Name: DNA-magnetoscopico associazione analisi di dispersione della luce dinamica ed elettroforetica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Impara a analizzare il legame DNA-particelle magnetiche tramite scattering della luce dinamico ed elettroforetico. Questo metodo consente di valutare dimensioni, polidispersità e potenziale zeta per ottimizzare l'efficienza di interazione biomolecolare.

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Il sostegno finanziario dalla ceca Science Foundation (progetto GA CR 17-12816S) e CEITEC 2020 (LQ1601) notevolmente è riconosciuto.

1. sintesi di nanoparticelle magnetiche <ol><li>sintesi di nanoparticelle magnetiche stabilizzato con citrato (MNPs) <ol><li>aggiungere 20 mmol di FeCl 3 &#8729; 6 H 2 O (5,406 g) e 10 mmol di FeCl 2 &#8729; 4 H 2 O (1,988 g) in 20 mL di acqua distillata doppia deossigenata (ddd acqua). Mescolare ottenuti soluzione vigorosamente in Becher sotto atmosfera di 2 N tramite agitatore meccanico fino ad ottenuta una soluzione trasparente.</li>
		<li>Sotto agitazione meccanica rapida, aggiungere 150 mL di 1m NH 4 OH, goccia a goccia utilizzando imbuto (prendere 1 ora o più se necessario). Dopo aver aggiunto tutti gli NH 4 OH, trasferire la soluzione in un recipiente avvitabile. Avvitare la soluzione nave e calore a 75 ° C per 30 min. 
		Attenzione: NH 4 OH è classificato come corrosivo e pericoloso per l'ambiente. 
		Nota: Preparare soluzione NH 4 OH alto grado 28% NH 4 OH in acqua usando acqua deossigenata.</li>
		<li>Raccogliere il precipitato nero utilizzando il magnete e lavare con 100 mL di acqua di ddd. Ripetere 3 volte. Aggiungere 50 mL di 0.5 M tri-sodio citrato diidrato di precipitare. Avvitare la nave. 
		Nota: Utilizzare deossigenata soluzione di tri-sodio citrato diidrato.</li>
		<li>Ri-disperdere il precipitato tramite sonicazione (35 kHz, ampiezza del 100%) e nave di calore a 80 ° C per 1 h. 
		Nota: È necessario un sonicatore di potenza sufficiente.</li>
		<li>Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente. Raccogliere il precipitato utilizzando un magnete e rimuovere il surnatante. Ri-disperdere fango nero in 50 mL di acqua di ddd utilizzando sonicatore (35 kHz, ampiezza del 100%).</li>
		<li>Trasferire aliquote (~ 25 mL) in provette da centrifuga 50 mL e aggiungere 20 mL di acetone. Centrifugare a 2400 x g per 10 min e rimuovere i surnatanti.</li>
		<li>Ri-disperdere precipitato e Dializzare soluzione contro acqua utilizzando il dispositivo di dialisi di taglio basso peso molecolare (Da 500-1.000) di volume adatto per 24 h. 
		Nota: Preparare il dispositivo di dialisi secondo produttore &#39; requisiti di s.</li>
	</ol></li> <li>Sintesi di nanoparticelle magnetiche modificate con ramificati polyethylenimine (MNPs_PEI) <ol><li>aggiungere 2 mL di soluzione ottenuta allontaneranno (~0.1 g/mL) in un becher di vetro. Aggiungere 38 mL di acqua di ddd e Sonicare (35 kHz, ampiezza del 100%) la sospensione (10 min).</li>
		<li>Sotto agitazione meccanica rapida, aggiungere 10 mL di 10% si è ramificata polyethylenimine (media 25 kDa). Mescolare la soluzione per le successive 3 h.</li>
		<li>Raccogliere precipitare con magnete e rimuovere il surnatante. Ri-disperdere precipitato in 20 mL di acqua di ddd. Ripetere 5 volte quindi sottoporre ad ultrasuoni la sospensione finale (35 kHz, ampiezza del 100%).</li>
	</ol></li> <li>Sintesi di nanoparticelle magnetiche particelle modificato con silice (MNPs_TEOS) <ol><li>aggiungere 10 mL della soluzione ottenuta allontaneranno (~0.1 g/mL) in un becher di vetro. Aggiungere 60 mL di acqua e 130 mL di etanolo. Sottoporre ad ultrasuoni soluzione e aggiungere 6 mL di 28% NH 4 OH.</li>
		<li>Sotto agitazione meccanica rapida, aggiungere 1 mL di ortosilicato. Mescolare la soluzione per le successive 12 h.</li>
		<li>Raccogliere precipitato nero con magnete e lavarlo con 50 mL di etanolo (3 volte) e 50 mL di acqua (3 volte). Ri-disperdere le particelle in 10 mL di ddd acqua e Sonicare la sospensione (35 kHz, ampiezza del 100%).</li>
	</ol></li> <li>Sintesi di nanoparticelle magnetiche modificate con gruppi amminici (MNPs_APTES) <ol><li>aggiungere 5 mL della soluzione ottenuta MNPs_TEOS (~0.1 g/mL) in un becher di vetro. Aggiungere 45 mL di acqua e 50 mL di etanolo. Sottoporre ad ultrasuoni soluzione (35 kHz, ampiezza del 100%).</li>
		<li>Sotto agitazione meccanica rapida, aggiungere 0,5 mL di trietossisilano (3-amminopropil). Mescolare la soluzione per le successive 3 h.</li>
		<li>Raccogliere precipitato nero con magnete e lavarlo con 50 mL di etanolo (3 volte) e 50 mL di acqua (3 volte). Ri-disperdere le particelle in 5 mL di ddd acqua e Sonicare la sospensione (35 kHz, ampiezza del 100%).</li>
	</ol></li></ol> 2. Sintesi di microparticelle magnetiche <ol><li>sintesi di microparticelle magnetiche stabilizzato con citrato (MMPs) <ol><li>aggiungere 25 mL di 2m KNO 3, 12,5 mL di 1 M di KOH e 205,875 mL di acqua di ddd in un vaso avvitabile. Aggiungere mL 6,675 di 1m FeSO 4 durante l'agitazione magnetica. Immediatamente la nave trasferimento ad un bagno di acqua preriscaldata (90 ° C) per 2 h. 
		Nota: Preparare soluzioni KOH in ddd e KNO 3 acqua.</li>
		<li>Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente. Raccogliere il precipitato nero utilizzando il magnete e lavare con 50 mL di acqua di ddd (5 volte). Aggiungere 50 mL di 0.5 M tri-sodio citrato diidrato di precipitare. Avvitare la nave.</li>
		<li>Redisperse il precipitato tramite sonicazione (35 kHz, ampiezza del 100%) e nave di calore a 80 ° C per raccogliere precipitato nero h. 1, utilizzando il magnete e lavare con 50 mL di acqua di ddd (10 volte).</li>
		<li>Modificare MMPs con ramificati polyethylenimine (MMPs_PEI), silice (MMPs_TEOS) ed i gruppi amminici (MMPs_APTES) simile al protocollo allontaneranno. Fare riferimento alle sezioni 2.2, 2.3 e 2.4, rispettivamente per maggiori dettagli.</li>
	</ol></li> <li>Sintesi di microparticelle magnetiche modificate con ramificati polyethylenimine (MMPs_PEI) <ol><li>aggiungere 5 mL di soluzione di MMPs (~0.1 g/mL) in un becher di vetro. Aggiungere 38 mL di acqua di ddd e Sonicare la soluzione (35 kHz, ampiezza del 100%, 10 min). Sotto agitazione meccanica rapida aggiungere 10 mL di 10% si è ramificata polyethylenimine (media 25 kDa). Mescolare la soluzione per le successive 3 h.</li>
		<li>Raccogliere precipitato utilizzando un magnete e rimuovere il surnatante. Redisperse precipitato in 20 mL di acqua distillata doppia. Ripetere 5 volte quindi sottoporre ad ultrasuoni la soluzione finale (35 kHz, ampiezza del 100%).</li>
	</ol></li> <li>Sintesi di microparticelle magnetiche modificate con silice (MMPs_TEOS) <ol><li>aggiungere 5 mL di soluzione di MMPs (~0.1 g/mL) in un becher di vetro. Aggiungere 60 mL di acqua e 130 mL di etanolo. Sottoporre ad ultrasuoni sospensione (35 kHz, ampiezza del 100%) e aggiungere 6 mL di 28% NH 4 OH.</li>
		<li>Sotto agitazione meccanica rapida, aggiungere 1 mL di ortosilicato. Mescolare la soluzione per le successive 12 h.</li>
		<li>Raccogliere precipitato nero utilizzando un magnete e lavarlo con 50 mL di etanolo (3 volte) e 50 mL di acqua (3 volte). Redisperse particelle in 5 mL di acqua di ddd e Sonicare la sospensione (35 kHz, ampiezza del 100%).</li>
	</ol></li> <li>Sintesi di microparticelle magnetiche modificate con gruppi amminici (MMPs_APTES) <ol><li>aggiungere 3 mL di soluzione di MMPs_TEOS (~0.1 g/mL) in un becher di vetro. Aggiungere 45 mL di acqua e 50 mL di etanolo. Sottoporre ad ultrasuoni la sospensione (35 kHz, ampiezza del 100%).</li>
		<li>Sotto agitazione meccanica rapida, aggiungere 0,5 mL di trietossisilano (3-amminopropil). Mescolare la soluzione per le successive 3 h.</li>
		<li>Raccogliere precipitato nero con magnete e lavarlo con 50 mL di etanolo (3 volte) e 50 mL di acqua (3 volte). Redisperse particelle in 3 mL di acqua di ddd e Sonicare la sospensione (35 kHz, ampiezza del 100%).</li>
	</ol></li></ol> 3. Magnetiche delle particelle dimensione analisi utilizzando DLS <ol><li>dimensione delle particelle in acqua <ol><li>uso un DLS strumento che si applica un angolo di rilevatore di dispersione posteriore (173 °) e una lunghezza d'onda del fascio di 633 nm. 
		Nota: Back scattering DLS è adatto per campioni concentrati dove può essere evitato quantistico. Scattering avanti (angolo di rilevatore 15°) e dispersione laterale (angolo 90° del rivelatore) DLS sono adatti per le particelle più piccole e misto particelle, rispettivamente.</li>
		Sonicare <li>priore a misura in acqua, particelle per 3 min. 
		Nota: Utilizzare soluzione diluita delle particelle. Per questo scopo, è necessario mescolare 9,6 µ l di particelle con 96 µ l di acqua.</li>
		<li>Attentamente Pipettare 50 µ l di soluzione di particelle in lattice in polistirolo le provette ed evitare la formazione di bolle. 
		Nota: Per ogni campione, utilizzare cuvette monouso (Vedi tabella dei materiali).</li>
		<li>Nota la chiarezza della provetta e la direzione del fascio di luce. Inserire la cella in supporto del campione e chiudere la camera.</li>
		<li>Utilizzare i seguenti parametri per la misurazione: temperatura: 25 ° C, indice di rifrazione della fase dispersiva (ferro): 2.344; indice di rifrazione dell'ambiente dispersivo (acqua): 1.333 
		Nota: Eseguire la misurazione dell'indice di rifrazione usando un rifrattometro per risultati più precisi, particolarmente quando lo sviluppo di materiali nuovi o ibrido.</li>
	</ol></li></ol> 4. Preparazione del DNA Stock, particelle magnetiche e Binding Buffer <ol><li>stock di DNA <ol><li>uso tampone di 10 mM Tris-HCL (pH = 8) per la diluizione e la conservazione del DNA. Utilizzare un campione di DNA standard che può essere amplificato in modo specifico con un protocollo PCR diretto in laboratorio (fare riferimento alla sezione 5.2 per reazione impostazioni e condizioni). Per amplificare 498 coppia di basi (bp) del gene xis dal controllo del batteriofago λ, utilizzare i seguenti primer. Forward primer: 5 &#39; - CCTGCTCTGCCGCTTCACGC - 3Ɔ Reverse primer: 5 &#39; - TCCGGATAAAAACGTCGATGACATTTGC - 3 &#39;</li> <li>prodotto di PCR di purificare utilizzando kit di purificazione di DNA commerciale. 
		Nota: Kit commerciali utilizzando procedure basata su colonna di silice yield &#62; purificata 100 ng / µ l DNA.</li>
		<li>Misura di concentrazione di DNA usando metodo spettrofotometrico (assorbanza a 260 nm). Diluire lo stock di DNA di 10 11 copie / µ l come indicato sopra per soluzioni di lavoro di 10 10, 10 9, 10 8 e 10 7 copie / µ l. 
		Nota: Il numero di copie del prodotto PCR può essere calcolato secondo la seguente equazione, supponendo che il peso molecolare medio è Da 650 per ogni bp: DNA copie / µ l = (quantità in ng / µ l * 6.022x10 23 copie/mol) / (498 bp * 650 g/mol di bp * 1 x 10 9 ng/g)</li></ol></li> <li>particelle magnetiche <ol><li>le particelle di sedimento senza il magnete e rimuovere il surnatante. Mescolare 01:20 rapporto v/v di particelle magnetiche con acqua ddd (particelle: acqua). 
		Nota: Approccio basato su Volume viene utilizzato per descrivere la quantità di particelle magnetiche poiché masse uguali di allontaneranno e MMP sono state prontamente difficile confrontare.</li>
	</ol></li> <li>Binding buffer <ol><li>per la rapida preparazione di soluzione di 0,75 M sodio acetato-HCL (pH = 6), mescolare 1 mL di acetato di sodio 3 M con 3 mL di HCL 1 mM. 
		Nota: Tutte le soluzioni utilizzate in associazione possono essere conservate a 4 ° C. notare che bassa temperatura aumenta significativamente associazione particolarmente nel caso di soluzione in etanolo. Controllare attentamente la temperatura delle soluzioni per migliore riproducibilità e l'accuratezza dello screening.</li>
	</ol></li></ol> 5. Test efficienza di DNA isolamento mediante PCR quantitativa <ol><li>isolamento del DNA di MMPs o MNPs modificato <ol><li>utilizzare una piastra a 96 pozzetti e un magnete personalizzato per piastra a 96 pozzetti per esperimenti di piccolo volume.</li>
		<li>Utilizzare la seguente miscela di soluzione di associazione: 8 µ l per volta MMPs o allontaneranno, 10 µ l sodio acetato-HCl (0,75 M, pH = 6), 60 µ l di 85% di etanolo, 10 µ l DNA (10 10 copie soluzione).</li>
		<li>Mix bene pipettando e posizionare la piastra sul magnete per 3 min. Mentre la piastra è sul magnete, rimuovere la soluzione e aggiungere 100 µ l di etanolo di 85% per il lavaggio.</li>
		<li>Rimuovi etanolo. 
		Nota: Consentire l'etanolo ad asciugare per qualche secondo ma non lasciate che le particelle asciugare troppo o mostrare crepe. Se le particelle asciugare troppo saranno difficili da sciogliere con soluzione per eluizione.</li>
		<li>Togliere la piastra dal magnete e aggiungere 40 µ l di soluzione per eluizione. Mescolare bene il pipettaggio. Posizionare la piastra posteriore sul magnete e raccogliere DNA eluito (~ 37 µ l). Memorizzare l'eluente a-20 ° C fino a ulteriore analisi.</li>
	</ol></li> <li>PCR quantitativa <ol><li>utilizzare il primer che servivano a preparare brodo del DNA nel passaggio 4.1.1 per quantificare le copie del gene xis, secondo il protocollo di Haddad et al. 10</li> <li>preparare soluzione mix master secondo la quantità di campioni da testare, quindi distribuire la miscela in provette PCR o una piastra a 96 pozzetti fondo bianco.</li>
		<li>Utilizzare le seguenti quantità per un intero volume di miscela PCR 20 µ l: 10 della polimerasi µ l / intercalanti di miscela colorante (Vedi tabella dei materiali), 2 µ l di campione di DNA, 2 µ l forward primer per (10 µM), 2 µ l reverse primer (10 µM)</li>
		<li>Impostare il termociclatore secondo il seguente programma: 95 ° C per 120 s, 40 cicli (95 ° C per 15 s, 64 ° C per 15 s, 68 ° C per 45 s), 68 ° C per 5 min.</li>
		<li>Using triplici copie per standard e campioni, calcolare la soglia del ciclo e costruire una curva standard per stimare il numero di copie di DNA estratto in ciascun campione. Lo strumento utilizzato qui questo esegue automaticamente.</li>
		<li>Qui, il numero di copie di DNA è stimato per volume di eluizione totale (~ 40 µ l). Percentuale di DNA Estratto corrispondente importo originale aggiunto all'associazione di soluzione (totalmente 10 11 copie) può variare oltre l'intervallo da 0 a 100.</li>
	</ol></li></ol> 6. DNA-magnetici particelle associazione analisi utilizzando DLS <ol><li>Associazione di DNA <ol><li>per grande volume esperimenti (in provetta da 1,5 mL), utilizzare la seguente miscela di soluzione di associazione: 96 µ l per volta MMPs o allontaneranno, 120 µ l sodio acetato-HCl (0,75 M, pH = 6), 720 µ l di etanolo di 85%, 120 µ l DNA (10 10 copie soluzione) o 120 µ l di tampone Tris-HCL (10 mM, pH = 8) per il controllo.</li>
	</ol></li> <li>Analisi del potenziale zeta <ol><li>preparare due soluzioni vincolanti, uno con il DNA e l'altro con tampone Tris-HCL per controllo come indicato al punto 6.1.1. Per evitare la formazione di bolle, Pipettare attentamente 800 µ l della miscela associazione in un cellulare usa e getta. 
		Nota: Utilizzare cuvette monouso per la misura del potenziale zeta superficie (vedere la tabella dei materiali).</li>
	</ol></li> <li>Utilizzare i seguenti parametri per la misurazione su strumento DLS: Smoluchowski modello con un F(ka) di 1,5, temperatura: 25 ° C, indice di rifrazione della fase dispersiva (ferro): 2.344, indice di rifrazione dell'ambiente dispersivo (acqua): 1.333. 
	Nota: Il tasso di interazione particella di DNA-magnetica colpisce direttamente la misurazione delle ripetizioni. Una singola misurazione dallo strumento prende 60-70 s. Qui, lo strumento è stato incaricato di prendere 10 misurazioni con 1 min intervalli di ritardo. Per semplicità, i risultati verranno mostrati a tempo = 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 e 18 min dalla prima lettura.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In questo protocollo, i principi teorici che spiegano il legame al DNA di particelle magnetiche via potenziale zeta erano sotto la domanda. Il protocollo descrive la sintesi e la modifica di nanoparticelle magnetiche e microparticelle. Metodo per la preparazione della soluzione di controllo e l'associazione del DNA inoltre sono descritti. Due strategie sono mostrate qui per lo screening delle interazioni DNA-particella: PCR quantitativa e liste di distribuzione si avvicina. DLS fornisce tre indicatori di cambiamenti fisi...

Isolamento del DNA è uno dei passi più importanti nella biologia molecolare. Lo sviluppo di metodi di estrazione dell'acido nucleico ha grande impatto sui campi emergenti della genomica, metagenomica, epigenetica e trascrittomica. C'è una vasta gamma di applicazioni biotecnologiche per isolamento del DNA compreso medico (strumenti forensi/diagnostica e biomarcatori prognostici) e applicazioni ambientali (biodiversità metagenomica, la prevalenza del patogeno e sorveglianza). C'è stata la crescente domanda di purificare e isolare il DNA da materiali diversi e in diverse scale come sangue, urina, terra, legno e altri tipi di campioni. 1 , 2 , 3 , 4
Particelle di nano - e micro-imprese sono adatte per isolamento del DNA a causa della loro elevata area superficiale e in particolare quando essi possono essere immobilizzati da un campo magnetico. Proprietà fisico-chimiche delle particelle, ad esempio dimensioni o carica, può notevolmente influenzare la loro capacità di legare biomolecole di destinazione. 5 per migliorare ulteriormente l'associazione di biomolecole e stabilizzare le particelle, diverse modificazioni chimiche (rivestimenti superficiali) possono essere utilizzati. Le diverse strategie per l'associazione sono classificate secondo le interazioni covalenti e non covalenti. 6 la dimensione delle particelle influenza direttamente la loro proprietà di magnetizzazione, considerando che la composizione delle particelle può essere adattato per incorporazione di metallico, lega o altri materiali che possono influire sulla sua densità, porosità e superficie. 7 non c'è alcun modo affidabile per misurare la carica superficiale di piccole particelle. Invece, il potenziale elettrico piano di scivolamento (certa distanza dalla superficie delle nanoparticelle) può essere misurata. 8 questo valore è chiamato potenziale zeta ed è un potente strumento che solitamente utilizzato per la valutazione della stabilità di nano e microparticelle tramite liste di distribuzione. 9 poiché il suo valore dipende non solo il pH e forza ionica dell'ambiente dispersivo, ma anche le caratteristiche della superficie delle particelle, può anche dimostrare i cambiamenti in questa superficie causata dall'interazione tra la particelle e molecola di interesse. 10
D'altra parte, la struttura del DNA in condizioni disidratate (modulo A-DNA) esposizioni compattato conformazioni che facilitano la relativa precipitazione (aggregazione) rispetto a comunemente che si verificano forma B-DNA. Elettrostatica (ionico e H-bond) sono le principali forze che controllano l'associazione del DNA da altri materiali a causa di loro fosfato stericamente accessibile e azoto basi (in particolare guanina). 7 , 10
In questo lavoro, sono analizzate tre modifiche chimiche rappresentative di nanoparticelle magnetiche e microparticelle (Figura 1A). Il metodo di sintesi e modificazione chimica di nanoparticelle e microparticelle è descritto. Una soluzione di associazione, che accordi ai principi teorici di precipitazione del DNA (pH, forza ionica e disidratazione), viene utilizzata per valutare l'eluizione e grippaggio del DNA. PCR quantitativa viene utilizzata per valutare l'efficienza di eluizione del DNA dalla rappresentante nanoparticelle e microparticelle (Figura 1B). Dimensione delle particelle, l'indice di polidispersione e potenziale zeta sono parametri importanti che vengono utilizzati per visualizzare le modifiche fisico-chimiche che si verificano sulla superficie della particella (Figura 1). È importante sottolineare la caratterizzazione chimica della superficie della particella magnetica. Mentre questo passaggio era oltre l'ambito del presente protocollo, diverse moderne tecniche possono essere applicate per studiare l'efficienza delle modificazioni chimiche. 11 , 12 , 13 , 14 spettroscopia infrarossa trasformata di Fourier (FTIR) può essere utilizzata per valutare lo spettro infrarosso della superficie della particella e confrontarlo con lo spettro dei modificatori chimici gratis. Spettroscopia fotoelettronica a raggi x (XPS) è un'altra tecnica che può essere utilizzata per identificare la composizione elementare della superficie del materiale. Altri metodi elettrochimici, microscopiche e spettroscopiche utilizzabile per far luce sulla qualità della sintesi delle particelle. Questo lavoro evidenzia una nuova prospettiva per l'analisi di interazioni DNA-magnetiche di particelle tramite liste di distribuzione.

<table><tbody><tr><td>Cloruro di ferro (III) esaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>207926</td><td>Sintesi di particelle magnetiche</td></tr><tr><td>Cloruro di ferro (II) tetraidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>380024</td><td>Sintesi di particelle magnetiche</td></tr><tr><td>Solfato di ferro (II) eptaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8263</td><td>Sintesi di particelle magnetiche</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Penta</td><td>10060-11000</td><td>Sintesi di particelle magnetiche</td></tr><tr><td>Citrato di sodio diidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302600</td><td>Sintesi di particelle magnetiche</td></tr><tr><td>Ortosilicato tetraetile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>131903</td><td>Sintesi di particelle magnetiche</td></tr> <tr><td>(3-amminopropil)trietossisilano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td>Sintesi di particelle magnetiche</td></tr><tr><td>Polietilenimmina, ramificata, media Mw ~25.000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td>Sintesi di particelle magnetiche</td></tr><tr><td>Soluzione di idrossido di ammonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221228-M&nbsp;</td><td>Sintesi di particelle magnetiche</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Penta</td><td>71250-11000</td><td>Sintesi di particelle magnetiche</td></tr><tr><td>Nitrato di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6083</td><td>Sintesi di particelle magnetiche</td></tr><tr><td>Idrossido di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05012</td><td>Sintesi di particelle magnetiche</td></tr><tr><td>ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa)</td><td>Spectrum labs</td><td>G235063</td><td>Sintesi</td></tr> <tr><td>di particelle magneticheAgitatore ad asta</td><td>witeg Labortechnik GmbH</td><td>DH. WOS01035</td><td>Sintesi di particelle magnetiche</td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Memmert GmbH + Co.</td><td>84198998</td><td>Sintetizzatore di particelle magnetiche</td></tr><tr><td>Sonicatore</td><td>Bandelin</td><td>795</td><td>Sintesi di particelle magnetiche</td></tr><tr><td>MARCA Cuvetta UV micro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR759200-100EA</td><td>Cuvetta per la misurazione delle dimensioni</td></tr><tr><td>MARCA tappo per cuvetta UV micro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR759240-100EA</td><td>Tappi per cuvette per la misurazione delle dimensioni</td></tr><tr><td>Piegato Capillare Zeta Cell</td><td>Malvern</td><td>DTS1070</td><td>Cuvetta per la misurazione del potenziale zeta</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern</td><td>ZEN3600</td><td>Dispositivo per la misurazione delle dimensioni e del potenziale zeta</td></tr><tr><td>Infinite 200 PRO Strumento NanoQuant</td><td>Tecan</td><td>396 227 V1.0, 04-2010</td><td>dispositivo per la misurazione della concentrazione di DNA</td></tr><tr><td>SYBR Green Kit RT-PCR quantitativo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>QR0100</td><td>Kit PCR</td></tr><tr><td>Mastercycler pro S strumento</td><td>Eppendorf</td><td>6325 000.013</td><td>Termociclatore</td></tr><tr><td>Kit MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Kit di purificazione del DNA</td></tr><tr><td>Acetato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7670</td><td>Legame del DNA</td></tr></tbody></table>

dna-magnetoscopico associazione analisi di dispersione della luce dinamica ed elettroforetica

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

Isolamento di DNA usando particelle magnetiche è un campo di grande importanza nella ricerca di biologia molecolare e biotecnologia. Questo protocollo descrive la valutazione del DNA-magnetoscopico vincolante tramite diffusione dinamica della luce (DLS) e dispersione della luce elettroforetica (ELS). Analisi di DLS fornisce preziose informazioni sulle proprietà fisico-chimiche delle particelle tra cui la dimensione delle particelle, polidispersità e potenziale zeta. Quest'ultimo descrive la carica superficiale della particella che svolge un ruolo importante nell'associazione elettrostatica di materiali come il DNA. Qui, un'analisi comparativa sfrutta tre modifiche chimiche di nanoparticelle e microparticelle e loro effetti sul legame del DNA e di eluizione. Modificazioni chimiche di ramificata polyethylenimine, tetraetile ortosilicato e (3-amminopropil) trietossisilano sono studiati. Poiché DNA esibisce una carica negativa, si prevede che il potenziale zeta della superficie della particella diminuirà legandosi di DNA. Formando dei cluster dovrebbe essere estesa anche dimensione delle particelle. Al fine di indagare l'efficacia di queste particelle in isolamento ed eluizione del DNA, le particelle sono mescolate con DNA a basso pH (~ 6), alta forza ionica e ambiente di disidratazione. Le particelle vengono lavate il magnete e quindi il DNA è eluito dal tampone Tris-HCl (pH = 8). Numero di copie di DNA è stimato usando reazione a catena quantitativa della polimerasi (PCR). Potenziale Zeta, dimensione delle particelle, polidispersità e dati quantitativi di PCR sono valutati e confrontati. DLS è un perspicace e sostenere il metodo di analisi che aggiunge una nuova prospettiva al processo di proiezione di particelle per isolamento del DNA.

Mediante il protocollo descritto qui per sintesi chimica e la modifica delle particelle magnetiche, sei particelle magnetiche sono state sintetizzate e analizzate per il grippaggio del DNA. Una sintesi dell'analisi è mostrata nella tabella 1. Confrontando le dimensioni delle particelle in acqua e in soluzione di rilegatura, è chiaro che tutte le particelle aggregate in associazione soluzione da pieghe 2-22. Alcune particelle aggregate ulteriormente a più pieghe in presenz...

Questo protocollo descrive la sintesi delle particelle magnetiche e valutazione delle loro proprietà di legame al DNA tramite dispersione della luce dinamica ed elettroforetica. Questo metodo si concentra sul monitoraggio dei cambiamenti nella dimensione delle particelle, loro polidispersità e potenziale zeta della superficie delle particelle che svolgono importanti ruolo nell'associazione di materiali come il DNA.

DNA-magnetoscopico associazione analisi di dispersione della luce dinamica ed elettroforetica

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di analizzare il legame del DNA e delle particelle magnetiche attraverso la diffusione dinamica ed elettroforetica della luce. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biotecnologia, come ad esempio, quanto velocemente e forte è il legame tra acido nucleico e particelle magnetiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è la visualizzazione dei cambiamenti fisico-chimici sulle particelle come la dimensione, la polidispersione o il potenziale zeta. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi molecolare a causa della crescente domanda di isolamento rapido e sensibile del DNA. In questa procedura, aggiungere 20 millimoli di cloruro ferrico e dieci millimoli di cloruro ferroso in 20 millilitri di acqua doppia distillata deossigenata.Successivamente, mescolare energicamente la soluzione ottenuta in un becher in atmosfera di azoto gassoso utilizzando un agitatore meccanico fino ad ottenere una soluzione trasparente. Quindi, sotto agitazione meccanica rapida, aggiungere 150 millilitri di un molare di ammoniaca acquosa goccia a goccia utilizzando un imbuto a goccia per un'ora. Successivam

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DNA-magnetoscopico associazione analisi di dispersione della luce dinamica ed elettroforetica

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