Name: Valutazione delle terapie con cellule staminali in un modello di lesione bilaterale del tendine Patellar in ratti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Scopri un modello bilaterale di lesione del tendine rotuleo nel ratto per valutare terapie con cellule staminali mesenchimali. Questo metodo riduce la variazione interindividuale e ottimizza l'uso degli animali nella ricerca ortopedica.

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Gli autori desidera ringraziare Dr. Su, PhD, per la sua analisi statistica dei dati. Gli autori ringraziano anche Dr. McClure, DVM, PhD, DACLAM, per la sua consulenza sull'anestesia e dolore gestione protocolli utilizzati nello studio. Questo progetto è stato sostenuto da sovvenzioni da Western University of Health Sciences ufficio del Vice Presidente per la ricerca (12678v) e USDA sezione 1433 fondi (2090).

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) di Western University of Health Sciences.
1. isolamento ed espansione di cellule staminali mesenchimali da cordone ombelicale equino Matrix
<ol><li>Ottenere la placenta da un mare adulto (incinto) dopo osservato parto e asetticamente isolare il cordone ombelicale dalla placenta. Tenere il cordone ombelicale in tampone fosfato salino (PBS) con 1% di penicillina-streptomicina (P/S) a 4 ° C durante il trasferimento fino al trattamento.</li>
	<li>Lavare il cordone ombelicale due volte con temperatura ambiente PBS con 1% P/S in un tubo da 50 mL. Sezione il cordone ombelicale in frammenti 2-pollice-lungo su 150 mm piastra e lavare a temperatura ambiente PBS con 1% P/S in un tubo da 50 mL due o tre volte, fino a quando la maggior parte del sangue è risciacquato.</li>
	<li>Tagliare il cordone ombelicale longitudinalmente per esporre i vasi. Rimuovere le navi, incluse 2 arterie e una vena un gambo allantoico da cavo con pinze e le forbici. Raccogliere la matrice del cordone ombelicale (gelatina di Wharton), ovvero i vasi circostanti di matrice gelatinosa, su un piatto di 150mm raschiando con un bisturi, e tritare la gelatina in pezzi pregiati.</li>
	<li>Gelatina di Wharton posto da 2 – 3 del cordone ombelicale frammenti (circa 12 – 15 g) in un tubo da 50 mL con 15 mL di soluzione di tipo IA collagenosi 0,1% (p/v) in PBS. Incubare a 37 ° C con agitazione delicata per 3-4 h fino a completa dissoluzione.</li>
	<li>Centrifugare il tessuto digerito a 300 x g per 15 min e aspirare il surnatante. Risospendere tessuto digerito in 15 mL di temperatura PBS con 1% P/S, Miscelare pipettando, centrifugare a 150 x g per 5 min e aspirare il surnatante (lavaggio). Ripetere il lavaggio due volte più.</li>
	<li>Risospendere lavato cellule in 15 mL di temperatura PBS con 1% P/S, Miscelare pipettando, ceppo di con filtro di 100 µm cella, centrifuga a 150 x g per 5 min e aspirare il surnatante.</li>
	<li>Preparare il terreno di coltura (CM) con glucosio basso Dulbecco Medium dell'Aquila per volta (LG-DMEM) con siero bovino fetale (FBS) e 1% P/S. sterilizzare il medium di filtrazione.</li>
	<li>Risospendere le cellule sforzate in 10 mL di CM pre-riscaldato a 37 ° C, Miscelare pipettando, trasferire in un matraccio di cultura del tessuto2 25cm e incubare 5% CO2 al 90% di umidità e 37,0 ° C. Cambiamento CM ogni 3 giorni fino a quando la cultura raggiunge la confluenza di 70 – 80%, quando la cultura sarà essere attraversata.</li>
	<li>Per la cultura del passaggio, aspirare CM dalla boccetta, lavare due volte con 5 mL di PBS di temperatura e staccare con 3 mL di 0,25% acido di tripsina/etilendiamminotetraacetico (EDTA) a 37 ° C per 5 min.</li>
	<li>Neutralizzare la tripsina/EDTA con 6 mL di CM pre-riscaldato a 37,0 ° C, Miscelare pipettando, trasferire in una provetta da 15 mL, centrifuga a 150 x g per 5 min e aspirare il surnatante. Risospendere le cellule indipendenti in 1 mL di CM, Miscelare pipettando. Contare le cellule vitali utilizzando trypan blu e un emocitometro. Reseeding in un matraccio di cultura del tessuto2 25cm a 5.000 cellule/cm2ed incubare 5% CO2 al 90% di umidità e 37,0 ° C.</li>
</ol>2. preparazione di sferoidi con UCM-MSCs coltivate sulle pellicole di chitosano
<ol><li>Per preparare 100 mL di soluzione di chitosano 1% (p/v), aggiungere 1 g di chitosano in 99 mL di acqua distillata (dH2O) e mescolare bene con un agitatore magnetico.</li>
	<li>670 µ l di acido acetico glaciale e continuare a mescolare fino a quando il chitosano si scioglie e diventa viscoso. Questo di solito prende 3-4 h.</li>
	<li>Aggiungere 500 µ l di soluzione di chitosano in ciascun pozzetto della piastra di coltura del tessuto 12-pozzetti, e agitare la piastra per distribuire uniformemente la soluzione di chitosano e coprire tutta la superficie di fondo.</li>
	<li>Asciugare la piastra di soluzione rivestito di chitosano sotto flusso laminare senza una copertura durante la notte per 24 h. Una volta essiccato, film sottile sarà formata e aderito alla piastra.</li>
	<li>Neutralizzare il chitosano pellicola aggiungendo 1 mL di soluzione di idrossido di sodio (NaOH) 0,5 N in ogni pozzetto e incubare per 2 ore a temperatura ambiente. NaOH da ciascun pozzetto di aspirare e lavare ogni bene con 1 mL di dH2O tre volte. Lavare ogni bene con 1 mL di etanolo al 70% (EtOH) una volta.</li>
	<li>Per sterilizzare chitosano film, aggiungere 1 mL di 70% EtOH in ciascun pozzetto ed incubare durante la notte a flusso laminare mobile. Aspirare EtOH rimanenti da ogni pozzetto nel giorno seguente. Lavare ogni bene con 1 mL di PBS sterile tre volte. Sterilizzare il chitosano film con luce ultravioletta sotto flusso laminare durante la notte senza una copertura.</li>
	<li>A sferoidi forma di UCM-MSCs, semi espansa e attraversate le cellule in ogni pozzetto a 5.000 cellule/cm2e incubare in 5% CO2 al 90% di umidità e 37,0 ° C. Nota: Le cellule possono essere incubate sotto ipossia o normoxia, a seconda dell'interesse del ricercatore.</li>
</ol>3. espressione di marcatori di superficie analizzata tramite flusso Cytometry
<ol><li>
Preparazione di una sospensione singola cella
	<ol>
<li>Piastra standard<ol>
<li>Rimuovere il mezzo da ogni pozzetto e lavare due volte con PBS di temperatura.</li>
			<li>Staccare le cellule con 500 µ l di reagente di dissociazione una cella in ogni pozzetto di una piastra 12-pozzetti per 5 – 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
			<li>Dopo l'incubazione, aggiungere 1 ml di buffer (PBS contenente 0.5% BSA) la macchiatura in ciascun pozzetto e Miscelare pipettando per staccare le cellule.</li>
			<li>Trasferire la sospensione di cellule in provetta conica da 15 mL e centrifugare a 150 x g per 5 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Piastra di chitosano<ol>
<li>Raccogliere tutti gli sferoidi di aspirante medio utilizzando una pipetta con una punta di 1.000 µ l. Termovettore raccolti in una provetta conica da 15 mL. Dopo aver raccolto medio, lavare bene aggiungendo 1 mL di PBS e trasferire PBS lavato lo stesso tubo conico da 15 mL.</li>
			<li>Centrifugare sferoidi a 150 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante.</li>
			<li>Aggiungere 500 µ l del reagente di dissociazione delle cellule (per esempio, accutase) e incubare per 5 – 10 minuti a temperatura ambiente. Mescolare di pipettaggio utilizzando una punta da 1 mL fino a sferoidi dissociano e non sono più visibili.</li>
			<li>Aggiungere 1 mL di tampone colorazione nella sospensione unicellulare e centrifugare a 150 x g per 5 min.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Celle di lavaggio
	<ol>
<li>Rimuovere il surnatante dal tubo conico e risospendere le cellule in 3 mL di buffer di colorazione fredda. Mantenere le cellule sul ghiaccio in tutto esperimento da questo passaggio.</li>
		<li>Centrifugare a 300 x g per 5 min (lavaggio).</li>
		<li>Lavare due volte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Macchiatura delle celle
	<ol>
<li>Centrifugare a 300 x g per 5 min e rimuovere il surnatante.</li>
		<li>Conta cellule vitali utilizzando un trypan blu e un emocitometro. Risospendere 1 x 106 cellule in 50 µ l blocco buffer (PBS contenente 10% di siero equino) e incubare per 30 min in ghiaccio.</li>
		<li>Aggiungere 10 µ l della fluorescina isotiocianato di fluoresceina (FITC) coniugato anticorpi (CD44, CD90, CD105, CD34, (istocompatibilità complex MHC) di classe II o controllo di isotipo per ciascun anticorpo) e 40 µ l di tampone di colorazione, quindi incubare protetta dalla luce per 1h sul ghiaccio.</li>
		<li>Aggiungere 3 mL di buffer di colorazione fredda e mescolare, centrifugare a 300 x g per 5 min e aspirare il surnatante (lavaggio).</li>
		<li>Ripetere il lavaggio due volte.</li>
		<li>Risospendere il pellet cellulare in 0,5 mL di tampone di colorazione</li>
		<li>Aggiungere 5 µ l di 7-AAD (tintura di vitalità) e incubare per 30 min in ghiaccio</li>
		<li>Analizzare i campioni delle cellule macchiato da citometro a flusso. Escludere i detriti da loro piccoli SSC e FSC e identificare cellule vitali con assorbimento inferiore di 7-AAD. Plot FL1 e FL2 su y - e assi x, rispettivamente. Isotype controllo consente di creare un cancello sopra la linea diagonale. Misurare la percentuale di cellule positivamente marcate nella zona. Contare almeno 20.000 eventi/campione (complementare figura 1).</li>
		<li>Misurare la percentuale di cellule colorate con gli anticorpi di gating cellule vitali e auto-fluorescenza e sottrarre la percentuale di cellule colorate con controllo di isotipo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. bilaterale del tendine Patellar difetto modello nel ratto
<ol><li>Selezionare ratti Sprague-Dawley (adulti maschi, 4-5 mesi, 350 – 375 g di peso corporeo). Notare le dimensioni relativamente grandi dei ratti utilizzato per questo modello.</li>
	<li>Anestetizzare e applicare lubrificante occhio artificiale il ratto con sevoflurane 8% a 2 L/min 100% ossigeno erogato tramite maschera, fino alla scomparsa del riflesso di pizzico-punta nella camera di induzione.</li>
	<li>Somministrare un'iniezione intramuscolare di Meloxicam (1 mg/kg) come preemptive analgesia.</li>
	<li>Posto il ratto tra due bottiglie da 0,5 L acqua riempita con acqua calda e coperto con un panno per mantenere la temperatura corporea e la posizione, evitando la ferita della pelle. Nastro ogni estremità alla tabella. Per ridurre il rischio di ipotermia, coprire il corpo con pluriball (Figura 1).</li>
	<li>Mantenere l'anestesia con flusso continuo di sevoflurane 5% nella miscela di ossigeno 100% 1L via cono di naso, con l'animale in decubito dorsale, il rilievo di riscaldamento dell'acqua.</li>
	<li>Per evitare traumi cutanei, non agganciare i siti chirurgici. Al contrario, applicare crema di rimozione dei capelli sopra entrambi soffoca. Per rimuovere la crema ed i capelli, utilizzare un abbassalingua.</li>
	<li>Strofinare il sito chirurgico con chlorhexidine digluconate macchia e risciacquare con etanolo al 70% 3 volte.</li>
	<li>Incidere la pelle con una lama per bisturi #15 sterile in senso prossimale a distale, l'aspetto craniomedial della soffocano. Avviare l'incisione di circa 1 cm prossimale al livello della patella ed estenderlo distale al tubercolo tibia di circa 5 mm.</li>
	<li>Riflettere la pelle per esporre il tendine rotuleo liberando il tessuto sottocutaneo sottostante con una lama per bisturi #15.</li>
	<li>
Utilizzando la lama per bisturi #15, asportare il terzo centrale di ogni tendine rotuleo (1 mm) dalla funzione distale della rotula alla tuberosità tibiale.
	<ol>
<li>Allineare un filo di Kirschner 0.99 mm-diametro contro il tendine come modello per standardizzare le dimensioni del difetto in ogni arto (Figura 2).</li>
		<li>Fare 2 incisioni di pieno-spessore su ogni lato del filo di Kirschner con una lama per bisturi #15 per isolare la porzione centrale del tendine (Figura 3). Resecare la sezione centrale prossimalmente e distalmente con forbice Iris (Figura 4).</li>
		<li>Prima di chiudere la fascia della soffocano, inserire il coagulo (sospensione cellulare mista e ACP) per i gruppi di trattamento appropriato, come descritto in 5.5. Chiudere la fascia con un motivo crociato e la pelle con un modello intradermica 5-0 polyglactin 910 suture (Figura 5).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ripetere la procedura sul ginocchio controlaterale. Nota: Un difetto viene assegnato casualmente ad un trattamento (cellule staminali condizionato il chitosano o coltivate su piastre standard). Il difetto controlaterale viene lasciato vuoto, per servire come controllo interno.</li>
	<li>Dopo la chirurgia, amministrare 4 compresse di enrofloxacina (2 mg/compressa, per via orale, una volta al giorno) e una tavoletta di meloxicam (2 mg/compressa, per via orale, una volta al giorno) per 7 giorni. Queste dosi sono state consigliate da un veterinario di animali di laboratorio e approvate nel protocollo IACUC.</li>
</ol>5. consegna di MSCs all'interno del difetto di tendine rotuleo
<ol><li>Anestetizzare un topo sano che non viene utilizzato per la creazione di difetto del tendine rotuleo con sevoflurane 8% a 2 L/min 100% ossigeno erogato tramite maschera, fino alla scomparsa del riflesso di pizzico-punta nella camera di induzione.</li>
	<li>Raccogliere 5 mL di sangue da puntura cardiaca dal ratto Sprague-Dawley anestetizzato (adulti maschi, 4-5 mesi, 350 – 375 g di peso corporeo), in una siringa da 5 mL con ago 20 G contenente 1 mL di acido-citrato-destrosio (5:1 v/v).</li>
	<li>Eutanasia del ratto dopo puntura cardiaca e raccolta del sangue, tramite l'iniezione intracardiaca di pentobarbital (100 mg/kg), mentre sotto l'anestesia stessa.</li>
	<li>Centrifugare il campione a 350 x g per 15 min a temperatura ambiente. Trasferire il surnatante e conservare le aliquote (120 µ l) a-20 ° C fino all'utilizzo.</li>
	<li>Immediatamente prima in vivo dell'impianto, scongelare l'aliquota di cui sopra e mescolare 20 µ l con 0,5 x 106 MSCs (da 1,9 o 3.1.2.1) staccato da piastre standard con tripsina/EDTA o raccogliere da chitosano piastre di vampate di calore (con PBS/medio).</li>
	<li>Aggiungere 6 µ l di 10% cloruro di calcio (CaCl2) per il restante 100 µ l di plasma scongelato in un pozzo di piastra a 96 pozzetti per attivare il plasma e indurre la formazione di un coagulo (attivato condizionato al plasma: ACP).</li>
	<li>Mescolare la sospensione cellulare (20 µ l) e ACP (100 µ l) per formare un coagulo (Figura 6). Posizionare il coagulo all'interno del tendine rotuleo difetto creato prima di chiudere la fascia della soffocano (vedi passo 4.10.3).</li>
</ol>6. functional Outcome
<ol><li>Ratti di monitorare due volte al giorno per segni di dolore, basato sul ratto smorfia scala (RGS)37,38 ed il gonfiamento sopra i siti di impianto. Nota: Un sistema di Punteggio (0-6) è stato sviluppato per valutare la funzione ambulatoria basato su 3 attività, tra cui temporizzata dell'arto in piedi con arti anteriori supportati (0-3), cronometrato in piedi senza aiuto dell'arto (0 – 2) e la capacità di scalare una gabbia plastica parete (0 – 1) (17cm Tabella 1).</li>
	<li>Valutare ratti per le due attività in piedi dell'arto al mattino e alla sera di ogni punto del tempo per calcolare un punteggio medio.</li>
	<li>Valutare ratti per poter correttamente scalare una parete di plastica gabbia di 17cm con entrambi gli arti posteriori, raggiungendo la cima.</li>
</ol>7. lordo aspetto e l'istopatologia del tendine rotuleo
<ol><li>Eutanasia di ratti a 7 giorni (per valutare l'infiammazione) o 28 giorni (per valutare la guarigione dei tessuti) post-trattamento mediante iniezione intracardiaca di pentobarbital (100 mg/kg) in anestesia con sevoflurane 8% e 2 L 100% ossigeno trasportato tramite maschera.</li>
	<li>Vendemmia unità della tuberosità rotula-tendine-tibia di bisturi e forbici dopo l'eutanasia. Rimuovere i tessuti molli e legamenti intorno la soffocano, fatta eccezione per il tendine rotuleo.</li>
	<li>Esaminare ciascun campione per apparenza lorda ed ispessimento del tendine (Figura 7).</li>
	<li>Orientare il preparato inserendo un nodo del chirurgo di 5.0 polidioxanone sull'aspetto prossimale e laterale del tendine. Fissare ogni campione in soluzione di formalina neutra tamponata 10% e ottenere sezioni trasversali (5 µm) da metà di-parte del ogni tendine.</li>
	<li>Macchia le sezioni con ematossilina ed eosina e Trichrome di Masson macchiatura seguendo protocolli standard.</li>
	<li>Esaminare la sezione per rilevare la presenza di ematoma all'interno del difetto, come pure i cambiamenti patologici quali l'infiammazione.</li>
	<li>Valutare il punteggio istologico delle sezioni utilizzando il sistema di Punteggio precedentemente pubblicato, basato sul grado di collagene, grado di angiogenesi e cartilagine formazione (tabella 2)39.</li>
</ol>

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi di divulgare.

Cellule Equine sono state selezionate per questo progetto, perché alla fine abbiamo intenzione di testare candidato approcci nella gestione delle tendinopatie naturale nei cavalli. Infatti, lesioni del tendine nei cavalli sono attraenti come modelli naturali di tendinopathy nell'uomo a causa della somiglianza biologica tra il flessore digitale superficiale equino e tendine di Achille in esseri umani41. Gli indicatori di superficie delle cellule CD44, CD90, CD105, CD34 e MHC II sono stati seleziona...

Lesione del tendine è una delle più comuni cause di atrofia del muscolo e dolore significativo tra specie1. In medicina veterinaria, tendine e lesioni ai legamenti sono di particolare interesse per i cavalli, come 82% di tutte le lesioni in cavalli da corsa coinvolgere il sistema muscolo-scheletrico, e 46% di quelli interessare tendini e legamenti2,3. Formazione di tessuto cicatriziale colpisce le proprietà biomeccaniche dei tendini guariti e spiega la prognosi custodita per ritorno all'uso atletico dopo lesioni del tendine del flessore; re-infortunio si verifica entro 2 anni in fino al 67% di cavalli trattati conservativamente4. Medicina rigenerativa fornisce alternative romanzo ad una condizione che sfida i trattamenti tradizionali. Terapia con cellule staminali autologhe ha prodotto alcuni risultati incoraggianti5,6 , ma è limitata dalla morbosità connessa con la raccolta di tessuto, amministrazione in ritardo a causa di elaborazione/riprogrammazione delle cellule e l'influenza della lo stato di salute del paziente (ad esempio età) sulle proprietà delle staminali cellule7,8. Queste limitazioni forniscono una spiegazione razionale per lo studio di cellule staminali allogeniche in alternativa disponibile immediatamente. Cellule derivate da annessi fetali sono candidati attraenti perché essi eludere le preoccupazioni di ordine etico e rischio di formazione di teratoma è associata con le cellule staminali embrionali. Tra annessi fetali, matrice del cordone ombelicale (UCM), anche denominato gelatina di Wharton, è abbondante e facile da raccogliere.
Indipendentemente dall'origine delle cellule, migliorando la staminalità è indispensabile istituire una banca di cellule per trapianto allogenico medicina rigenerativa. Da un punto di vista funzionale, staminalità può definirsi il potenziale di differenziazione di auto-rinnovamento e multi-lignaggio9. Prova di staminalità si basa sulla proliferazione e differenziamento saggi, con l'espressione di gene marcatori Oct4, Sox2 e Nanog9. Una strategia per migliorare la staminalità si basa sull'uso di biomateriali per servire come Sub riempitivi e vettori migliorando la proliferazione e la differenziazione di UCM-MSCs. Questo approccio elimina le preoccupazioni relative alla manipolazione di fattori trascrizionali per riprogrammare cellule mature in cellule pluripotenti indotte. Tra biomateriali considerati come potenziali vettori per le cellule staminali, chitosano è attraente per la sua biocompatibilità e degradabilità10. Questo aminopolysaccharide naturale è formata da deacetilazione alcalina della chitina, il secondo più abbondante polisaccaride naturale, ottenuta principalmente come un sottoprodotti di crostacei10. In precedenza abbiamo studiato le interazioni tra MSCs e chitosano scaffold e osservato la formazione di sferoidi11,12,13,14,15, 16. abbiamo anche segnalato sulla superiorità di Condrogenesi il chitosano matrici12,13,14,15,16,17, 18. Più recentemente, due studi indipendenti hanno descritto sferoidi formazione di tessuto adiposo e placenta tessuto derivato MSCs coltivate su una pellicola di chitosano19,20. Questa formazione di sferoidi non solo migliorato la staminalità, ma anche migliorato la conservazione di cellule staminali dopo in vivo l'impianto20.
La prevalenza e la morbosità di tendinopathy attraverso le specie hanno richiesto lo sviluppo di modelli sperimentali per studiare la fisiopatologia delle tendinopatie e testare nuove terapie come iniezioni di cellule staminali. Nei cavalli, indotta da collagenosi tendinite è un modello comune per dimostrare l'efficacia utilizzando MSCs nel tendine riparazione21. La rilevanza di questo approccio è limitata, come iniezioni causano cambiamenti infiammatori acuti, mentre tendinopatie cliniche sono generalmente frutto di cronica affaticare22,23. Inoltre, induzione chimica della malattia del tendine induce una risposta di guarigione e non replica il processo di guarigione alterato presente in casi clinici22,23. L'asportazione di un segmento del tendine flessore superficiale è stato descritto come un modello chirurgico di tendinite in cavalli24. Più recentemente, è stato utilizzato un approccio mini-invasivo per limitare il danno traumatico al nucleo centrale del tendine flessore superficiale25. Modelli chirurgici non simulare il meccanismo di affaticamento che può condurre alla malattia naturale del tendine e tendono alla mancanza di riproducibilità nell'entità del danno creato25. Indipendentemente dal modello, morbilità e costi associati modelli equine del tendine malattie sono ulteriori limitazioni, che giustificano un interesse nei modelli del roditore come un primo passo per la valutazione in vivo di nuove terapie.
Uno dei principali vantaggi dei modelli sperimentali in roditori è costituito dal costo e la capacità di controllare la variabilità inter-individuale. Roditori possono essere standardizzate riguardo ai vari fattori fisiologici a causa dei loro tassi di crescita rapida e relativamente brevi durate, limitazione delle fonti di variazione e riducendo pertanto il numero di animali necessari per rilevare le differenze. Strategie per indurre malattie del tendine in roditori hanno contato su induzione chimica, ma anche sulla creazione chirurgica di parziale del tendine difetti21. Modelli chirurgici possono simulare naturale tendinopatie meglio di modelli chimici, ma possono portare a più alta morbilità e fallimento catastrofico del tendine danneggiato. A tale proposito, ratti sembrano candidati migliori rispetto ai topi per questi modelli, come la loro dimensione consente la creazione di più grandi difetti, facilitando così la valutazione della guarigione dei tessuti. Ratti Sprague-Dawley sono stati utilizzati in studi sperimentali di tendinopatie in quattro gruppi principali del tendine: cuffia dei rotatori, flessori, Achille e tendini patellar26. Tra questi modelli che coinvolgono il tendine rotuleo sono particolarmente attraente per la taglia più grande di questo tendine e la facilità di accesso allo stesso27. Il tendine rotuleo si attacca il muscolo quadricipite alla tuberosità tibiale. All'interno di questo meccanismo dell'estensore, la rotula è un osso sesamoide che dirige l'azione del quadricipite e delinea il limite prossimale del tendine rotuleo. La presenza di ancoraggi ossute gli extent prossimali e distali del tendine patellar facilita prove biomeccaniche. Modelli che tipicamente coinvolgono il tendine rotuleo si basano sui vizi chirurgiche unilaterale, con un tendine intatto controlaterale che serve come un controllo28,29. Il modello più diffuso di difetto tendine rotuleo coinvolge asportare la parte centrale (1 mm di larghezza) del tendine rotuleo dall'apice distale della rotula per l'inserimento della tuberosità tibiale, mentre il tendine rotuleo controlaterale è lasciato intatto. Misure dei risultati hanno incluso l'istologia, prove biomeccaniche distruttive o prove biomeccaniche per fallimento, formazione immagine di ultrasuono, ex vivo imaging di fluorescenza, lordo osservazione e test funzionali28,30 ,31. Modelli unilaterale non permettere il confronto di un trattamento proposto con l'amministrazione conservatrice di una ferita simile all'interno dello stesso animale. Allo stesso modo, il confronto tra diversi trattamenti richiede animali separati. Un modello bilaterale sarebbe eliminare le variazioni inter-individuali e ridurre il numero di animali necessari per un Studio32. Tuttavia, le lesioni bilaterali possono aumentare la morbosità e zoppia bilaterale potrebbe ostacolare la valutazione della terapia. Alcuni studi segnalano brevemente l'uso bilaterale del tendine patellar difetti di ratti ma si concentrano sugli effetti di trattamenti anziché amministrazione peri-attiva e morbosità del modello33,34.
Obiettivo a lungo termine di questo studio è quello di sviluppare una strategia per migliorare la sopravvivenza di staminalità e in vivo di UCM-MSCs destinati al trapianto allogenico. Per raggiungere questo obiettivo, recentemente abbiamo segnalato staminalità migliorata di UCM-MSCs dalla formazione di sferoidi sulla pellicola di chitosano e incubazione sotto ambiente ipossico35. Queste proprietà in vitro sono state associate con migliorate proprietà biomeccaniche del tendine rotuleo difetti trattati con condizionata UCM-MSCs. basato su questi risultati, il modello di difetto bilaterale del tendine patellar del ratto sembra adatto a testare il candidato trattamenti per tendine lesioni36. Lo scopo dello studio segnalato qui è quello di fornire protocolli dettagliati per isolamento e caratterizzazione di UCM-MSCs, preparazione di un sistema di consegna biologico per le cellule staminali, creazione e trattamento di difetti del tendine della rotula bilaterale e post-operatorio recupero e valutazione di guarigione all'interno dei difetti dei tessuti.

<table><tbody><tr><td>PBS 10x</td><td>Hyclone</td><td>SH30258.01</td><td>Consumabile</td></tr><tr><td>Collagenasi tipo IA</td><td>Worthington</td><td>LS004197</td><td>Consumabile</td></tr><tr><td>DMEM a basso contenuto di glucosio</td><td>Hyclone</td><td>SH30021. FS</td><td>Consumabile</td></tr><tr><td>Fetale Siero Bovino</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td>Consumabile</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina 100x</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Consumabile</td></tr><tr><td>Tripsina 0,25%</td><td>Hyclone</td><td>SH30042.01</td><td>Consumabile</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td>Consumabile</td></tr><tr><td>Trypan blu</td><td>Hyclone</td><td>SV30084.01</td><td>Consumabile</td></tr><tr><td>Dimetil Solfossido</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Consumabile</td></tr><tr><td>Chitosano</td><td>Sigma</td><td>C3646</td><td>Consumabile</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td>Consumabile</td></tr><tr><td>Siero bovino Albumina</td><td>Hyclone</td><td>SH30574.01</td><td>Consumabile</td></tr><tr><td>Tubo in polistirene a fondo tondo</td><td>Corning</td><td>149591A</td><td>Consumabile</td></tr><tr><td>Topo anti-cavallo CD44 (FITC)</td><td>AbD serotec</td><td>MCA1082F</td><td>Consumabile</td></tr><tr><td>Topo anti-ratto CD90 (FITC)</td><td>AbD serotec</td><td>MCA47FT</td><td>Consumabile</td></tr><tr><td>Topo anti-cavallo MHC-II (FITC)</td><td>AbD serotec</td><td>MCA1085F</td><td>Consumabile</td></tr><tr><td>Topo IgG1 (FITC) - Controllo Isotipo</td>: <td>AbD serotec</td><td>MCA928F</td><td>Consumabile</td></tr><tr><td>Topo monoclonale [SN6] a CD105 (FITC)</td><td>abcam</td><td>ab11415</td><td>Consumabile</td></tr><tr><td>Mouse IgG1 (FITC) - Controllo Isotipo</td><td>abcam</td><td>ab1356</td><td>Consumabile</td></tr><tr><td>Mouse anti-umano CD34 (FITC)</td><td>BD</td><td>BDB560942</td><td>Consumabile</td></tr><tr><td>Mouse IdG1 kappa (FITC)</td><td>BD</td><td>BDB555748</td><td>Consumabile</td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD</td><td>BDB559925</td><td>Consumabile</td></tr><tr><td>BD Accuri C6 Citometro a flusso</td><td>BD</td><td></td><td>Attrezzatura</td></tr><tr><td>Vacutainer 5 mL</td><td>Med Vet International</td><td>RED5.0</td><td>Consumabile</td></tr><tr><td>Acido-citrato-destrosio</td><td>Sigma</td><td>C3821</td><td>Consumabile</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>Consumabile</td></tr><tr><td>Sevoflurano</td><td>JD Medical</td><td>60307-320-25</td><td>Consumabile</td></tr><tr><td>Ratti</td><td>Charles River</td><td>Codice ceppo: 400</td><td>Animale da esperimento</td></tr><tr><td>Kit chirurgico per ratti</td>, <td>Harvard apparato</td>, <td>728942</td><td>attrezzature</td></tr>, <tr><td>lama chirurgica #15</td>, <td>MEDLINE</td><td>MDS15115</td><td>consumabile</td></tr>, <tr><td>Rat MD's Baytril (2 mg/compressa), Rimadyl (2 mg/compressa)</td><td>Bio Serv</td><td>F06801</td><td>consumabile</td></tr><tr><td>Polyglactin 910, 5-0</td><td>Ethicon</td><td>J436G</td><td>consumabile</td></tr><tr><td>Eosin alchol shandon</td><td>Thermo 6766007 scientifico</td><td></td><td>Consumabile</td></tr><tr><td>Harris Hematoxylin</td><td>Thermo scientific</td><td>143907</td><td>Consumabile</td></tr></tbody></table>

valutazione delle terapie con cellule staminali in un modello di lesione bilaterale del tendine patellar in ratti

Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats

Medicina rigenerativa fornisce romanzo alternative a condizioni che sfidano i trattamenti tradizionali. La prevalenza e la morbosità di tendinopathy tra le specie, combinata con le proprietà curative limitate di questo tessuto, hanno richiesto la ricerca di terapie cellulari e azionato lo sviluppo di modelli sperimentali per studiare la loro efficacia. Cordone ombelicale matrix-derivate cellule staminali mesenchimali (UCM-MSC) sono candidati attraenti perché sono abbondanti, facili da raccogliere, eludere le preoccupazioni di ordine etico e il rischio di formazione di teratoma, ma assomigliano più molto attentamente a cellule staminali embrionali primitive rispetto adulto tessuto-derivato MSCs. significativo interesse si è focalizzato su chitosano come strategia per migliorare le proprietà di MSCs attraverso la formazione della sferoide. Questa carta dettagli tecniche per isolare UCM-MSCs, preparare sferoidi su pellicola di chitosano e analizzare l'effetto di formazione della sferoide sull'espressione di superficie dell'indicatore. Di conseguenza, creazione di un modello di lesione bilaterale del tendine patellar in ratti è descritto per l'impianto in vivo di UCM-MSC sferoidi formata sulla pellicola di chitosano. Nessuna complicazione è stata osservata nello studio rispetto alla morbosità, sottolineare crescenti effetti, o l'infezione del tessuto. Il Punteggio totale funzionale dei ratti operati alle 7 giorni era inferiore a quello dei ratti normali, ma hanno rinviato al normale entro 28 giorni dopo la chirurgia. Istologici punteggi di guarigione del tessuto ha confermato la presenza di un coagulo nei trattati difetti valutati a 7 giorni, assenza di reazione da corpo estraneo e progredendo guarigione a 28 giorni. Questo modello di difetto del tendine della rotula bilaterale controlla la variabilità inter-individuale tramite creazione di un controllo interno in ogni ratto, era associato con la morbosità accettabile e ha permesso la rilevazione delle differenze tra i tendini non trattati e trattamenti.

Nello studio corrente, i risultati sono presentati come media ± deviazione standard (deviazione standard). Le cellule sono state isolate dai cavi ombelicali di 6 mares, e percentuale di linee cellulari isolate che esprimono ogni indicatore della superficie delle cellule sotto condizionata standard o chitosano sono stati confrontati con un test di Friedman, come un'analisi della varianza non parametrica con ripetuto misure. Per la creazione di modelli di difetto del tendine, 8 ratti sono s...

Questo articolo descrive la preparazione e la valutazione di cordone ombelicale cellule staminali mesenchimali derivate matrice sferoidi con un modello di difetto bilaterale del tendine patellar in un ratto. Questo modello è stato associato con una morbilità accettabile ed è stato trovato per rilevare le differenze tra i tendini non trattati e trattati e tra i due trattamenti testato.

Valutazione delle terapie con cellule staminali in un modello di lesione bilaterale del tendine Patellar in ratti

Regenerative medicine provides novel alternatives to conditions that challenge traditional treatments. The prevalence and morbidity of tendinopathy across ...

Gli obiettivi generali di questo modello bilaterale di ratto sono ottimizzare l'uso degli animali e valutare i candidati al trattamento per i difetti tendinei. Questo metodo può aiutare a rispondere a qualsiasi domanda chiave in campo ortopedico. Come la valutazione della terapia cellulare sulla tendinopatia.Il vantaggio principale di questo modello è che controlla la variazione interindividuale, riducendo così il numero di animali necessari per rilevare le differenze tra i trattamenti. La dimostrazione visiva del modello è fondamentale perché la creazione di difetti del tendine rotuleo standardizzati bilaterali nei ratti è difficile da imparare. Il modello richiede una buona conoscenza dell'anatomia locale, forti competenze chirurgiche di base e precisione nel lavorare su piccole strutture.Per iniziare, lavare due volte un cordone ombelicale equino raccolto in una provetta da 50 millilitri utilizzando PBS a temperatura ambiente contenente antibiotici. Quindi, trasferisci il tessuto su una piastra da 150 millimetri e sezionalo in frammenti lunghi due pollici. Quindi trasferire i frammenti in una provetta da 50 millilitri e lavarli con PBS contenente antibiotici per rimuovere il sangue.Fallo due o tre volte a temperatura ambiente. Successivamente, tagliare longitudinalmente le parti frammentate del cordone ombelicale per esporre i vasi che corrono per tutta la sua lunghezza. Usando pinze e forbici, rimuovi questi vasi, che includono due arterie e una vena.Ora, da due o tre frammenti, raccogli la matrice gelatinosa che circonda i vasi. Raschialo via con un bisturi. Quindi tritare la matrice gelatinosa, nota anche come gelatina di Wharton, in pezzi fini.Successivamente, trasferire la gelatina in una provetta da 50 millilitri con 15 millilitri di collagenasi 0,1% di tipo 1A in PBS e incubare il tessuto a 37 gradi Celsius agitando delicatamente per tre o quattro ore fino a quando non è completamente sciolto. Successivamente, centrifugare il tessuto digerito e aspirare il surnatante. Ora, sospendiamo il tessuto digerito in 15 millilitri di PBS e mescoliamo mediante pipettaggio.Quindi, ripetere questo lavaggio con PBS tre volte utilizzando una centrifugazione più lenta. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le cellule in 15 millilitri di PBS e quindi utilizzare un colino da 100 micron per filtrare le cellule e centrifugare per cinque minuti a 150 volte g per raccogliere le cellule. Risospendere le cellule in 10 millilitri di terreno di coltura appena fatto a 37 gradi Celsius.Trasferire la sospensione in un pallone di coltura di 25 centimetri quadrati e incubare le cellule, cambiando il terreno ogni tre giorni. Quando le cellule raggiungono il 70-80% di confluenza, farle passare, aspirare il terreno e lavare le cellule due volte con PBS a temperatura ambiente senza antibiotici. Quindi utilizzare tre millilitri di tripsina edta allo 0,25% per staccare le cellule.Terminare la reazione con un'aggiunta di sei millilitri di terreno caldo. Raccogli le celle sospese e pellettale. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di terreno.Per completare il passaggio, riseminare un pallone di coltura tissutale con 5.000 cellule per centimetro quadrato e continuare a far crescere la coltura. Per iniziare, prepara una soluzione fresca di chitosano. Quindi caricare ogni pozzetto di una piastra a 12 pozzetti con 500 microlitri di soluzione.Agitare la piastra per distribuire la soluzione su tutte le superfici. Quindi, asciugare la piastra sotto una cappa a flusso laminare. Dopo 16-24 ore, si formerà un film sottile di chitosano nei pozzetti della piastra.Neutralizzare questo film aggiungendo un millilitro di idrossido di sodio normale 0,5 a ciascun pozzetto. Quindi, incubare la piastra per due ore a temperatura ambiente. Successivamente, aspirare l'idrossido di sodio da ciascun pozzetto e quindi lavare ogni pozzetto con un millilitro di acqua distillata.Eseguire tre lavaggi con acqua, quindi lavare ogni pozzetto con un millilitro di etanolo al 70% una volta. Dopo aver rimosso il lavaggio con etanolo, sostituirlo con un altro millilitro di etanolo al 70% e incubare la piastra per una notte in una cella a flusso laminare per sterilizzare il film di chitosano. Quindi, il giorno successivo, aspirare l'etanolo rimanente da ciascun pozzetto e lavare ogni pozzetto con PBS tre volte.Rimuovere il PBS, quindi sterilizzare ulteriormente la pellicola di chitosano utilizzando un'esposizione diretta notturna alla luce ultravioletta senza il coperchio. Ora, per formare sferoidi di cellule staminali mesenchimali derivate dal cordone ombelicale, seminare i pozzetti con 20.000 cellule e incubare la piastra in condizioni normali o ipossiche. Metti un ratto anestetizzato tra due bottiglie da 0,5 litri riempite con acqua tiepida e copri le bottiglie con un panno per mantenere il ratto al caldo senza incorrere in lesioni cutanee.Per ridurre il rischio di ipotermia, coprire il corpo con pluriball. Successivamente, per evitare traumi cutanei, applicare una crema depilatoria su entrambi i ginocchio e utilizzare un abbassalingua per rimuovere la crema e i capelli. Quindi, fissa ogni arto al tavolo.Ora, strofinare il sito chirurgico con clorexidina digluconato e risciacquare con etanolo al 70%. Fallo tre volte e procedi con l'intervento. Con un bisturi sterile numero 15, incidere la pelle in direzione prossimale o distale sulla faccia craniale mediale del ginocchio.Inizia l'incisione a circa un centimetro prossimalmente al livello della rotula ed estendila di circa cinque millimetri distalmente al tubercolo tibiale. Successivamente, libera il tessuto sottocutaneo sottostante con il bisturi e rifletti la pelle per esporre il tendine rotuleo. Ora, allinea un filo di Kirschner di 0,99 millimetri di diametro contro il tendine rotuleo tra l'aspetto distale della rotula e la tuberosità tibiale.Quindi, mantenendo stabile il filo, utilizzare il bisturi per praticare delle incisioni su entrambi i lati del filo, rilasciando una porzione di tendine larga circa un millimetro. Quindi resecare la sezione centrale prossimalmente e distalmente utilizzando le forbici dell'iride fine. Parallelamente, chiedi a un assistente di preparare il coagulo.Per fare ciò, scongelare il campione di plasma e mescolarne 20 microlitri con mezzo milione di cellule staminali mesenchimali. Successivamente, in una provetta da microcentrifuga, mescola sei microlitri di cloruro di calcio al 10% con 100 microlitri di plasma scongelato, questo attiverà quel plasma. Quindi, mescola la sospensione cellulare nel plasma attivato, questo causerà la coagulazione del plasma.Ora, posiziona il coagulo preparato all'interno del difetto del tendine rotuleo. Limitare la manipolazione del coagulo per ridurre al minimo il rilascio di liquidi dal coagulo. Quindi, utilizzando cinque o poliglactina nove 10 suture, chiudere accuratamente la fascia con un modello crociato senza interferire con il coagulo.Terminare chiudendo la pelle con un pattern intradermico. Le cellule sono state isolate dal cordone ombelicale di sei cavalle e coltivate in condizioni standard o su film di chitosano. Le cellule coltivate sul chitosano formavano sferoidi.Il modello di difetto del tendine rotuleo è stato testato su molti ratti e una serie di test comportamentali sono stati utilizzati per stimare il recupero. Entro 28 giorni dall'intervento, i ratti erano tornati alla forza basale dopo un deficit iniziale di forza misurato a sette giorni dopo l'intervento. All'esame istologico con colorazione tricromica di Masson, è stata osservata una moderata infiltrazione arteriosa e capillare insieme a una formazione di collagene da moderata a estesa, mentre la formazione di cartilagine non è stata supportata.Nel complesso, il modello bilaterale del difetto del tendine rotuleo limita la variazione interindividuale senza una morbilità significativa. In questo modo, si riduce il numero di animali necessari per i test. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare un modello di difetto della finestra del tendine rotuleo bilaterale di ratto e di come i ratti si riprendono da questo intervento chirurgico.Una volta padroneggiata, la procedura può essere eseguita in meno di 30 minuti con tre investigatori. Il primo investigatore prepara la cellula, il secondo esegue l'intervento chirurgico, mentre il terzo assiste all'intervento chirurgico e monitora l'anestesia. Seguendo questa procedura, è possibile utilizzare metodi come i test biomeccanici, l'istologia e l'immunoistochimica per confrontare l'effetto del trattamento sulla guarigione del tendine.

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