Name: Genome-wide quantificazione della traduzione nel lievito gemmante mediante profilatura, ribosoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: Scopri la quantificazione genome-wide della traduzione nel lievito Saccharomyces cerevisiae mediante ribosome profiling. Questo metodo ad alta sensibilità permette di analizzare le regioni mRNA tradotte e regolazione traduzionale.

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Questo lavoro è stato sostenuto dagli istituti nazionali di sovvenzioni di salute AG040191 e AG054566 di VML. Questa ricerca è stata condotta mentre VML era un destinatario AFAR Research Grant della Federazione americana per la ricerca di invecchiamento.

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+translation+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA translation during mitosis.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
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<li>Brar, G. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling+reveals+the+what%2C+when%2C+where+and+how+of+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).</li>
<li>Wolin, S. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+pausing+and+stacking+during+translation+of+a+eukaryotic+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA.</a> EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).</li>
<li>Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
<li>Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+non-standardized+biases+of+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling.</a> Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).</li>
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<li>Baranov, P. V., Michel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+translation+with+ribosome+profiling+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Illuminating translation with ribosome profiling spectra.</a> Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).</li>
<li>Calviello, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+actively+translated+open+reading+frames+in+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data.</a> Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).</li>
<li>Michel, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboGalaxy%3A+A+browser+based+platform+for+the+alignment%2C+analysis+and+visualization+of+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data.</a> RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10 (3), R25(2009).</li>
<li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTSeq--a+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dom34-Hbs1+mediated+dissociation+of+inactive+80S+ribosomes+promotes+restart+of+translation+after+stress%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress.</a> EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).</li>
<li>Guydosh, N. R., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dom34+rescues+ribosomes+in+3%27+untranslated+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions.</a> Cell. 156 (5), 950-962 (2014).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling%3A+new+views+of+translation%2C+from+single+codons+to+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+ribosome+profiling+reveals+complex+translational+regulation+in+response+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).</li>
<li>Weinberg, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+ribosome-footprint+and+mRNA+measurements+provide+insights+into+dynamics+and+regulation+of+yeast+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation.</a> Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).</li>
<li>Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+poly%28A%29+tail+and+translation+during+the+somatic+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle.</a> Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).</li>
<li>Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+redefinition+of+UGA+codons+is+regulated+by+selenium+availability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability.</a> J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonuclease+selection+for+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ribonuclease selection for ribosome profiling.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), e6(2017).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+inhibitors+cause+abnormalities+in+ribosome+profiling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments.</a> Nucleic Acids Res. 42 (17), e134(2014).</li>
<li>O'Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+survey+of+the+relative+impact+of+mRNA+features+on+local+ribosome+profiling+read+density%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density.</a> Nat Commun. 7, 12915(2016).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

L'approccio di Ribo-Seq è emerso come una potente tecnologia per l'analisi del mRNA traduzione in vivo presso il genoma di livello 3. Gli studi che utilizzano questo approccio, che permette di monitorare la traduzione con risoluzione di singolo-codone, ha contribuito alla nostra comprensione della regolazione traduzionale. Nonostante i suoi vantaggi, Ribo-Seq presenta diverse limitazioni. Frammenti di RNA ribosomiale (rRNA) sono sempre co-purificate durante l'isolamento delle orme protett...

traduzione del mRNA è uno dei processi fondamentali nella cellula, che svolge un ruolo importante nella regolazione dell'espressione della proteina. Di conseguenza, la traduzione degli mRNA è strettamente controllato in risposta a diversi stimoli fisiologici interni ed esterni 1,2. Tuttavia, i meccanismi di regolazione traduzionale rimangono Zito. Qui, descriviamo il protocollo per la quantificazione del genoma della traduzione nel lievito gemmante dal ribosoma profilatura. L'obiettivo generale della tecnica di profilatura del ribosoma è studiare e quantificare la traduzione di specifici mRNA sotto diverse condizioni cellulari. Questa tecnica utilizza sequenziamento di nuova generazione per analizzare quantitativamente l'occupazione del ribosoma in tutto il genoma e permette di monitorare il tasso di proteine sintesi in vivo al singolo codone risoluzione 3,4. Attualmente, questo metodo fornisce i mezzi più avanzati di misurare i livelli di traduzione di proteine e ha dimostrato di essere uno strumento di scoperta utile fornire informazioni che non possono essere rivelati da altre tecniche attualmente disponibili, ad esempio microarrays o Traduzione stato matrice analisi (TSAA) 5. Come ribosoma profilatura report sui cambiamenti combinati nei livelli della trascrizione e uscita traslazionale, fornisce anche sensibilità molto maggiore rispetto ad altri metodi.
Questo approccio si basa sul sequenziamento profondo del ribosoma-protetto mRNA frammenti 3. Durante la traduzione di proteine, i ribosomi proteggono ~ 28 porzioni di nt del mRNA (chiamato tracce) 6. Determinando la sequenza dei frammenti ribosoma-protetto, Ribo-Seq può mappa la posizione dei ribosomi su mRNA tradotta e identificare quali regioni del mRNA sono probabili essere attivamente tradotto in proteina 3,7. Inoltre, possiamo misurare quantitativamente la traduzione di mRNA contando il numero di impronte che si allineano a una determinata trascrizione di mRNA.
Al fine di isolare i frammenti ribosoma-protetto, lisati cellulari sono inizialmente trattati con un inibitore di traduzione di stallo i ribosomi seguiti da digestione di ribonucleasi. Considerando che libero mRNA e porzioni dei mRNAs tradotta non protetti dai ribosomi sono degradate da ribonucleasi, i frammenti di mRNA ribosoma-protetti possono essere recuperati da purificare complessi intatti ribosoma-impronta. Queste impronte di mRNA sono quindi convertite in cDNA biblioteca e analizzate mediante sequenziamento profondo (Figura 1). In parallelo alla profilatura del ribosoma, mRNA intatto viene estratta dallo stesso campione e sequenziato. Confrontando il livello di traduzione identificato da Ribo-Seq con misure di abbondanza del mRNA, possiamo identificare i geni che sono specificamente up - o down-regolato a livello della traduzione e calcolare l'efficienza della traduzione del mRNA a livello del genoma. Mentre il protocollo descritto in questo articolo è specifico per il lievito, dovrebbe essere anche utile per i ricercatori che cercano di stabilire il protocollo di Ribo-Seq in altri sistemi.

<table><tbody><tr><td>0,45 &mu; Filtri a membrana M</td><td>Millipore</td><td>HVLP04700</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>Filtri centrifughi 0,5 mL (100 kDa MWCO)</td><td>Millipore</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7,0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9850G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7,5 (pH 8,0 a 4 gradi; C)</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>10X tampone TBE</td><td>Invitrogen</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>10% TBE-urea gel</td><td>Invitrogen</td><td>EC6875BOX</td><td></td></tr><tr><td>15% TBE-urea</td><td>gel Invitrogen</td><td>EC6885BOX</td><td></td></tr><tr><td>2 M MgCl2</td><td>RPI</td><td>M24500-10.0</td><td></td></tr><tr><td>2X TBE-urea tampone</td><td>campione Invitrogen</td><td>LC6876</td><td></td></tr><tr><td>3M NaOAc, pH 5,5</td><td>Invitrogen</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>5' Deadenilasi (10 U/&mu; L)</td><td>Epicentro</td><td>DA11101K</td><td></td></tr><tr><td>5X Tampone di caricamento del campione di acido nucleico</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0767</td><td></td></tr><tr><td>8% TBE</td><td>gel Invitrogen</td><td>EC6215BOX</td><td></td></tr><tr><td>Acido-Fenolo:Cloroformio, pH 4,5 (con IAA, 125:24:1)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>Transilluminatore a luce blu</td><td>Clare Chemical Research</td><td>DR-46B</td><td></td></tr><tr><td>Perline in acciaio cromato, 3,2 mm</td><td>BioSpec Products</td><td>11079132c</td><td></td></tr><tr><td>Cryogrinder</td><td>Biospec prodotto</td><td>3110BX</td><td></td></tr><tr><td>Cicloesimide</td><td>RPI</td><td>C81040-5.0</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di acquisizione dati</td><td>DATAQ Instruments</td><td>DI-245</td><td></td></tr><tr><td>Miscela di soluzioni di deossinucleotide (dNTP) (10 mM)</td><td>NEB</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Invitrogen</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di frazionamento a gradiente</td><td>Brandel</td><td>BR-184X</td><td></td></tr><tr><td>DNA polimerasi ad alta fedeltà (2.000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td>Fornito con tampone Phusion HF 5X</td></tr><tr><td>Kit di quantificazione della libreria di sequenziamento di nuova generazione</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td></td></tr><tr><td>Colorante su gel di acido nucleico</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuga Optima XE-90</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>Kit di isolamento dell'mRNA Poly(A)</td><td>Invitrogen</td><td>61011</td><td></td></tr><tr><td>Rec J esonucleasi (10 U/&mu; L)</td><td>Epicentro</td><td>RJ411250</td><td></td></tr><tr><td>Trascrittasi inversa (200 U/&mu; L)</td><td>Invitrogen</td><td>18080093</td><td>Fornito con tampone 5X per il primo filamento e tampone</td></tr> di <tr><td>frammentazione dell'RNA</td> DTT 0,1 M <td>NEB</td><td>E6186A</td><td></td></tr><tr><td>RNasi I (100 U/&mu; L)</td><td>Invitrogen</td><td>AM2295</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della RNasi (20 U/&mu; L)</td><td>Invitrogen</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>Tappi in gomma siliconica BioSpec</td><td>Products</td><td>2008</td><td></td></tr><tr><td>ssDNA ligasi (100 U/&mu; L)</td><td>Epicentro</td><td>CL9021K</td><td>Fornito con 10 tamponi CircLigase II e 50 mM di MnCl2</td></tr><tr><td>Stainless steel microfiales, 1,8 mL</td><td>BioSpec Products</td><td>2007</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>RPI</td><td>S24060-5000.0</td><td></td></tr><tr><td>SW-41 Ti rotore</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a siringa</td> New <td>Era Pump</td><td>Systems NE-300</td><td></td></tr><tr><td>Polinucleotide chinasi T4 (10.000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td>Fornito con 10X tampone polinucleotidico chinasico</td></tr><tr><td>T4 RNA ligasi T4 troncato KQ (200.000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0373S</td><td>Fornito con 10X tampone RNA ligasi T4 e 50% PEG8000</td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td>Bio-Rad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>Provette in poliallomero a parete sottile, 13,2 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Monitor UV Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>7318160</td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae ceppo BY4741</td><td>Open Biosystems</td><td>YSC1048</td><td></td></tr></tbody></table>

genome-wide quantificazione della traduzione nel lievito gemmante mediante profilatura, ribosoma

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Traduzione di mRNA in proteine è un processo complesso che coinvolge diversi strati di regolamento. Spesso si presume che cambiamenti nella trascrizione del mRNA riflettono cambiamenti nella sintesi proteica, ma sono state osservate molte eccezioni. Recentemente, una tecnica chiamata ribosoma profilatura (o Ribo-Seq) è emerso come un potente metodo che permette l'identificazione, con alta precisione, quali regioni di mRNA vengono tradotti in proteine e quantificazione della traduzione a livello di genoma. Qui, presentiamo un protocollo generalizzato per la quantificazione del genoma di traduzione utilizzando Ribo-Seq in lievito. Inoltre, combinando Ribo-Seq dati con misure di abbondanza del mRNA permette di quantificare contemporaneamente l'efficienza della traduzione di migliaia di trascrizioni del mRNA nello stesso campione e confrontare le modifiche a questi parametri in risposta a sperimentale manipolazioni o in diversi stati fisiologici. Descriviamo un protocollo dettagliato per la generazione delle orme di ribosoma tramite digestione nucleasi, isolamento dei complessi intatti ribosoma-impronta tramite frazionamento gradiente di saccarosio e la preparazione delle librerie di DNA per sequenziamento profondo insieme appropriato controlli di qualità necessari per garantire l'accurata analisi della traduzione in vivo .

Sono state dettagliate condotte per analisi bioinformatica del ribosoma profiling dei dati descritto in precedenza 8,9. Inoltre, diversi gruppi di ricerca hanno sviluppato strumenti bioinformatici per l'analisi dell'espressione genica differenziale e trattamento dei dati di sequenziamento, che sono specifici per ribosoma profilatura metodo 10,11,<sup class="xref...

Regolazione traduzionale svolge un ruolo importante nel controllo dell'abbondanza di proteine. Qui, descriviamo un metodo di alto-rendimento per analisi quantitativa di traduzione nel lievito Saccharomyces cerevisiae.

Genome-wide quantificazione della traduzione nel lievito gemmante mediante profilatura, ribosoma

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare quali regioni dell'mRNA sono tradotte in proteine, misurare quantitativamente la traduzione proteica nel lievito in gemmazione saccharomyces cerevisiae a livello di genoma. Il profilo ribosomiale può essere utilizzato per monitorare il tasso di proteine e malattia e per studiare i meccanismi di regolazione traduzionale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che aggiunge una sensibilità molto maggiore rispetto ad altri metodi, e di quelli che misurano le proteine e la malattia in vivo alla risoluzione a contatto singolo.Sebbene questo protocollo sia specifico per il lievito in gemmazione, è utile anche per i ricercatori che stanno cercando di stabilire la profilazione dei ribosomi in altri sistemi modello, come le cellule e i tessuti dei mammiferi. Gli estratti saranno preparati da cellule di lievito cresciute fino alla fase logaritmica media. Utilizzare un gruppo filtro portavetro per filtrare la coltura attraverso filtri a micromembrana da 0,45.Raschiare il pellet con la spatola, congelare in azoto liquido e conservare a meno 80 gradi Celsius. Metti tre perline di acciaio cromato da 3,2 millimetri in un tubo di acciaio inossidabile da 1,8 millilitri e pre-raffredda il tubo in azoto liquido. Aggiungere il pellet congelato e coprire il tubo d'acciaio con un tappo di gomma siliconica.Omogeneizzare il campione mediante criomacinazione per 10 secondi a 4200 giri/min. Per mantenere i campioni congelati durante l'intera procedura di macinazione, è fondamentale raffreddare la provetta in azoto liquido per almeno 10 secondi tra una macinazione e l'altra. Al termine dell'omogeneizzazione, aggiungere al campione un millilitro di tampone di lisi che contiene cicloesimide.Mescolare bene pipettando e trasferire il campione in una nuova provetta da 1,5 millilitri. Centrifugare a 20.000 volte g a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 millilitri.Trasferire 100 microlitri di lisato in un'altra nuova provetta da 1,5 millilitri per l'isolamento del poli(A)mRNA. Congelare le provette con i campioni di mRNA sul resto del lisato, che verrà utilizzato per l'estrazione dell'impronta in azoto liquido, e conservarle a meno 80 gradi Celsius. La notte prima dell'estrazione dell'impronta, scongelare i gradienti di saccarosio precedentemente preparati a quattro gradi Celsius.Il giorno seguente, scongelare il lisato cellulare su ghiaccio. Trasferire un'aliquota di lisato cellulare contenente 50 unità OD260 in una nuova provetta da 1,5 millilitri, aggiungere un tampone di lisi fresco fino a un millilitro e 10 microlitri di RNasi. Incubare a temperatura ambiente con una leggera rotazione su un rotatore a testa in giù per un'ora.Quindi, sovrapporre delicatamente il campione di lisato sopra un gradiente di saccarosio dal 10% al 50% in provette polimeriche. Utilizzando un rotore SW41 ti, centrifugare a 35.000 giri/min a quattro gradi Celsius per tre ore. Durante l'ultra cetrifugazione, impostare il sistema di frazionamento a gradiente.Accendere i componenti e lasciare che il monitor UV si riscaldi per almeno 30 minuti. Riempi la siringa con la soluzione chase e rimuovi eventuali bolle d'aria all'interno della siringa e della canula. Al termine dell'ultracentrifugazione, installare e forare la provetta dell'ultracentrifuga contenente il gradiente di saccarosio.Avviare la pompa a siringa a un millilitro al minuto e raccogliere frazioni di un millilitro monitorando i valori A254. Le frazioni che rappresentano il picco del monosoma ADS vengono raccolte e raggruppate. Filtrare le frazioni attraverso filtri centrifughi da 0,5 millilitri a 12.000 volte g a quattro gradi Celsius per 10 minuti, scartare il flusso e ripetere fino a quando il volume è inferiore a 100 microlitri.A 400 microlitri di tampone di rilascio miscelato mediante pipettaggio e incubazione su ghiaccio per 10 minuti, trasferire l'unità in una nuova provetta di raccolta e centrifugare a 12.000 volte g a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Raccogli il flusso. Successivamente, purificare i frammenti di impronta e precipitare i campioni utilizzando la precipitazione dell'etanolo come descritto nel protocollo di testo.Per iniziare questa procedura, centrifugare l'impronta precipitata e i campioni di mRNA frammentati a 20.000 volte g e quattro gradi Celsius per 30 minuti. Dopo aver rimosso l'etanolo e asciugato all'aria il pellet, sospendiamo ogni pellet in 7,75 microlitri di acqua. A ogni pellet, aggiungere un microlitro di tampone polinucleotide chinasi 10XT4, un microlitro di polinucleotide chinasi T4 e 0,25 microlitri di inibitore della RNasi.Incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Aggiungere 10 microlitri di tampone per campioni di urea 2X TBE a 10 microlitri di ogni impronta e campione di mRNA. Incubare i campioni e gli opportuni controlli a 75 gradi Celsius per tre minuti, centrifugare e mettere in ghiaccio per un minuto.Caricare ogni campione in due pozzetti di un gel di urea al 15% di TBE e separare i frammenti di RNA mediante elettroforesi su gel a 180 volt per un'ora. Colorare il gel con una macchia di gel di acido nucleico, al riparo dalla luce per cinque minuti. Durante la visualizzazione del gel sotto un transilluminatore a luce blu, asportare la banda corretta tra 28 e 32 nucleotidi per i campioni di impronte e tra 50 e 70 nucleotidi per i campioni di mRNA.Congelare i pezzi di gel di poliacrilammide asportati a meno 80 gradi Celsius per almeno 10 minuti prima di estrarre l'RNA dal gel di poliacrilammide. Prima della trascrizione inversa, eseguire la legatura con tre adattatori primi e precipitare i campioni come descritto nel protocollo di testo. Risospendere ogni pellet in 11,5 microlitri di acqua priva di nucleasi.Quindi aggiungere 0,5 microlitri di primer per trascrizione inversa a otto micromolari e un microlitro di miscela dNTP. Incubare a 65 gradi Celsius per cinque minuti e poi mettere sul ghiaccio. A ciascun campione, aggiungere quattro microlitri di tampone 5x primo filamento, due microlitri di DTT molare 0,1, 0,5 microlitri di inibitore della RNasi e 0,5 microlitri di trascrittasi inversa.Incubare a 48 gradi Celsius per 30 minuti, 65 gradi Celsius per un minuto e 80 gradi Celsius per cinque minuti. Procedere immediatamente all'idrolisi dell'RNA aggiungendo 0,8 microlitri di idrossido di sodio a due molari a ciascun campione e incubando a 98 gradi Celsius per 30 minuti. Aggiungere 0,8 microlitri di acido cloridrico a due molari per neutralizzare la reazione.Dopo aver precipitato i campioni come descritto nel protocollo di testo, risospendere ogni pellet in cinque microlitri di acqua priva di nucleasi e aggiungere cinque microlitri di tampone per campioni di urea 2x TBE. Incubare a 75 gradi Celsius per tre minuti, centrifugare e mettere in ghiaccio per un minuto. Caricare il campione in un pozzetto di un gel di urea al 10% di TBE.Separare i prodotti della reazione di trascrizione inversa mediante elettroforesi su gel a 180 volt per 50 minuti. Colorare il gel con una macchia di gel di acido nucleico protetta dalla luce per cinque minuti. Utilizzando un transilluminatore a luce blu, asportare la banda intorno a 128 nucleotidi e oltre.Congelare i pezzi di gel di poliacrilammide a meno 80 gradi Celsius per almeno 10 minuti prima di estrarre il DNA dal gel di poliacrilammide. Per circolarizzare il DNA, risospendere ogni pellet di DNA in 16,75 microlitri di acqua priva di nucleasi. Aggiungere due microlitri di tampone DNA ligasi a filamento singolo 10x, un microlitro di cloruro di manganese da 50 millimolari e 0,25 microlitri di DNA ligasi a filamento singolo.Incubare a 60 gradi Celsius per un'ora, seguito da 80 gradi Celsius per 10 minuti. Senza precipitare, conservare il prodotto della reazione di legatura del DNA a filamento singolo a meno 20 gradi Celsius. Successivamente, eseguire l'amplificazione della libreria PCR seguita dalla quantificazione della libreria e dal sequenziamento ad alto rendimento come descritto nel protocollo di testo.Vengono mostrati i profili rappresentativi dell'analizzatore biologico della libreria di impronte amplificate PCR e della libreria di sequenziamento ottenuta per i campioni di mRNA. La dimensione media prevista della libreria di impronte è compresa tra 148 e 152 nucleotidi e la dimensione prevista della libreria di mRNA è compresa tra 170 e 190 nucleotidi. Questo grafico mostra il numero combinato di letture di mRNA, impronte e rRNA ottenute per due repliche biologiche indipendenti di un campione wild type e del mutante di delezione hbs1.Dal 50% al 60% di tutte le letture sequenziate nelle librerie di impronte corrispondeva a frammenti di impronte protetti da ribosoma. Al contrario, solo il 3% dei frammenti di rRNA è stato osservato nelle librerie di mRNA, dimostrando che l'isolamento del poli(A)mRNA consente un'efficace eliminazione delle letture di rRNA. Sia le librerie di campioni di impronte che quelle di mRNA mostrano una buona riproducibilità, come indicato da un coefficiente di correlazione di Pearson di circa 0,99 tra i campioni abbinati.Se combinato con le misurazioni dell'abbondanza dell'mRNA, il profilo dei ribosomi consente di misurare i cambiamenti nell'efficienza di traduzione tra le condizioni sperimentali. I geni significativamente sovra-regolati e sotto-regolati nel mutante di delezione hbs1 sono raggruppati a seconda che siano influenzati da un cambiamento nella trascrizione dell'mRNA, dall'efficienza della traduzione o da un effetto comune. Una volta padroneggiato, l'intero protocollo può essere eseguito in circa 11 giorni.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di indossare i guanti ed eseguire tutti i passaggi utilizzando reagenti e materiali di consumo privi di RNasi per evitare la contaminazione da RNasi e ridurre il rischio di degradazione dell'RNA nei campioni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare impronte di ribosomi utilizzando la digestione della nucleasi, isolare complessi di impronte di ribosomi intatti mediante frazionamento del gradiente di saccarosio e preparare librerie di DNA per il sequenziamento profondo. Non dimenticare che lavorare con l'azoto liquido può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come indossare occhiali di sicurezza e crio-guanti dovrebbero essere sempre prese quando si maneggiano materiali estremamente freddi.

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La capacità delle cellule di adattarsi allo stress è fondamentale per la loro sopravvivenza. La regolazione della traduzione dell'mRNA è una di queste strategie di adattamento, che prevede una rapida regolazione del proteoma. Qui, forniamo un protocollo standardizzato di profilazione dei polisomi per identificare mRNA specifici che vengono tradotti selettivamente in condizioni di stress.

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Presentiamo una tecnica per stabilizzare rapidamente complessi traslazionali (biosintesi proteica) con reticolazione di formaldeide in cellule di lievito vivo e di mammifero. L'approccio consente di sezionare intermedi transitori e interazioni dinamiche RNA:proteina. I complessi reticolati possono essere utilizzati in molteplici applicazioni a valle come nei metodi di profilazione basati sul sequenziamento profondo, nella microscopia e nella spettrometria di massa.

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