Creazione di un modello geometrico strutturalmente realistico agli elementi finiti di un Cardiomyocyte per studiare il ruolo dell'architettura cellulare in biologia dei sistemi del Cardiomyocyte
April 18th, 2018
Questo protocollo descrive un nuovo metodo per creare un modello ad elementi finiti spazialmente dettagliate dell'architettura intracellulare dei cardiomiociti da microscopia elettronica e immagini di microscopia confocale. Il potere di questo modello spazialmente dettagliato è dimostrato mediante studi di caso nella segnalazione di calcio e bioenergetica.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare un modello agli elementi finiti spazialmente dettagliato dell'architettura intracellulare di una cellula cardiaca. Questo modello è stato creato a partire da dati di microscopia elettronica e confocale. Tali modelli possono essere utilizzati per studiare il ruolo dell'architettura cellulare sulla funzione delle cellule cardiache.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave su come il cambiamento nell'organizzazione interna della cellula e le condizioni di salute e malattia possono influenzare la biologia dei sistemi cellulari cardiaci. Il vantaggio principale di questo metodo è che consente di integrare informazioni complementari provenienti dalla microscopia elettronica e dalla microscopia confocale al fine di creare un modello spazialmente dettagliato dell'architettura cellulare. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla biologia del sistema cellulare cardiaco, ma questo approccio generale può essere utilizzato anche su altre cellule in cui è necessario comprendere l'effetto della struttura cellulare sulla funzione della cellula.
La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché i passaggi per simulare e mappare i canali ionici sulla mesh dell'elemento più fine sono così nuovi. Dopo aver preparato le sezioni di tessuto della parete libera del ventricolo sinistro e averle visualizzate utilizzando la tomografia elettronica secondo il protocollo di testo, eseguire il programma IMOD 3dmod. All'interno dell'interfaccia utente grafica, inserire l'indirizzo del file rec o mrc che contiene il set di dati dell'immagine ricostruita in 3D della cella nella casella di immissione denominata File immagine, quindi premere OK.
Quindi, nel menu File, seleziona Nuovo modello. Quindi, utilizzando la voce di menu Salva modello con nome, salvare il file con un nome appropriato. Nel menu Speciale, seleziona Strumenti di disegno, quindi scegli l'opzione Scolpisci e sposta il mouse sulla finestra dell'immagine.
Apparirà un contorno circolare centrato sul puntatore del mouse. Tenendo premuto il pulsante centrale del mouse su un mitocondrio, che è una regione più scura dei file di immagine, trascinare il perimetro del contorno del cerchio nella forma del suo contorno. Una volta completato il contorno del contorno del mitocondrio, rilasciare il pulsante centrale e ripetere questo processo per ogni mitocondrio nei dati.
Ogni contorno verrà automaticamente riconosciuto da IMOD come un nuovo contorno all'interno dello stesso oggetto. Nel menu Modifica oggetto, selezionare Nuovo per creare un nuovo oggetto. In questo modo il numero totale di oggetti verrà incrementato automaticamente di uno e verrà assegnato questo numero al nuovo oggetto.
Utilizzare l'opzione Scolpisci per segmentare e salvare i contorni delle miofibrille. Segmentare anche il contorno della cella, quindi nel menu File salvare il file del modello. Dopo aver scaricato iso2mesh secondo il protocollo di testo, scarica i codici sorgente e i dati per simulare i cluster RyR sulla mesh dal sito Web GitHub mostrato qui.
Avvia l'applicazione Cardiac Cell Mesh Generator MATLAB. Quindi, utilizzando i tre pulsanti in alto a sinistra della GUI, caricare le diverse maschere dei componenti dell'organello in MATLAB. Per creare un altro stack di immagini binarie che delimita gli spazi tra le miofibrille e i mitocondri, aprire l'immagine J, quindi, utilizzando la finestra di dialogo Apri file, caricare le pile TIFF di miofibrille e mitocondri nel programma.
Avviare il plug-in Aggiunta immagine selezionando Process Calculator Plus. Seleziona lo stack di immagini delle miofibrille come I1, lo stack di immagini dei mitocondri come I2 e scegli l'operatore Aggiungi, quindi fai clic su OK. Dopo che viene visualizzata una nuova pila di immagini che rappresenta il risultato, selezionate Modifica inversione per produrre una pila di immagini.
Caricare il file contenente lo stack di immagini binarie degli spazi tra le miofibrille e i mitocondri premendo il pulsante RyR Gaps file sul programma Cardiac Cell Mesh Generator, quindi premere Genera Mesh sulla GUI. Generare gli input necessari per il simulatore RyR premendo il pulsante Genera input del simulatore RyR sulla GUI. Dopo l'esecuzione della funzione, verificare che i seguenti file siano stati creati all'interno della directory specificata come percorso OUT_DIR, il d_axial_micron.
txt, che rappresenta la distanza assiale tra la posizione del disco Z e il resto dei pixel nella pila di immagini, il file d_radial_micron. txt, che rappresenta la distanza euclidea escludendo la componente assiale da ciascun pixel nell'insieme delle possibili posizioni del cluster RyR ai pixel sul piano del disco Z, il W_micro. txt, che rappresenta l'elenco delle coordinate spaziali di tutte le posizioni disponibili per la presenza dei cluster RyR.
I tre file rimanenti nella cartella contengono il suffisso pixel anziché micron per indicare che i valori all'interno di questi file sono stati scritti in formato di coordinate pixel. Per simulare le distribuzioni del cluster RyR sullo stack di immagini binarie delle miofibrille, premere il pulsante Apri simulatore RyR in R per avviare il programma R. Sulla GUI di R, selezionare Apri file e all'interno del pacchetto RyR-Simulator, trovare le impostazioni del file.
R.Fare riferimento al protocollo di testo per spiegazioni dettagliate dei parametri in questo campo e dei valori predefiniti. Gli utenti devono esaminare la distribuzione simulata dei cluster RyR nella finestra R e regolare le impostazioni per assicurarsi che i cluster si trovino vicino ai dischi Z e siano distribuiti uniformemente su tutta la sezione trasversale della cella. Per mappare i punti come densità spaziali su un modello computazionale utilizzando il Generatore di mesh di cellule cardiache, selezionare il pulsante Seleziona file di punti RyR e scegliere un file di testo di distribuzione cluster RyR simulato tra quelli emessi dal simulatore RyR.
Infine, sulla GUI di MATLAB, eseguire il RyR Density Mapper. Gli utenti devono controllare visivamente che i valori di densità siano distribuiti in modo tale che le vicinanze dei valori di alta densità siano simili alle dimensioni dei cluster RyR nei dati sperimentali. Queste immagini in campo chiaro rivelano come appaiono le cellule quando sono orientate longitudinalmente, obliquamente e in sezione trasversale rispetto al piano di taglio.
I campioni obliqui e longitudinali mostrano striature, mentre i campioni in sezione trasversale no. I capillari appaiono anche più circolari nelle viste in sezione trasversale che nelle viste oblique. Questo pannello rappresenta una pila di tomogrammi di buona qualità che può essere acquisita quando si segue la parte di preparazione del tessuto di questo protocollo.
La cura e l'esperienza sono necessarie per garantire che i blocchi di tessuto siano sufficientemente colorati e che vi sia una distribuzione uniforme delle particelle di oro colloidale attraverso il volume del tessuto. Qui è mostrato un modello 3D segmentato di miofibrille e mitocondri. Questo rendering 3D della mesh tetraedrica è prodotto da iso2mesh.
Finché la pila di immagini originale e le attività di segmentazione sono di buona qualità, questo passaggio è abbastanza robusto. Infine, questi pannelli mostrano tre esempi di cluster RyR simulati sulla stessa topologia mesh dopo aver utilizzato l'algoritmo di stima dell'intensità del kernel sferico. Si noti la variazione nell'organizzazione dei cluster RyR.
Una volta padroneggiato e se eseguito correttamente, un modello strutturalmente realistico agli elementi finiti di una cellula cardiaca, può essere generato in un paio d'ore utilizzando la nostra tecnica. A seguito di questa procedura, simulazioni agli elementi finiti della segnalazione del calcio, della bioenergetica cardiaca e della meccanica cellulare, può essere eseguita per rispondere a domande sul ruolo dell'architettura cellulare sul funzionamento dei cardiomiociti.
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Panoramica
Questo protocollo delinea un metodo per creare un modello a elementi finiti dettagliato spazialmente dell'architettura intracellulare dei cardiomiociti utilizzando immagini di microscopia elettronica e confocale. Questo modello aiuta a comprendere l'impatto dell'architettura cellulare sulla funzione delle cellule cardiache.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Biologia cardiovascolare
- Architettura cellulare
- Tecniche di microscopia
Sfondo
- I cardiomiociti svolgono un ruolo cruciale nella funzione cardiaca.
- Comprendere l'architettura cellulare è essenziale per studiare la salute e le malattie cardiache.
- La microscopia elettronica e confocale forniscono dati complementari per la modellazione.
- Modelli dettagliati spazialmente possono rivelare informazioni sulla segnalazione del calcio e sulla bioenergetica.
Obiettivo dello studio
- Creare un modello a elementi finiti dell'architettura dei cardiomiociti.
- Indagare su come i cambiamenti nell'organizzazione cellulare influenzino la funzione cardiaca.
- Fornire un quadro per studiare altri tipi di cellule riguardo alle relazioni struttura-funzione.
Metodi utilizzati
- Integrazione dei dati della microscopia elettronica.
- Utilizzo di immagini di microscopia confocale.
- Tecniche di modellazione a elementi finiti.
- Studi di casi sulla segnalazione del calcio e sulla bioenergetica.
Principali risultati
- Creazione con successo di un modello dettagliato dell'architettura dei cardiomiociti.
- Informazioni sul ruolo della struttura cellulare nella funzione cardiaca.
- Applicazione dimostrata nello studio della segnalazione del calcio.
- Potenziale per un'applicazione più ampia in altri tipi di cellule.
Conclusioni
- Il metodo fornisce un approccio innovativo allo studio della biologia delle cellule cardiache.
- L'integrazione dei dati di microscopia migliora l'accuratezza del modello.
- I risultati potrebbero influenzare le ricerche future sulla salute e sulle malattie cardiache.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma researchers to develop spatially resolved finite element models of cardiomyocyte architecture, providing a computational platform to interrogate structure-function relationships in cardiac cells. By integrating high-resolution electron and confocal microscopy data, the method supports mechanistic de-risking in target validation and assay development for cardiovascular therapeutics. The resulting models facilitate predictive simulations of calcium signaling and mitochondrial bioenergetics, enhancing confidence in early discovery decisions and reducing reliance on empirical screening alone.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of how subcellular architecture influences calcium handling and contractile function, supporting target hypothesis testing in cardiomyocyte systems biology.
- Operational Value: Provides a reusable computational framework to evaluate the impact of genetic or pharmacological perturbations on cellular architecture without requiring new wet-lab experiments for each condition.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, spatially resolved outputs such as organelle distribution and RyR cluster localization, enabling standardized comparison across experimental conditions.
- Operational Value: Supports assay standardization by defining structural baselines against which compound-induced remodeling can be measured and quantified.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery-scale imaging with preclinical functional assessment by modeling calcium signaling dynamics linked to cellular ultrastructure.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by simulating how structural remodeling in disease models affects electrophysiological and metabolic outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through structural phenotyping and informing lead identification by providing architecture-informed functional readouts for compound screening campaigns.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven exploration of how changes in mitochondrial positioning, myofibril alignment, or calcium release site distribution affect cardiomyocyte function.
- Screening: Enables generation of quantitative structural metrics (e.g., organelle volume fraction, nearest-neighbor distances) that can serve as imaging-based biomarkers in high-content screening.
- Analytics: Produces spatial density maps and geometric descriptors that allow computational comparison of architectural states across genetic, environmental, or drug-treated conditions.
- Translational Research: Supports continuity to preclinical studies by linking observed structural changes to simulated functional deficits in calcium handling and energy transfer.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, modality-agnostic pipeline for integrating multi-resolution imaging data into mechanistic models applicable across cell types and disease contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in structure-function relationships within cardiomyocytes.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of architectural quantification across laboratories and imaging platforms.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling in silico prioritization of targets before committing to costly in vivo validation.
- Portfolio Impact: Supports de-risked advancement decisions by providing mechanistic rationale for selecting compounds that normalize pathological architectural phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electron and confocal microscopy image processing, segmentation, and finite element modeling.
- Depends on access to high-resolution 3D imaging data and computational tools such as IMOD, iso2mesh, MATLAB, and R-based simulators.
- Necessitates cross-team standardization of segmentation protocols and file naming conventions to ensure model comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the workflow to different cell types or disease models with varying ultrastructural complexity.
- Practical limitations include current exclusion of transverse-tubule and sarcoplasmic reticulum details, which may affect completeness of calcium signaling simulations.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:19
Segment Myofibrils and Mitochondria Regions from the EM 3D Image Dataset
3:05
Create a Finite Element Mesh from the Segmented Components
4:36
Mathematically Map the Spatially Varying Density of Ion-channels of Interest onto the Finite Element Mesh
6:51
Results: A Structurally Realistic Finite Element Geometric Model of a Cardiomyocyte
8:13
Conclusion
