticali rosse indicano la posizione di origine. La barra dei colori rappresenta l'intensità del segnale fluorescente in fotoni al secondo per cm2 da basso (blu) a alta (rosso). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56801/56801fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Descriviamo l'imaging ottico dei topi infettati con la tubercolosi del micobatterio (M. tuberculosis) usando la fluorescenza di enzima reporter (REF). Questo protocollo facilita la rilevazione sensibile e specifica di M. tuberculosis in modelli animali preclinici per la ricerca di patogenesi, terapeutica e vaccino.

Tubercolosi del micobatterio in topi con fluorescenza enzima Reporter di imaging

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

L'obiettivo generale di questa procedura di imaging a fluorescenza enzimatica reporter è quello di facilitare la rilevazione sensibile e specifica del mycobacterium tuberculosis in modelli animali preclinici per la patogenesi, la terapia e la ricerca sui vaccini. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della tubercolosi, compresi i meccanismi di virulenza delle specie batteriche, nonché la creazione di terapie e la comprensione dei vaccini. Quindi il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di visualizzare lo stesso gruppo di animali in più punti temporali.Questo riduce notevolmente i costi, ci permette di studiare le interazioni ospite-patogeno e aumenta anche la potenza statistica perché un numero maggiore di animali può essere mantenuto prontamente allo stesso tempo. Per iniziare, coltiva qualsiasi batterio M. tuberculosis in terreno MOADCTW a 37 gradi Celsius a una densità ottica di 0,5 misurata a 600 nanometri. Tutte le procedure che comportano la manipolazione di materiali infettivi devono essere condotte all'interno di cappe di biosicurezza o di altri dispositivi di contenimento fisico approvati.Una volta pronto, fare una serie da una a 10 diluizioni della coltura nello stesso terreno. Quindi, piastra le diluizioni in triplicato su piastre 7H11 selettive per determinare con precisione l'UFC. Incubare le piastre per quattro settimane a 37 gradi Celsius o fino a quando le colonie possono essere contate con precisione per determinare l'UFC.Prima di impostare un'inoculazione, assicurarsi sempre che la cappa di biosicurezza fluisca aria a 50 litri al minuto. Per preparare un inoculo in grado di infettare fino a 90 topi, misurare la CFU desiderata in una provetta di falco da 15 millilitri. In genere vengono utilizzati tra 10.000 e 1 milione di UFC.Quindi pellettare i batteri. Quindi lavare i batteri una volta con 10 millilitri di soluzione fisiologica. Quindi sospenderli in 15 millilitri di soluzione fisiologica.Quindi, in una cappa di biosicurezza, caricare l'inoculo in un barattolo di vetro che può essere collegato a un nebulizzatore. Quindi collegare l'unità nebulizzatore e regolare il tubo verticale in acciaio inossidabile in modo che l'estremità inferiore si trovi circa un quarto di pollice sotto il menisco della sospensione. Trasferire ora il gruppo nella camera di inoculazione in un contenitore di trasporto a tenuta stagna.Per procedere, caricare gli animali di peso noto nella camera di inoculazione potenziata. La camera può ospitare fino a 90 topi. Quindi chiudere tutti i fermi della porta.Quindi collegare il nebulizzatore utilizzando un morsetto in acciaio. Quindi premere il pulsante di avvio sulla camera. E imposta la portata d'aria tra tre e cinque litri al minuto.L'aria compressa fluirà a circa 22-26 libbre per pollice quadrato e, soprattutto, dovrebbe essere possibile vedere la nebbia dell'inoculo nella camera. Dopo 15 minuti, apparirà una luce rossa sulla parte anteriore del pannello di controllo e un segnale acustico indicherà la fine della corsa. Quindi premere il pulsante di ripristino per azzerare i timer.Per rilasciare il vuoto, premere il piccolo pulsante rosso sullo sportello della camera. Quindi apri la porta della camera e riporta i topi nelle loro gabbie domestiche. Andando avanti, tieni gli animali nella stanza di contenimento.Quindi rimetti il barattolo e il contenitore per il trasporto nell'armadio di biosicurezza. Lì, gettare la sospensione batterica rimanente in un contenitore per rifiuti designato. Quindi posizionare il barattolo del nebulizzatore usato all'interno di un sacchetto a rischio biologico e sigillare il sacchetto per il trasporto in autoclave.Per pulire la camera, spruzzare le superfici interne con fenolo tamponato ed etanolo al 70%. Lasciare che queste soluzioni reagiscano su quelle superfici per 10 minuti. Quindi puliscili accuratamente.Smaltire tutte le salviette nella spazzatura a rischio biologico. Quindi sterilizzare in autoclave la spazzatura, il contenitore dei rifiuti e i barattoli del nebulizzatore usati. Trasferire gli animali nella sala di imaging.Lì, anestetizzare un animale secondo il protocollo di testo e iniettarlo con substrato di contrasto mediante iniezione intraperitoneale. Nel software del sistema di imaging, inizializzare il sistema e procedere quando la barra della temperatura diventa verde. Dopo aver inizializzato il sistema, posizionare il mouse nella camera di imaging.Assicurati che le sue narici siano all'interno del cono del naso in modo che riceva l'anestetico durante l'imaging. Ora torna al computer. Nel pannello di controllo dell'acquisizione, selezionare la fluorescenza, la transilluminazione, per la visualizzazione dell'intero animale, o l'epi-illuminazione per visualizzare i tessuti polmonari.Per un singolo mouse, impostare il campo visivo su B e il livello della lampada su alto. Per l'esposizione, utilizzare il tempo automatico, il binning medio e due o tre per l'F/Stop. Quindi impostare il filtro di eccitazione a 745 nanometri e i filtri di emissione da 780 a 840 nanometri.Quindi vai alla configurazione della sequenza e seleziona da nove a 12 punti di transilluminazione nell'area di interesse. Ora premi il pulsante di acquisizione per raccogliere le immagini. L'analisi delle immagini è trattata nel protocollo di testo.Per analizzare l'entità dell'infezione, sopprimere il topo utilizzando pentobarbital di sodio. Assicurati di controllare la presenza di un riflesso del pedale per assicurarti che l'animale sia soppresso. E poi espiantare i polmoni usando una dissezione standard.Successivamente, omogeneizzare il tessuto polmonare in un millilitro di PBS. Quindi eseguire una diluizione seriale di dieci volte dell'omogenina utilizzando PBS. Placcare l'omogeneità diluita in triplicato e incubare la piastra a 37 gradi Celsius fino a quando non è possibile contare le colonie.Quindi utilizzare il punteggio CFU per misurare la gravità dell'infezione. I topi sono stati trattati come descritto. Un substrato REF è stato utilizzato per visualizzare la progressione di M. tuberculosis.La fluorescenza è stata quantificata utilizzando la transilluminazione. Ed è aumentato dalla seconda alla sesta settimana nei topi infetti. Il leggero calo del segnale nei topi di controllo potrebbe essere attribuito all'aumento della massa corporea e del volume durante il periodo di sei settimane.La ricostruzione 3D FLIT delle sorgenti di fluorescenza è stata realizzata da più punti di transilluminazione utilizzando la stessa eccitazione e serie di filtri di emissione. Sono state realizzate mappe di efficienza NTF per verificare la qualità della ricostruzione. L'immagine prelevata dallo specifico filtro di eccitazione è stata normalizzata all'immagine di trasmissione realizzata con lo stesso filtro di emissione e un filtro di eccitazione aperto.Questo fornisce un segnale prodotto dal solo substrato. Non c'è stato quasi nessun errore nella ricostruzione. L'esame dell'efficienza NTF dei dati sia nella vista orizzontale che in quella verticale ha mostrato una stretta correlazione.Quindi la ricostruzione 3D aveva pochi artefatti, una migliore localizzazione del segnale e una migliore sensibilità rispetto ad altri metodi. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della tubercolosi per esplorare l'efficacia terapeutica dei farmaci contro il micobatterio tubercolosi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come infettare i topi per via aerosol con il mycobacterium tuberculosis con l'imaging ottico di follow-up utilizzando il substrato REF.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Metodi per l'imaging bioluminescenza delle infezioni batteriche in animali viventi sono descritti. Gli agenti patogeni sono stati modificati per esprimere la luciferasi che permette l'imaging ottico intero corpo di infezioni negli animali vivi. I modelli animali possono essere infettati da agenti patogeni che esprimono luciferasi e il decorso della malattia conseguente visualizzati in tempo reale da parte di imaging bioluminescenza.

Utilizzando luciferasi di infezioni batteriche immagine in topi

Fonte: de Vries, C. R., et al., Un modello di inoculazione ritardata dell'infezione cronica da ferita da Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Esp. (2020).Questo video mostra una tecnica di imaging bioluminescente per monitorare la progressione dell'infezione batterica in un modello murino vivo. I batteri patogeni ingegnerizzati con il sistema di segnalazione luxABCDE emettono luce nel sito di infezione, permettendo la visualizzazione dei batteri metabolicamente attivi. Attraverso l'imaging del topo...

Imaging bioluminescente delle infezioni batteriche nei topi

Fonte: Valentine, M. E., et al., Generazione di mutanti di delezione genica in-frame in Pseudomonas aeruginosa e test per l'attenuazione della virulenza in un semplice modello murino di infezione. J. Vis. Esp. (2020)Questo video dimostra l'uso di un approccio di imaging basato sulla bioluminescenza per monitorare l'infezione batterica in un modello topino vivo. L'imaging bioluminescente e a raggi X sequenziale consente la visualizzazione in tempo reale e la localizzazione anatomica...

Imaging in tempo reale dell'infezione batterica in un modello murino utilizzando la bioluminescenza

Fonte: Behera, R. K., et al. Un metodo basato sulla fluorescenza per studiare la regolazione genica batterica nei tessuti infetti. J. Vis. Esp. (2019)Questo video mostra un metodo per preparare il tessuto renale infetto del topo, colorare il DNA e rilevare l'espressione genica batterica utilizzando doppi reporter fluorescenti. Il rosso segna tutti i batteri, mentre il verde mette in evidenza le cellule sensibili all'infezione.

Imaging a fluorescenza della colonizzazione batterica nel tessuto renale del topo

Questo video mostra l'imaging a fluorescenza enzimatica reporter (REF) per il rilevamento in vivo dell'infezione da Mycobacterium tuberculosis. I topi infetti vengono iniettati per via intraperitoneale con un substrato per l'imaging REF. Dopo essere stato idrolizzato dall'enzima batterico β-lattamasi, il substrato emette fluorescenza, il cui rilevamento aiuta la valutazione dell'infezione.

Imaging a fluorescenza enzimatica Reporter per il monitoraggio in vivo dell'infezione batterica

Questo video dimostra un metodo per tracciare le infezioni virali in modelli murini utilizzando una luciferasi ricombinante e un virus dell'influenza A che esprime la proteina ricombinante e la proteina fluorescente. Questo metodo consente studi sia in vivo che ex vivo, consentendo ai ricercatori di ottenere informazioni sulle dinamiche virali e sugli effetti degli interventi.

Un virus dell'influenza reporter fluorescente luciferasi per tracciare le infezioni virali

Di imaging multi-modalità è un valido approccio per studiare la colonizzazione batterica in piccoli modelli animali. Questo protocollo descrive l'infezione di topi con...

4D imaging multimodale di<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infezioni in topi

Combinato imaging ottico e μCT in un modello murino di infezione impianto ortopedico, utilizzando un ceppo ingegnerizzato bioluminescente di Staphylococcus aureus, purché la capacità di monitorare in maniera non invasiva e longitudinalmente la dinamica della infezione batterica, così come la risposta infiammatoria corrispondente e cambiamenti anatomici nel osso.

Combinato<em&gt; In vivo</em&gt; Optical e μCT Imaging Monitor per infezione, infiammazione, e Bone Anatomy in una infezione ortopedica impianto in topi

Qui descritto è un metodo per l'analisi di espressione genica batterica nei tessuti animali ad un livello cellulare. Questo metodo fornisce una risorsa per studiare la diversità fenotipica che si verificano all'interno di una popolazione batterica in risposta all'ambiente del tessuto durante l'infezione.

Un metodo basato su fluorescenza per studiare la regolazione genica batterica nei tessuti infetti

I virus dell'influenza A (IAV) sono patogeni respiratori contagiosi che causano epidemie annuali e pandemie occasionali. Qui, descriviamo un protocollo per monitorare le infezioni virali in vivo utilizzando una nuova luciferasi ricombinante e la fluorescenza-espressione bireporter IAV (BIRFLU). Questo approccio fornisce ai ricercatori un eccellente strumento per studiare IAV in vivo.

Un virus fluorescente di Luciferasi-fluorescente Reporter per l'imaging dal vivo e la quantificazione dell'infezione virale

Qui presentiamo un protocollo per l'imaging intravitale di Mycobacterium tuberculosis approvato BSL-2 attenuato. Ceppo nel polmone murino utilizzando una finestra polmonare permanente. Questo approccio consente un'analisi longitudinale a risoluzione monocellulare delle prime interazioni ospite-patogeno, inclusa localizzazione bacillare, dinamica vascolare e assorbimento di macrofagi nello stesso microambiente polmonare.

Imaging intravitale dell'attenuazione dell'Auxotrophic Mycobacterium tuberculosis nel polmone murino durante l'infezione intravascolare precoce

Scopri l'imaging con fluorescenza enzimatica reporter per rilevare Mycobacterium tuberculosis nei topi. Questo metodo consente studi longitudinali sulle interazioni ospite-patogeno e sullo sviluppo di terapie.

Tubercolosi del micobatterio in topi con fluorescenza enzima Reporter di imaging

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