Creazione di un modello geometrico strutturalmente realistico agli elementi finiti di un Cardiomyocyte per studiare il ruolo dell'architettura cellulare in biologia dei sistemi del Cardiomyocyte

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare un modello agli elementi finiti spazialmente dettagliato dell'architettura intracellulare di una cellula cardiaca. Questo modello è stato creato a partire da dati di microscopia elettronica e confocale. Tali modelli possono essere utilizzati per studiare il ruolo dell'architettura cellulare sulla funzione delle cellule cardiache.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave su come il cambiamento nell'organizzazione interna della cellula e le condizioni di salute e malattia possono influenzare la biologia dei sistemi cellulari cardiaci. Il vantaggio principale di questo metodo è che consente di integrare informazioni complementari provenienti dalla microscopia elettronica e dalla microscopia confocale al fine di creare un modello spazialmente dettagliato dell'architettura cellulare. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla biologia del sistema cellulare cardiaco, ma questo approccio generale può essere utilizzato anche su altre cellule in cui è necessario comprendere l'effetto della struttura cellulare sulla funzione della cellula.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché i passaggi per simulare e mappare i canali ionici sulla mesh dell'elemento più fine sono così nuovi. Dopo aver preparato le sezioni di tessuto della parete libera del ventricolo sinistro e averle visualizzate utilizzando la tomografia elettronica secondo il protocollo di testo, eseguire il programma IMOD 3dmod. All'interno dell'interfaccia utente grafica, inserire l'indirizzo del file rec o mrc che contiene il set di dati dell'immagine ricostruita in 3D della cella nella casella di immissione denominata File immagine, quindi premere OK.

Quindi, nel menu File, seleziona Nuovo modello. Quindi, utilizzando la voce di menu Salva modello con nome, salvare il file con un nome appropriato. Nel menu Speciale, seleziona Strumenti di disegno, quindi scegli l'opzione Scolpisci e sposta il mouse sulla finestra dell'immagine.

Apparirà un contorno circolare centrato sul puntatore del mouse. Tenendo premuto il pulsante centrale del mouse su un mitocondrio, che è una regione più scura dei file di immagine, trascinare il perimetro del contorno del cerchio nella forma del suo contorno. Una volta completato il contorno del contorno del mitocondrio, rilasciare il pulsante centrale e ripetere questo processo per ogni mitocondrio nei dati.

Ogni contorno verrà automaticamente riconosciuto da IMOD come un nuovo contorno all'interno dello stesso oggetto. Nel menu Modifica oggetto, selezionare Nuovo per creare un nuovo oggetto. In questo modo il numero totale di oggetti verrà incrementato automaticamente di uno e verrà assegnato questo numero al nuovo oggetto.

Utilizzare l'opzione Scolpisci per segmentare e salvare i contorni delle miofibrille. Segmentare anche il contorno della cella, quindi nel menu File salvare il file del modello. Dopo aver scaricato iso2mesh secondo il protocollo di testo, scarica i codici sorgente e i dati per simulare i cluster RyR sulla mesh dal sito Web GitHub mostrato qui.

Avvia l'applicazione Cardiac Cell Mesh Generator MATLAB. Quindi, utilizzando i tre pulsanti in alto a sinistra della GUI, caricare le diverse maschere dei componenti dell'organello in MATLAB. Per creare un altro stack di immagini binarie che delimita gli spazi tra le miofibrille e i mitocondri, aprire l'immagine J, quindi, utilizzando la finestra di dialogo Apri file, caricare le pile TIFF di miofibrille e mitocondri nel programma.

Avviare il plug-in Aggiunta immagine selezionando Process Calculator Plus. Seleziona lo stack di immagini delle miofibrille come I1, lo stack di immagini dei mitocondri come I2 e scegli l'operatore Aggiungi, quindi fai clic su OK. Dopo che viene visualizzata una nuova pila di immagini che rappresenta il risultato, selezionate Modifica inversione per produrre una pila di immagini.

Caricare il file contenente lo stack di immagini binarie degli spazi tra le miofibrille e i mitocondri premendo il pulsante RyR Gaps file sul programma Cardiac Cell Mesh Generator, quindi premere Genera Mesh sulla GUI. Generare gli input necessari per il simulatore RyR premendo il pulsante Genera input del simulatore RyR sulla GUI. Dopo l'esecuzione della funzione, verificare che i seguenti file siano stati creati all'interno della directory specificata come percorso OUT_DIR, il d_axial_micron.

txt, che rappresenta la distanza assiale tra la posizione del disco Z e il resto dei pixel nella pila di immagini, il file d_radial_micron. txt, che rappresenta la distanza euclidea escludendo la componente assiale da ciascun pixel nell'insieme delle possibili posizioni del cluster RyR ai pixel sul piano del disco Z, il W_micro. txt, che rappresenta l'elenco delle coordinate spaziali di tutte le posizioni disponibili per la presenza dei cluster RyR.

I tre file rimanenti nella cartella contengono il suffisso pixel anziché micron per indicare che i valori all'interno di questi file sono stati scritti in formato di coordinate pixel. Per simulare le distribuzioni del cluster RyR sullo stack di immagini binarie delle miofibrille, premere il pulsante Apri simulatore RyR in R per avviare il programma R. Sulla GUI di R, selezionare Apri file e all'interno del pacchetto RyR-Simulator, trovare le impostazioni del file.

R.Fare riferimento al protocollo di testo per spiegazioni dettagliate dei parametri in questo campo e dei valori predefiniti. Gli utenti devono esaminare la distribuzione simulata dei cluster RyR nella finestra R e regolare le impostazioni per assicurarsi che i cluster si trovino vicino ai dischi Z e siano distribuiti uniformemente su tutta la sezione trasversale della cella. Per mappare i punti come densità spaziali su un modello computazionale utilizzando il Generatore di mesh di cellule cardiache, selezionare il pulsante Seleziona file di punti RyR e scegliere un file di testo di distribuzione cluster RyR simulato tra quelli emessi dal simulatore RyR.

Infine, sulla GUI di MATLAB, eseguire il RyR Density Mapper. Gli utenti devono controllare visivamente che i valori di densità siano distribuiti in modo tale che le vicinanze dei valori di alta densità siano simili alle dimensioni dei cluster RyR nei dati sperimentali. Queste immagini in campo chiaro rivelano come appaiono le cellule quando sono orientate longitudinalmente, obliquamente e in sezione trasversale rispetto al piano di taglio.

I campioni obliqui e longitudinali mostrano striature, mentre i campioni in sezione trasversale no. I capillari appaiono anche più circolari nelle viste in sezione trasversale che nelle viste oblique. Questo pannello rappresenta una pila di tomogrammi di buona qualità che può essere acquisita quando si segue la parte di preparazione del tessuto di questo protocollo.

La cura e l'esperienza sono necessarie per garantire che i blocchi di tessuto siano sufficientemente colorati e che vi sia una distribuzione uniforme delle particelle di oro colloidale attraverso il volume del tessuto. Qui è mostrato un modello 3D segmentato di miofibrille e mitocondri. Questo rendering 3D della mesh tetraedrica è prodotto da iso2mesh.

Finché la pila di immagini originale e le attività di segmentazione sono di buona qualità, questo passaggio è abbastanza robusto. Infine, questi pannelli mostrano tre esempi di cluster RyR simulati sulla stessa topologia mesh dopo aver utilizzato l'algoritmo di stima dell'intensità del kernel sferico. Si noti la variazione nell'organizzazione dei cluster RyR.

Una volta padroneggiato e se eseguito correttamente, un modello strutturalmente realistico agli elementi finiti di una cellula cardiaca, può essere generato in un paio d'ore utilizzando la nostra tecnica. A seguito di questa procedura, simulazioni agli elementi finiti della segnalazione del calcio, della bioenergetica cardiaca e della meccanica cellulare, può essere eseguita per rispondere a domande sul ruolo dell'architettura cellulare sul funzionamento dei cardiomiociti.