Procedure di fabbricazione e birifrangenza misurazioni per la progettazione di ioni lantanidi magneticamente reattivo chelanti del fosfolipide assembly

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fabbricare assemblaggi polimolecolari chelanti di ioni lantanidi altamente reattivi al campo magnetico e di monitorare facilmente la risposta magnetica con misure di birifrangenza. Le misure di birifrangenza possono aiutare a rispondere a domande chiave nella progettazione di assemblaggi polimolecolari magneticamente reattivi, come le bicelle, fornendo un mezzo alternativo e relativamente facile per monitorare l'allineamento. Il vantaggio principale di questi assemblaggi polimolecolari è la capacità di fornire una risposta magnetica non raffinata e sintonizzabile con un'intensità di campo di uno o due tesla, associandosi a numeri per ioni lantanidi magnetici.

Sebbene il monitoraggio del cercatore di birifrangenza fornisca informazioni importanti per la progettazione delle bicelle, può anche essere applicato allo studio di altri sistemi magneticamente reattivi, come i sedolos neurocristallini o le fibre amiloidi drogate con nanoparticelle di ossido di ferro. Per iniziare la procedura, utilizzare una siringa di vetro da 2,5 millilitri e fiale con tappo a scatto da tre millilitri per misurare le quantità necessarie di DMPC, DMPE-DTPA, colesterolo e soluzioni madre di cloruro di tulio (III). Unire le soluzioni madre in un pallone a fondo tondo da 25 millilitri.

Sciacquare ogni flaconcino nel pallone con 2,5 millilitri del solvente utilizzato nella soluzione madre corrispondente. Clamp il pallone su un evaporatore rotante. Rimuovere il solvente dalla miscela a 40 gradi Celsius sotto i 30.000 Pascal, fino a quando non rimane solo un film viscoso trasparente.

Ridurre la pressione a 100 Pascal e continuare a prelevare il campione per un minimo di due ore per ottenere un film lipidico asciutto. Quindi, sciacquare il pallone con argon per un minuto. Sigillare il pallone con pellicola di paraffina e conservare il campione a 18 gradi Celsius.

Quando si è pronti per reidratare il lipide, aggiungere tre millilitri di tampone fosfato a pH 7,4 da 15 millimolari nel pallone. Ruotare il pallone in un bagno di azoto liquido fino a quando il campione non è completamente congelato, come indicato dal fatto che l'azoto liquido non bolle più. Quindi, ruotare il pallone per 5 minuti a bagnomaria impostato a 60 gradi Celsius.

Una volta che il campione è completamente liquido, agitare il campione per 30 secondi. Dopo l'ultima fase di congelamento, stabilizzare il campione con due cicli di riscaldamento-raffreddamento. Innanzitutto, ottenere filtri a membrana in policarbonato incisi a binario con la dimensione dei pori desiderata per l'estrusione.

Iniziare ad assemblare un estrusore di lipidi da 10 millilitri con un recipiente per campioni incamiciato, aiutato da una pinzetta con punta in silicone. Utilizzare alcune gocce di tampone fosfato per bagnare la rete di supporto e il disco di drenaggio in poliestere per un posizionamento ottimale del filtro a membrana. Appoggiare con cura l'O-ring sul filtro a membrana.

Assicurarsi che non vi siano pieghe o pieghe sulla membrana. Terminare l'assemblaggio dell'estrusore lipidico e collegare il recipiente del campione incamiciato a un circolatore d'acqua a temperatura controllata. Riscaldare il bagnomaria del circolatore a 60 gradi Celsius e avviare la circolazione.

Collegare l'estrusore a una bombola di azoto pressurizzato utilizzando un tubo in PVC ad alta pressione e raccordi ad attacco rapido. Impostare la pressione di estrusione sul valore appropriato per la dimensione dei pori della membrana. Utilizzare una pipetta di vetro da due millilitri per aggiungere il campione al recipiente incamiciato.

Chiudere il recipiente e lasciare che il campione si equilibri per 30-60 secondi. Posizionare l'estremità del tubo di uscita del campione nel pallone del campione. Quindi, aprire il flusso di azoto verso l'estrusore tenendo fermo il tubo di uscita del campione.

Una volta terminata l'estrusione del campione, sfiatare l'estrusore e utilizzare la stessa pipetta di vetro da due millilitri per trasferire il campione estruso nel recipiente incamiciato. Eseguire 10 cicli di estrusione in questo modo. Sostituzione del filtro a membrana ogni volta che inizia ad intasarsi.

Ripetere l'estrusione con pori di dimensioni più piccole a piacere. Accendere e configurare l'apparecchio per la misurazione della birifrangenza. Quindi, posizionare il campione in una cuvetta di quarzo a temperatura controllata con una lunghezza del percorso di 10 millimetri.

Collegare la cuvetta a un bagnomaria esterno impostato a cinque gradi Celsius. Inserire una termocoppia di tipo k di 0,5 millimetri di spessore nel campione attraverso un'apertura nel cappuccio. Regolare la temperatura del bagno d'acqua in base alla lettura della termocoppia fino a quando il campione raggiunge i cinque gradi Celsius.

Posizionare la cuvetta nel foro del magnete. Verificare che la termocoppia non si trovi nel percorso del laser tenendo un foglio di carta nel percorso del laser oltre la cuvetta e cercando le ombre proiettate dalla termocoppia. È importante monitorare direttamente la temperatura del campione, ma la sonda non deve essere d'intralcio alla luce laser.

Questo viene facilmente verificato con la carta bianca posizionata nel percorso del laser dopo la cuvetta e alla ricerca di ombre. Applicare un flusso costante di aria compressa secca a temperatura ambiente a 10.000 Pascal sulla cuvetta, per evitare la formazione di condensa. Selezionare i moltiplicatori di sensibilità dell'amplificatore, assicurandosi che l'amplificatore non sia sovraccaricato e che sul display non appaiano più di quattro barre rosse.

Quindi, sfasare automaticamente entrambi gli amplificatori di blocco. La torbidità del campione può cambiare drasticamente durante un ciclo di temperatura a causa di riarrangiamenti polimolecolari. La torbidità più alta si verifica solitamente a basse temperature e per evitare un sovraccarico del segnale durante il riscaldamento, la sensibilità non deve essere impostata su un valore troppo alto a cinque gradi Celsius.

Inserisci il nome del campione e le sensibilità dell'amplificatore di blocco. Immettere un nome file per la misurazione e avviare la registrazione dei dati. Quindi, aumentare il campo magnetico a 5,5 Tesla utilizzando il programma di misurazione.

Acquisisci i dati del segnale di birifrangenza a varie temperature del campione e intensità del campo magnetico come desiderato. Il segnale di birifrangenza delle bicelle drogate con colesterolo estruse attraverso membrane con pori di 800 nanometri aumentava con l'aumentare dell'intensità del campo magnetico, con un picco di birifrangenza raggiunto a 5,5 Tesla. Estrusioni successive a 60 gradi Celsius attraverso membrane con dimensioni dei pori decrescenti hanno portato a valori di birifrangenza decrescenti a cinque gradi Celsius.

È stata osservata anche una riduzione del fattore di allineamento assoluto. Questi risultati hanno indicato che l'allineamento magnetico potrebbe essere regolato regolando le dimensioni delle bicelle mediante estrusione dei loro precursori vescicolari. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita quotidianamente per esaminare efficacemente molti campioni e identificare i candidati più promettenti, fornendo un rease bond magnetico ottimale dell'intervallo di temperatura richiesto.

Dopo aver identificato con successo il campione più promettente con questa procedura, è possibile eseguire metodi come la diffusione di neutroni a piccolo angolo o la microscopia elettronica a trasmissione criogenica per rispondere a ulteriori domande sulla struttura delle proprietà chimico-fisiche degli assemblaggi. Quando si lavora con assemblaggi lipidici, come le bicelle qui presentate, è importante lavorare con vetreria pulita in un ambiente tranquillo. Si consiglia di dedicare vetreria a questo lavoro e di lavare con cloroformio.