Name: Mediante ibridazione In Situ di fluorescenza (pesce) per monitorare lo stato di coesione braccio in prometafase e metafase I Oocytes di Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 46 s
Description: Scopri la tecnica FISH per visualizzare la coesione dei cromatidi fratelli negli oociti di Drosophila in prometafase e metafase I. Questo metodo permette di analizzare genotipi con coesione meiotica alterata.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato supportato da NIH Grant GM59354 assegnato a Sharon E. Bickel. Ringraziamo Huy d. Nguyen per assistenza nello sviluppo del protocollo per la generazione di sonde fluorescenti braccio, Ann Lavanway per aiuto con microscopia confocale e J. Emiliano Reed per l'assistenza tecnica. Ringraziamo anche numerosi colleghi nella comunità della drosofila per utili discussioni e consigli.

<ol><li>Peters, J. M., Nishiyama, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3536341/">Sister chromatid cohesion.</a> CSH Perspect Biol. 4 (11), (2012).</li>
<li>McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohesin+in+gametogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cohesin in gametogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).</li>
<li>Buonomo, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disjunction+of+homologous+chromosomes+in+meiosis+I+depends+on+proteolytic+cleavage+of+the+meiotic+cohesin+Rec8+by+separin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disjunction of homologous chromosomes in meiosis I depends on proteolytic cleavage of the meiotic cohesin Rec8 by separin.</a> Cell. 103 (3), 387-398 (2000).</li>
<li>Bickel, S. E., Orr-Weaver, T., Balicky, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sister-chromatid+cohesion+protein+ORD+is+required+for+chiasma+maintenance+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The sister-chromatid cohesion protein ORD is required for chiasma maintenance in Drosophila oocytes.</a> Curr. Biol. 12 (11), 925-929 (2002).</li>
<li>Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMC1beta-deficient+female+mice+provide+evidence+that+cohesins+are+a+missing+link+in+age-related+nondisjunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">SMC1beta-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction.</a> Nat Genet. 37 (12), 1351-1355 (2005).</li>
<li>Freeman, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+National+Down+Syndrome+Project%3A+design+and+implementation%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Health+Rep%22%5BJournal%5D)">The National Down Syndrome Project: design and implementation.</a> Public Health Rep. 122 (1), 62-72 (2007).</li>
<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+aneuploidy%3A+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).</li>
<li>Angell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-meiotic-division+nondisjunction+in+human+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">First-meiotic-division nondisjunction in human oocytes.</a> Am. J. Hum. Genet. 61, 23-32 (1997).</li>
<li>Tsutsumi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+decrease+of+meiotic+cohesins+in+human+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Age-related decrease of meiotic cohesins in human oocytes.</a> PLoS One. 9 (5), e96710(2014).</li>
<li>Liu, L., Keefe, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+cohesin+is+associated+with+age-dependent+misaligned+chromosomes+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biomed+Online%22%5BJournal%5D)">Defective cohesin is associated with age-dependent misaligned chromosomes in oocytes.</a> Reprod Biomed Online. 16 (1), 103-112 (2008).</li>
<li>Subramanian, V. V., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+predisposes+oocytes+to+meiotic+nondisjunction+when+the+cohesin+subunit+SMC1+is+reduced%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Aging predisposes oocytes to meiotic nondisjunction when the cohesin subunit SMC1 is reduced.</a> PLoS Genet. 4 (11), e1000263(2008).</li>
<li>Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+weakened+centromere+cohesion+is+a+leading+cause+of+age-related+aneuploidy+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes.</a> Curr. Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).</li>
<li>Lister, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+meiotic+segregation+errors+in+mammalian+oocytes+are+preceded+by+depletion+of+cohesin+and+Sgo2%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Age-related meiotic segregation errors in mammalian oocytes are preceded by depletion of cohesin and Sgo2.</a> Curr. Biol. 20 (17), 1511-1521 (2010).</li>
<li>Duncan, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+cohesion+decreases+in+human+eggs+with+advanced+maternal+age%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosome cohesion decreases in human eggs with advanced maternal age.</a> Aging Cell. 11 (6), 1121-1124 (2012).</li>
<li>Yun, Y., Lane, S. I., Jones, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+dyad+separation+in+meiosis+II+is+the+major+segregation+error+with+maternal+age+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Premature dyad separation in meiosis II is the major segregation error with maternal age in mouse oocytes.</a> Development. 141 (1), 199-208 (2014).</li>
<li>Subramanian, V. V., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2666492/">Heterochromatin-mediated association of achiasmate homologues declines with age when cohesion is compromised.</a> Genetics. 181, 1207-1218 (2009).</li>
<li>Jeffreys, C. A., Burrage, P. S., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+system+for+increased+meiotic+nondisjunction+in+older+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">A model system for increased meiotic nondisjunction in older oocytes.</a> Curr. Biol. 13 (6), 498-503 (2003).</li>
<li>Weng, K. A., Jeffreys, C. A., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rejuvenation+of+Meiotic+Cohesion+in+Oocytes+during+Prophase+I+Is+Required+for+Chiasma+Maintenance+and+Accurate+Chromosome+Segregation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Rejuvenation of Meiotic Cohesion in Oocytes during Prophase I Is Required for Chiasma Maintenance and Accurate Chromosome Segregation.</a> PLoS Genetics. 10 (9), e1004607(2014).</li>
<li>Perkins, A. T., Das, T. M., Panzera, L. C., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+in+oocytes+during+midprophase+induces+premature+loss+of+cohesion+and+chromosome+segregation+errors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress in oocytes during midprophase induces premature loss of cohesion and chromosome segregation errors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), E6823-E6830 (2016).</li>
<li>Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+of+a+role+for+heterochromatin+in+meiotic+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation.</a> Cell. 86, 135-146 (1996).</li>
<li>Dernburg, A. F., Sedat, J. W. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091679X08608808">Method Cell Biol</a>. 53, Academic Press. 187-233 (1998).</li>
<li>Guo, Z., Batiha, O., Bourouh, M., Fifield, E., Swan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Securin%2C+Separase+and+Cohesins+in+female+meiosis+and+polar+body+formation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of Securin, Separase and Cohesins in female meiosis and polar body formation in Drosophila.</a> J Cell Sci. 129 (3), 531-542 (2016).</li>
<li>Giauque, C. C., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin-Associated+Proteins+HP1a+and+Piwi+Collaborate+to+Maintain+the+Association+of+Achiasmate+Homologs+in+Drosophila+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin-Associated Proteins HP1a and Piwi Collaborate to Maintain the Association of Achiasmate Homologs in Drosophila Oocytes.</a> Genetics. 203 (1), 173-189 (2016).</li>
<li>Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Beliveau, B. J., Wu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+progenitors+escape+the+widespread+phenomenon+of+homolog+pairing+during+Drosophila+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Germline progenitors escape the widespread phenomenon of homolog pairing during Drosophila development.</a> PLoS Genet. 9 (12), e1004013(2013).</li>
<li>Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congression+of+achiasmate+chromosomes+to+the+metaphase+plate+in+Drosophila+melanogaster+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes.</a> Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).</li>
<li>Gyuricza, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+Stable+Cohesins+Regulate+Synaptonemal+Complex+Assembly+and+Chromosome+Segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic and Stable Cohesins Regulate Synaptonemal Complex Assembly and Chromosome Segregation.</a> Curr Biol. 26 (13), 1688-1698 (2016).</li>
<li>Radford, S. J., McKim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+Imaging+Prometaphase+and+Metaphase+of+Meiosis+I+in+Fixed+Drosophila+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes.</a> J Vis Exp. (116), (2016).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

L'uso di pesce sonde per valutare lo stato di coesione braccio in prometafase io e metafase ho Drosophila ovociti è un progresso significativo nel campo della drosofila meiosi. Storicamente, i ricercatori della Drosophila sono stati limitati a test genetici per dedurre la perdita prematura di coesione braccio in ovociti maturi11,18,19. Ora, con i metodi qui presentati, lo stato di coesione del braccio ...

Corretta segregazione dei cromosomi durante la mitosi e meiosi richiede che la sorella cromatidio coesione essere stabilito, mantenuto e rilasciato in un modo coordinato1,2. Coesione è stabilito durante la fase S ed è mediato dalla coesina complessa, che forma legami fisici che tengono la sorella cromatidi insieme. Nella meiosi, coesione distale di un crossover funziona anche per tenere insieme gli omologhi ricombinanti e questa associazione fisica contribuisce a garantire il corretto orientamento di bivalente su metafase mandrino (Figura 1)3,4, 5. Rilascio del braccio coesione a anafase permette l'omologhi segregare ai poli opposti del mandrino. Tuttavia, se la coesione del braccio è perso prematuramente, ricombinanti omologhi perderanno loro connessione fisica e segregare in modo casuale, che può provocare gameti aneuploid (Figura 1).
In ovociti umani, errori nella segregazione del cromosoma sono la principale causa di aborti e malformazioni alla nascita, come la sindrome di Down6, e la loro incidenza aumenta esponenzialmente con l'età materna7. Coesione di cromatidio della sorella è stabilito negli ovociti fetali e ricombinazione meiotic viene completata prima della nascita. Ovociti quindi arrestare in Mid-Profase I fino a quando l'ovulazione e durante questo periodo di arresto, l'associazione fisica costante degli omologhi ricombinanti si basa sulla sorella coesione tra cromatidi fratelli. Di conseguenza, accurata segregazione durante la meiosi e gli esiti di gravidanza normale richiedono che coesione rimangono intatti per fino a cinque decenni.
La perdita prematura di coesione durante l'arresto prolungato meiotic di ovociti umani è stata proposta per contribuire all'effetto dell'età materna e linee multiple di prova supportano questa ipotesi8,9. Tuttavia, date le sfide di studiare meiotica coesione in ovociti umani, gran parte della nostra comprensione di questo fenomeno si basa sull'uso di modello organismi5,10,11,12, 13,14,15.
Drosophila melanogaster ovociti offrono numerosi vantaggi per lo studio della coesione e cromosoma meiotic di segregazione. Una semplice analisi genetica permette di recuperare la progenie da gameti aneuploid e misurare la fedeltà di X-segregazione cromosomica su una larga scala11,16,17. Inoltre, si può anche determinare se gli errori di segregazione del cromosoma sorgono perché missegregate ricombinanti omologhi durante la meiosi I, un fenotipo che è coerenza con la perdita prematura di braccio coesione11,18, 19. diretta osservazione dello stato di coesione meiotica in ovociti di Drosophila è anche possibile mediante ibridazione in situ di fluorescenza (pesce). Anche se oligonucleotidi fluorescenti che ibridano a sequenze ripetitive satellite sono stati utilizzati per oltre un decennio per monitorare pericentromeric coesione maturo Drosophila ovociti4,20, analisi del braccio coesione è stato molto più difficile. Visualizzazione dello stato di coesione braccio richiede una sonda che si estende su una vasta regione di copia singola sequenze ed è abbastanza luminosa per provocare segnali visibili per singolo sorella cromatidi quando braccio coesione è assente. Inoltre, il condizioni di fissazione degli ovociti e le dimensioni delle autorità nazionali designate con etichettate deve facilitare la penetrazione21 nell'ovocita maturo grande di Drosophila (200 µm larga di 500 µm lungo). Recentemente, una sonda di braccio è stato correttamente utilizzato per prevedere i cromatidi oocita di Drosophila durante l'anafase io, ma gli autori ha dichiarato che potrebbe non rilevare un segnale in prometafase o metafase sono arrestato ovociti22. Qui forniamo un protocollo dettagliato per la generazione di X-braccio del cromosoma FISH sonde e le condizioni di preparazione degli ovociti che ci hanno permesso di analizzare per la perdita prematura della sorella coesione cromatidio in prometafase io e metafase ho ovociti. Queste tecniche, che hanno permesso di identificare prodotti genici che sono necessari per il mantenimento della coesione meiotica, permetterà ad altri di dosaggio per sorella coesione cromatidio difetti in ovociti maturi di Drosophila di genotipi differenti.

<table><tbody><tr><td>Kit </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Midi Kit di preparazione</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td>Prep BAC clone DNA</td></tr><tr><td>GenomePlex Kit completo di amplificazione dell'intero genoma (WGA) Sigma</td><td></td><td>WGA2</td><td>Amplify BAC clone DNA</td></tr><tr><td>ARES Alexa Fluor 647 Kit di marcatura del DNA</td><td>Invitrogen</td><td>A21676</td><td>Label BAC clone</td></tr><tr><td>DNA PCR kit Qiagen</td><td></td><td>28104</td><td>Rimuovere il colorante non coniugato dopo l'etichettatura del clone BAC DNA</td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Chemicals & Soluzioni</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Nota: </forte>Tutte le soluzioni sono preparate utilizzando acqua ultrapura sterile e devono essere sterilizzate in autoclave o con filtro.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td>Preparare il 10% di brodo Congelare le aliquote Cloruro</td></tr> di <tr><td>calcio</td><td>Fisher Scientific</td><td>C75-500</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4', 6-Diamidino-2-Fenilindolo, Dicloridrato)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td><forte>Tossico:</forte> indossare una protezione adeguata. Preparare 100&micro; g/ml di brodo in etanolo al 100%, conservare in aliquote a -20 °C. Preparare 1 &5; g/ml di soluzione in 2X SSCT prima dell'uso.</td></tr><tr><td>Destrano solfato</td><td>Sigma</td><td>D-8906</td><td></td></tr><tr><td>Drierite Drierite</td><td>Company</td><td>23001</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Invitrogen</td><td>15508-013</td><td>Preparare 10 mM stock</td></tr><tr><td>dTTP (10 &micro; mol, 100 & micro; l)</td><td>Boehringer Mannheim</td><td>1277049</td><td>Preparare 1 mM stock</td></tr><tr><td>EDTA (Acido etilendiammina tetraacetico disodico)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td>Preparare 250 mM stock</td></tr><tr><td>100% etanolo (grado molecolare, 200 proof)</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Tris (Ultra Pure)</td><td>Invitrogen</td><td>15504-020</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (Acido etilenbis(ossietilenenitrilo)tetraacetico)</td><td>Sigma</td><td>E-3889</td><td></td></tr><tr><td>16% formaldeide</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>18505</td><td><forte>Tossico:</forte> indossare una protezione adeguata</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Invitrogen</td><td>AM9342</td><td><forte>Tossico: </forte>indossare una protezione adeguata</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Glicogeno</td><td>Roche</td><td>901393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Boehringer Mannheim</td><td>737-151</td><td></td></tr><tr><td>Eptano</td><td>Fisher Scientific</td><td>H350-4</td><td><forte>Tossico: </forte> indossare una protezione adeguata.</td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Millipore</td><td>HX0603-4</td><td><forte>Tossico: </forte> indossare una protezione adeguata.</td></tr><tr><td>Idrossilammina</td><td>Sigma</td><td>438227</td><td>Preparare 3 M stock</td></tr><tr><td>4,9 M Cloruro di magnesio</td><td>Sigma</td><td>104-20</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 &Yuml; 7H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 &Yuml; 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lisina (0,1 mg/ml)</td><td>Sigma</td><td>P8920-100</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di potassio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP364-500</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S209-500</td><td>Preparare 3M stock</td></tr><tr><td>Cacodilato di sodio</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>1131</td><td><forte>Tossico: </forte>indossare una protezione adeguata. Preparare 400mM di stock</td></tr><tr><td>Citrato di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP327-1</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Cloruro di</td></tr><tr><td>sodio Saccarosio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>10% Tween 20</td><td>Thermo Scientific</td><td>28320</td><td>Surfact-Amps</td></tr><tr><td>10% Triton X-100</td><td>Thermo Scientific</td><td>28314</td><td>Surfact-Amps</td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nota: Tutte le soluzioni sono preparate utilizzando acqua ultrapura sterile e devono essere sterilizzate in autoclave o con filtro.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampone</td><td></td><td></td> TE <td>10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8,0</td></tr><tr><td>20X SSC (citrato di sodio salino)</td><td></td><td></td><td>3 M NaCl, 300 mM citrato di sodio</td></tr><tr><td>2X soluzione</td><td></td><td></td> fissa di cacodilato<td><forte>Tossico: </forte> indossare una protezione adeguata. 200 mM di cacodilato di sodio, 200 mM di saccarosio, 80 mM di acetato di sodio, 20 mM di</td></tr><tr><td>tampone</td><td></td><td></td> <td>di ibridazione EGTA 1.1XSSC 3,3X, 55% formammide, 11% destrano solfato</td></tr><tr><td>Soluzione fissa</td><td></td><td></td><td><forte>Tossico: protezione adeguata </forte>usura. 4% formaldeide, 1X soluzione fissa di cacodilato</td></tr><tr><td>PBSBTx</td><td></td><td></td><td>1X PBS, 0,5% BSA, 0,1% Trition X-100</td></tr><tr><td>PBSTx</td><td></td><td></td><td>1X PBS, 1% Trition X-100</td></tr><tr><td>Tampone di estrazione (PBSTx + Rnase)</td><td></td><td></td><td>1X PBS, 1% Trition X-100, 100 & micro; g/mL RNasi</td></tr><tr><td>2X SSCT</td><td></td><td></td><td>2X SSC, 0,1% Tween 20</td></tr><tr><td>2X SSCT + 20% formammide</td><td></td><td></td><td><forte>Tossico:</forte> indossare una protezione adeguata. 2X SSC, 0,1% Tween 20, 20% formamide</td></tr><tr><td>2X SSCT + 40% formammide</td><td></td><td></td><td><forte>Tossico:</forte> indossare una protezione adeguata. 2X SSC, 0,1% Tween 20, 40% formamide</td></tr><tr><td>2X SSCT + 50% formamide</td><td></td><td></td><td><forte>Tossico:</forte> indossare una protezione adeguata. 2X SSC, 0,1% Tween 20, 50% formammide</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Enzimi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AluI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0137S</td><td></td></tr><tr><td>HaeIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0108S</td><td></td></tr><tr><td>MseI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0525S</td><td></td></tr><tr><td>MspI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0106S</td><td></td></tr><tr><td>RsaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0167S</td><td></td></tr><tr><td>BfuCI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0636S</td><td></td></tr><tr><td>100X BSA</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td>Viene fornito con enzimi NEB</td></tr><tr><td>10X NEB tampone #2</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td>Tampone per la digestione enzimatico di restrizione. Viene fornito con enzimi NEB</td></tr><tr><td>Deossinucleotidiltransferasi terminale (TdT) 400 U/&micro; l</td><td>Tampone TdT Roche/Sigma</td><td>3333566001</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Roche/Sigma</td><td></td><td>Viene fornito con l'enzima TdT</td></tr><tr><td>Cloruro di cobalto</td><td>Roche/Sigma</td><td></td><td>Toxic: protezione adeguata </forte>usura. Viene fornito con l'enzima TdT</td></tr><tr><td>RNasi A (10 mg/mL)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Strumenti di citologia ecc.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forcipe</td><td>Dumont</td><td></td><td>#5 INOX, Biologie</td></tr><tr><td>9" Pipette monouso in vetro Pasteur Fisher</td><td></td><td>13-678-20C</td><td>Autoclave per sterilizzare Piatto</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>da dissezione in vetro poco profondo</td></tr><tr><td>Piatto a pozzetti profondi su misura (3 pozzetti)</td><td>Pyrex</td><td>7223-34</td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest Vetrini per microscopio Premium</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-104</td><td>Utilizzato per coprire piatti a pozzetti profondi</td></tr><tr><td>Vetrini in vetro smerigliato, 25 x 75 mm</td><td>VWR Scientific</td><td>48312-002</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini in vetro, 3 x 1 in, spessore 1 mm</td><td>Thermo-Scientific</td><td>3051</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti, 10 x 10 mm, n. 1,5</td><td>Thermo-Scientific</td><td>3405</td><td></td></tr><tr>Ago <td></td><td></td> di<td>tungsteno</td><td>fatto in casa</td></tr><tr><td>Prolong GOLD supporti di montaggio</td><td>Sonde molecolari</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Aria compressa in lattina</td><td>Vari</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000, spettrofotometro Spettrofotometro</td> per microvolumi <td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Vari</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfuge da tavolo a temperatura ambiente</td><td>Vari</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfuge da tavolo a 4 gradi C</td><td>Vari</td><td></td><td></td></tr><tr><td>blocchi di calore</td><td>Vari</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forno di ibridazione o incubatore con rotatore</td><td>Vari</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>Vari</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A1RSi laser scanning confoal</td><td>Nikon</td><td></td><td>40X olio Piano Fluor DIC (NA 1.3)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Materiali di consumo ecc.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL provette coniche</td><td>Varie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>provette coniche da 15 mL</td><td>Varie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>provette microfuge da 1,5 mL</td><td>Varie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 &micro; l tubi microfuge</td><td>Vari</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; l Provette per PCR</td><td>Vari</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contenitore di plastica con coperchio aderente</td><td>Vari</td><td></td><td>Per contenere Drierite</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Varie</td><td></td><td>salviette monouso</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Vari</td><td></td><td>film di paraffina</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Other</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC purificato 5' marcato con oligonucleotidi</td> Integrated <td>DNA Technologies</td><td></td><td>Sonde Cy3-labeled che riconoscono la ripetizione satellitare di 359 bp del cromosoma X</td></tr><tr><td>Software di analisi delle immagini 3D Volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Versione 6.3</td></tr></tbody></table>

mediante ibridazione in situ di fluorescenza (pesce) per monitorare lo stato di coesione braccio in prometafase e metafase i oocytes di drosophila

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Negli esseri umani, gli errori di segregazione del cromosoma in ovociti sono responsabili della maggior parte di aborti e malformazioni congenite. Inoltre, come le donne invecchiano, il loro rischio di concepire che un feto aneuploide aumenta notevolmente e questo fenomeno è noto come l'effetto dell'età materna. È un requisito per la segregazione del cromosoma accurata durante le divisioni meiotiche manutenzione della sorella coesione tra cromatidi fratelli durante il periodo di profase estesa esperienza di ovociti. Prova citologica in entrambi esseri umani e gli organismi modello suggerisce che coesione meiotica si deteriora durante il processo di invecchiamento. Inoltre, gli errori di segregazione in ovociti umani sono più prevalenti durante la meiosi I, coerente con la perdita prematura di coesione di braccio. L'uso di organismi modello è fondamentale per dipanare i meccanismi che sottendono la perdita età-dipendente di coesione. Drosophila melanogaster offre diversi vantaggi per studiare il regolamento di meiotic coesione negli ovociti. Tuttavia, fino a poco tempo, solo i test genetici erano disponibili test per la perdita di coesione del braccio in ovociti di genotipi diversi o in diverse condizioni sperimentali. Qui, un protocollo dettagliato è fornito per l'utilizzo di fluorescenza in situ ibridazione (pesce) per visualizzare direttamente difetti nella coesione del braccio in prometafase io e metafase sono arrestato ovociti di Drosophila . Generando una sonda di pesce che ibridizza con il braccio distale del cromosoma X e raccogliendo gli stack Z confocale, un ricercatore può visualizzare il numero di singoli segnali di pesce in tre dimensioni e determinare se sorella cromatidio braccia sono separati. La procedura descritta permette di quantificare i difetti di coesione braccio in centinaia di Drosophila ovociti. Come tale, questo metodo fornisce un importante strumento per indagare i meccanismi che contribuiscono alla coesione manutenzione, nonché i fattori che portano alla sua scomparsa durante il processo di invecchiamento.

Figura 5 presenta le immagini ottenute con una sonda di braccio che ibridizza con citologico regione 6E-7B sul cromosoma X . Questo risultati di sonda in un segnale che co-localizza con quello di DAPI, è facilmente distinguibile dallo sfondo ed è stato usato con successo per quantificare i difetti di coesione del braccio in diversi genotipi19. Quantificazione dei difetti di coesione è stata limitata a prometafase io e metafase...

Questo manoscritto presenta un metodo dettagliato per la generazione di X-cromosoma braccio sonde e performanti in situ ibridazione di fluorescenza (pesce) per esaminare lo stato della sorella coesione cromatidio in prometafase e metafase sono arrestato Drosofila ovociti. Questo protocollo è adatto a determinare se la coesione meiotica braccio è intatto o perturbato in differenti genotipi.

Mediante ibridazione In Situ di fluorescenza (pesce) per monitorare lo stato di coesione braccio in prometafase e metafase I Oocytes di Drosophila

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare sonde FISH e visualizzare lo stato di coesione del braccio meiotico negli ovociti di drosophila durante la prima e la prima metafase. Il vantaggio principale di questa tecnica è che permette di dosare lo stato di coesione del braccio in prometafase e in metafase uno ha arrestato gli ovociti di Drosophila. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della meiosi da drosofila, ad esempio quali condizioni portano a una perdita prematura della coesione del braccio?Questa tecnica ha il potenziale per ampliare la nostra comprensione dell'effetto dell'età materna nell'uomo, che si verifica, almeno in parte, perché la coesione meiotica si deteriora con l'invecchiamento degli ovociti. Iniziare questo protocollo con la generazione della sonda a braccio per FISH, nonché la dissezione e la fissazione degli ovociti come descritto nel protocollo di testo. Per separare gli ovociti in fase avanzata, aggiungere prima un millilitro di PBSBTX in un piatto di dissezione poco profondo.Quindi, utilizzare un P-200 con una punta rivestita di BSA per trasferire le ovaie fisse nel piatto poco profondo. Pipettare le ovaie su e giù con

using-fluorescence-situ-hybridization-fish-to-monitor-state-arm

Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Montare tutto ibridazione in situ è ​​una delle tecniche più utilizzate in biologia dello sviluppo. Qui, presentiamo una ad alta risoluzione doppio fluorescente in protocollo ibridazione in situ per analizzare il modello preciso espressione di un singolo gene e per determinare la sovrapposizione dei domini di espressione di due geni. Includiamo un propidio ioduro nucleare contro-macchia per evidenziare l'organizzazione dei tessuti.

Zebrafish intero monte ad alta risoluzione doppia fluorescente In Situ Ibridazione

Ematociti concentrati Drosophila disperdere sulla totalità dello sviluppo dell'embrione. Questo protocollo dimostra come montare e immagine queste migrazioni uso di embrioni con ematociti concentrati fluorescente.

Immagini dal vivo di Drosophila melanogaster Migrazioni Hemocyte embrionali

Il cinetocore è dove il SAC inizia il suo segnale di controllo della segregazione mitotica dei cromatidi fratelli. Un metodo è descritto per visualizzare il reclutamento e il fatturato di una delle proteine ​​cinetocoro e il suo coordinamento con il movimento dei cromosomi...

Studiare Checkpoint mitotica illustrando un comportamento dinamico delle proteine ​​cinetocoro e Motion cromosoma in Living<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni sinciziale

Qui si descrive un insieme di montaggio...

Tutta la Monte RNA fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; L&#39;ibridazione di<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni

L'immunocolorazione è una tecnica efficace per visualizzare specifici tipi di cellule e proteine all'interno dei tessuti. Utilizzando la sonicazione, il protocollo qui descritto allevia la necessità di sezionare i tessuti di Drosophila melanogaster da embrioni e larve in fase avanzata prima dell'immunocolorazione. Forniamo una metodologia efficiente per l'immunocolorazione di larve intere di montatura fissate con formaldeide.

Sonicazione-facilitato immunofluorescenza colorazione di ritardo-fase embrionale e larvale<em&gt; Drosophila</em&gt; Tessuti<em&gt; In Situ</em

Presentiamo protocolli per la raccolta, la preparazione e l'imaging di ovociti maturi di Drosophila. Questi metodi consentono la visualizzazione del comportamento cromosomico e dell'assemblaggio e della funzione del fuso durante la meiosi.

Tecniche di Imaging Prometafase e metafase della meiosi I nel fisso<em&gt; Drosophila</em&gt; ovociti

Il protocollo descritto di RNA in situ ibridazione del permette la rilevazione del RNA in embrioni della drosofila interi o tessuti dissecati. Utilizzando piastre microtiter a 96 pozzetti e amplificazione del segnale di microarray, trascrizioni possono essere rilevate alla velocità effettiva, sensibilità e alta risoluzione e ad un costo relativamente basso.

Ibridazione fluorescente In Situ ad alta risoluzione in embrioni della drosofila e tessuti mediante amplificazione del segnale Tyramide

Questa singola molecola fluorescenza in situ di ibridazione protocollo è ottimizzato per quantificare il numero di molecole di RNA in lievito durante la meiosi e crescita vegetativa.

Singola molecola l'ibridazione In Situ (smFISH) analisi in crescita vegetativa lievito germogliante e meiosi

Per riproducibile contare i numeri dei mRNAs in singoli ovociti, in situ di fluorescenza di singola molecola del RNA (RNA-pesce) l'ibridazione è stato ottimizzato per cellule non aderenti. Gli ovociti sono stati raccolti, ibridata con le sonde specifiche di trascrizione e quantificati tramite un software di quantificazione di immagine.

Uso di singola molecola fluorescente ibridazione In Situ (SM-pesce) per quantificare e Localize mRNAs in ovociti murini

L'ibridazione in situ a fluorescenza iterativa assistita da espansione (EASI-FISH) è una tecnica robusta che combina la microscopia ad espansione con l'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) per rilevare l'espressione di più geni nei tessuti spessi. Questo protocollo delinea i recenti progressi nel metodo e il suo adattamento per l'etichettatura del sistema nervoso centrale della Drosophila intatta.

Rilevamento multiplex dell'espressione genica nel cervello intatto di Drosophila mediante ibridazione in situ a fluorescenza iterativa assistita da espansione

Questo protocollo descrive i passaggi necessari per eseguire ibridazione ibridazione a reazione a catena fluorescente in situ (HCR-FISH) nei lobi ottici larvali di Drosophila melanogaster . Sono dettagliate procedure per la progettazione della sonda, l'ibridazione, l'amplificazione e il montaggio dei tessuti per facilitare la visualizzazione del lobo ottico in sviluppo.

Ibridazione a reazione a catena FISH nel lobo ottico di Drosophila in via di sviluppo

Scopri la tecnica FISH per visualizzare la coesione dei cromatidi fratelli negli oociti di Drosophila in prometafase e metafase I. Questo metodo permette di analizzare genotipi con coesione meiotica alterata.

Mediante ibridazione In Situ di fluorescenza (pesce) per monitorare lo stato di coesione braccio in prometafase e metafase I Oocytes di Drosophila (Video) | JoVE Journal

Mediante ibridazione In Situ di fluorescenza (pesce) per monitorare lo stato di coesione braccio in prometafase e metafase I Oocytes di Drosophila

Esplora altri video