SwarmSight: Monitoraggio in tempo reale dei movimenti di Antenna dell'insetto e proboscide estensione Reflex utilizzando una preparazione comune e Hardware convenzionali
25 dicembre 2017
Questo protocollo descrive i passaggi per utilizzare il nuovo software, SwarmSight, per il monitoraggio di frame-by-frame di posizioni dell'antenna e proboscide dell'insetto dal video fotocamera web convenzionale utilizzando computer convenzionali. Il software gratuito, open-source elabora frame circa 120 volte più veloce di esseri umani e si esibisce al meglio di precisione umano.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di misurare rapidamente i movimenti delle antenne e della proboscide degli insetti dal video di un comune preparato animale utilizzando il software open-source del sito dello sciame e l'hardware convenzionale della fotocamera e del computer. Questi metodi possono essere utilizzati per ottenere rapidamente misurazioni ad alta risoluzione dei movimenti dell'antenna e della proboscide. L'applicazione di questi metodi può chiarire come i movimenti dell'antenna e della proboscide cambiano in risposta a manipolazioni chimiche, dello sviluppo e genetiche.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che può misurare rapidamente i movimenti utilizzando un software gratuito e non richiede sofisticati hardware video o informatici. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle risposte agli odori nelle api mellifere, può essere applicato anche ad altri sistemi di insetti. Per iniziare, usa le fiale per raccogliere le api operaie dall'ingresso dell'alveare e posiziona brevemente le fiale in un impasto di ghiaccio.
Con del nastro adesivo, fissa ogni ape in un tubo di imbracatura e poi applica del nastro adesivo sulla parte superiore del tubo per nascondere le zampe. Assicurarsi che le gambe non siano visibili dalla parte superiore del tubo dell'imbracatura. Successivamente, sotto un microscopio da dissezione, utilizzare un saldatore a bassa temperatura per applicare la cera riscaldata sulla parte posteriore della testa di ogni ape per immobilizzarla.
Usa una piccola asta per tenere l'antenna lontana dalla cera e assicurati che le antenne possano muoversi liberamente. Usa un supporto per webcam per posizionare una telecamera direttamente sopra la testa dell'ape e usa il software di registrazione per ispezionare il video e ingrandire la testa. Dopo aver applicato il nastro adesivo e la cera, visualizza in anteprima la scena utilizzando la fotocamera e cerca qualsiasi cosa che potrebbe muoversi o cambiare che non sia l'antenna o la proboscide.
Quindi regolare il nastro e la cera secondo necessità. Quindi, utilizzare le impostazioni del software di registrazione per mantenere costante l'esposizione della fotocamera e regolare il cursore dell'esposizione sul valore desiderato. Regola i cursori di contrasto, luminosità e nitidezza per migliorare il rilevamento dell'antenna.
Regola l'illuminazione ambientale per ridurre le ombre dell'antenna. Usa una fonte di luce diffusa, come una lampada a collo d'oca da laboratorio o una torcia con carta per illuminare l'ape. Quindi, posiziona una luce LED posizionata all'interno della visuale della telecamera per indicare quando viene erogato l'odore dello stimolo.
In una cappa aspirante, preparare delle cartucce di odori, che verranno utilizzate per stimolare le api durante le registrazioni video. Posizionare la fonte di erogazione degli odori vicino al tubo dell'imbracatura, facendo attenzione a non ostruire la visuale della telecamera. Posizionare una fonte di vuoto di fronte alla sorgente di odore per rimuovere gli odori di stimolo e accenderla prima della presentazione dell'odore.
Una volta che le api sono state trattenute e i preparativi della fotocamera sono stati completati, filmare ogni singola ape in ogni condizione sperimentale come un file video separato. Successivamente, nel modulo di tracciamento dell'antenna del sito dello sciame, fare clic sul pulsante Sfoglia per aprire un file video. Dopo aver caricato il file video, posiziona il widget del sensore dell'antenna sopra la testa dell'ape.
Utilizzare le icone di rotazione e scala per regolare l'allineamento del widget. Il widget dovrebbe coprire l'intera gamma di movimento sull'antenna dell'ape. Quindi, posiziona il widget del sensore di trattamento sulla luce LED che indica quando viene erogato l'odore dello stimolo.
Fare clic sul pulsante di riproduzione nell'angolo in basso a sinistra per avviare la visualizzazione fotogramma per fotogramma del file video. I probabili punti dell'antenna e della proboscide saranno evidenziati in giallo e gli anelli gialli indicheranno le punte delle appendici. Regola i cursori nella sezione dei filtri per ottimizzare la sensibilità del filtro.
Quando viene raggiunta la sensibilità ideale, solo le appendici dell'ape saranno evidenziate nell'inquadratura. Avanza rapidamente attraverso le parti successive del video per garantire che la sensibilità del filtro sia ottimizzata durante l'intero video. Metti alla prova il tuo set-up realizzando un breve video di esempio dell'insetto e analizzalo con il software, alla ricerca di oggetti in movimento estranei che il software rileva.
Regola la scena, l'illuminazione e l'angolazione della telecamera fino a quando il software non isola i movimenti delle antenne e della proboscide. Dopo aver impostato i widget e i filtri, metti in pausa il video, riavvialo e riproducilo dall'inizio alla fine. Infine, espandi la sezione di salvataggio, fai clic sul pulsante Salva dati di tracciamento e seleziona una cartella in cui salvare il file.
Per convalidare il software di tracciamento delle appendici, due valutatori umani hanno individuato le punte delle antenne in 425 fotogrammi video, che sono stati poi analizzati dal software. La distanza tra i due valutatori umani è dimostrata in questa figura, con la distanza interumana e la distanza tra le posizioni rilevate dal software e i valutatori umani è dimostrata con la distanza umana più vicina al software. La distanza interumana era piccola per i fotogrammi all'inizio e poi aumentava durante la seconda metà del video.
I livelli di distanza umana più vicini al software rimangono costanti per tutto il video. 23 api mellifere femmine sono state esposte a cinque diverse condizioni di odore e i video delle prove sono stati analizzati utilizzando il software di tracciamento delle appendici. Ad eccezione della condizione di controllo, il software è stato in grado di rilevare differenze significative nelle variazioni dell'angolo medio delle antenne dopo l'esposizione a condizioni sperimentali di odore.
Inoltre, le mappe della densità dell'angolo dell'antenna hanno rivelato cluster di preferenze per la posizione dell'antenna. I grappoli rossi nella mappa indicano che le antenne preferiscono angoli lontani dalla fonte dell'odore poco dopo l'insorgenza dell'odore e preferiscono angoli verso la fonte dell'odore poco dopo la conclusione dell'odore. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ispezionare attentamente ogni scena video prima della registrazione per verificare che il posizionamento e l'illuminazione ottimali delle api.
Inoltre, è importante contrassegnare i telai di erogazione degli odori con un indicatore visivo. Dopo aver eseguito questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come il condizionamento degli odori. Questa procedura è utile anche per esplorare le risposte innate nelle api mellifere e in altri insetti.
Non dimenticare che lavorare con le api e alcune sostanze chimiche può essere pericoloso. Durante l'esecuzione di questa procedura è necessario indossare sempre dispositivi di protezione individuale adeguati. Una volta padroneggiata, questa procedura può essere utilizzata per ottenere in modo efficiente dati sul movimento dell'antenna e della proboscide per un gran numero di insetti e condizioni sperimentali.
Swarm Sight, il software open source utilizzato in questa procedura, può essere ottenuto da swarmsight.org.
Panoramica
Questo protocollo fornisce una metodologia dettagliata per l'utilizzo di SwarmSight, un software open source, al fine di tracciare i movimenti delle antenne e del proboiscide di insetti a partire da registrazioni video. L'approccio sfrutta tecnologie convenzionali di webcam e mira a migliorare l'accuratezza e la velocità rispetto ai metodi di tracciamento manuale, consentendo ai ricercatori di indagare le modifiche comportamentali in risposta a diversi stimoli.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia del Comportamento
- Fisiologia degli Insetti
Sfondo
- Questo studio si concentra sulla misurazione dei movimenti degli arti degli insetti per comprendere le loro risposte comportamentali.
- La metodologia sviluppata è applicabile a vari sistemi di insetti, non limitata alle api mellifere.
- La tecnica facilita lo studio delle reazioni ai cambiamenti chimici, dello sviluppo e genetici.
- Il software elabora i dati video notevolmente più velocemente del tracciamento manuale, migliorando l'efficienza nella raccolta dei dati.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo accessibile per misurare con precisione e rapidità i movimenti degli arti degli insetti.
- Permettere ai ricercatori di studiare la dinamica delle risposte agli odori nelle api mellifere come organismo modello.
- Illustrare gli effetti delle condizioni sperimentali sui movimenti delle antenne e del proboiscide.
Metodi Utilizzati
- Lo studio utilizza un software di tracciamento open source, SwarmSight, insieme a un comune equipaggiamento con webcam per l'acquisizione dei dati.
- Le api mellifere sono utilizzate come modello biologico, con protocolli dettagliati per la loro immobilizzazione e posizionamento durante la registrazione video.
- Non viene menzionata alcuna analisi multiomica o metabolica.
- Passaggi importanti includono la regolazione delle impostazioni della fotocamera e l'ottimizzazione dell'illuminazione per migliorare la visibilità degli ap-pendici.
- La raccolta dei dati prevede la ripresa video di api esposte a diverse condizioni olfattive e l'analisi successiva del video mediante il software di tracciamento.
Risultati principali
- Il software ha tracciato in modo quantitativo le variazioni dell'angolo delle antenne, rivelando differenze significative tra le diverse condizioni sperimentali.
- I risultati hanno incluso l'individuazione di raggruppamenti preferenziali nella posizione delle antenne in risposta a stimoli odorosi, dimostrando un adattamento comportamentale.
- La validazione del tracciamento ha indicato prestazioni costanti nel rilevamento dei movimenti delle antenne tra i diversi fotogrammi video.
- Sono state ottenute informazioni significative sui meccanismi di risposta allo stimolo chimico analizzando i modelli di movimento.
Conclusioni
- Questo studio illustra una metodologia robusta per l'analisi ad alto rendimento dei comportamenti degli insetti in relazione a stimoli sensoriali.
- L'uso di software open source facilita l'applicazione diffusa nella ricerca di neuroscienze comportamentali senza la necessità di attrezzature specializzate.
- Le intuizioni derivanti da questo lavoro permettono una migliore comprensione degli effetti dei segnali ambientali sui movimenti e sul comportamento degli insetti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il monitoraggio quantitativo degli apporti sensoriali negli insetti consente una riduzione meccanicistica dei rischi nella validazione degli obiettivi per programmi di agrochimica e controllo dei vettori. La fenotipizzazione comportamentale ad alto rendimento supporta una previsione affidabile nelle campagne di screening, collegando l'esposizione chimica a output neurali misurabili. Questo approccio affronta punti critici nella fase iniziale della scoperta, in cui è necessario distinguere l'interazione funzionale con la molecola bersaglio dagli effetti non specifici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi sensoriali quantificando le retrazioni delle antenne come parametro funzionale di rilevamento degli odori.
- Valore operativo: Fornisce dati riproducibili e ad alta risoluzione sui movimenti per chiarire le relazioni dose-risposta nei percorsi chemosensoriali.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio distinguendo meccanismi chemosensoriali specifici da modifiche generali della locomozione.
Screening e sviluppo di saggi
- Valore scientifico: Genera metriche quantitative sugli angoli delle antenne e sull'estensione del proboiscide adatte alla standardizzazione dei saggi.
- Valore operativo: Elabora i video a una velocità 120 volte superiore a quella umana con un'accuratezza superiore all'umana, consentendo la pronta implementazione su larga scala.
- Valore predittivo: Cattura la dinamica delle antenne fino a 15 Hz, permettendo la rilevazione di risposte neurali rapide ai composti volatili.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Rivela la formazione di aggregati dipendente dalla concentrazione degli odori nelle mappe di densità delle posizioni delle antenne, supportando l'allineamento dei biomarcatori.
- Valore operativo: Permette la continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica monitorando le risposte innate in seguito a manipolazioni genetiche e dello sviluppo.
- Valore predittivo: Facilita decisioni di avanzamento corrette in base al rischio, collegando l'input sensoriale all'output comportamentale in sistemi rilevanti per la malattia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della biologia della scoperta fornendo dati quantitativi sui movimenti degli ap pendaggi che supportano la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi nella validazione dei bersagli chemiosensoriali.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi mediante il tracciamento fotogramma per fotogramma delle risposte antennali a stimoli chimici.
- Screening: Fornisce output quantitativi pronti per i saggi e riproducibili a partire da video registrati con webcam convenzionali.
- Analisi: Permette il confronto tra condizioni sperimentali tramite il calcolo delle variazioni medie dell'angolo antennale e il raggruppamento in mappe di densità.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica monitorando le risposte a diverse concentrazioni di odore e in diverse condizioni sperimentali.
- Riutilizzo aziendale: Offre una capacità riutilizzabile e open source per la fenotipizzazione comportamentale ad alto rendimento in diversi modelli di insetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi mediante la quantificazione delle retrazioni antennali indotte da stimoli chimici.
- Valore operativo: Standardizzazione e scalabilità grazie a un software open-source in grado di elaborare video a 30 fps a una velocità superiore a 120 volte quella umana.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avanzamento o interruzione progettuale riducendo l'ambiguità meccanicistica nella modulazione delle vie sensoriali.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione aggiustata per il rischio mediante raggruppamento della posizione antennale in funzione della dose e variazioni dell'angolo medio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella preparazione degli insetti, nell'immobilizzazione e nel tracciamento comportamentale basato su video.
- Necessita di una webcam convenzionale, di un'illuminazione diffusa e di un apparato per la somministrazione di odori all'interno di una cappa aspirante per stimoli volatili.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per l'immobilizzazione con cera, la posizione della telecamera e le impostazioni di sensibilità del filtro.
- Richiede l'adattamento della scala del widget del sensore antennale a diverse specie di insetti e a diversi intervalli di appendici.
- Limite pratico: un tracciamento ottimale dipende dalla riduzione al minimo delle ombre ambientali e dei movimenti estranei nel campo video.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
0:58
Catching and Harnessing Honey Bees and Preparation of the Video Camera
3:17
Positioning Sensors and Video Analysis
4:25
Adjusting Filter Thresholds and Saving Results
5:31
Results: Appendage Tracking Software Demonstrates Higher Efficiency and Precision Compared to Human Raters
7:05
Conclusion
