Name: Genome-wide quantificazione della traduzione nel lievito gemmante mediante profilatura, ribosoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: Scopri la quantificazione genome-wide della traduzione nel lievito Saccharomyces cerevisiae mediante ribosome profiling. Questo metodo ad alta sensibilità permette di analizzare le regioni mRNA tradotte e regolazione traduzionale.

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Questo lavoro è stato sostenuto dagli istituti nazionali di sovvenzioni di salute AG040191 e AG054566 di VML. Questa ricerca è stata condotta mentre VML era un destinatario AFAR Research Grant della Federazione americana per la ricerca di invecchiamento.

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<li>Michel, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboGalaxy%3A+A+browser+based+platform+for+the+alignment%2C+analysis+and+visualization+of+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data.</a> RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10 (3), R25(2009).</li>
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<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
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<li>Guydosh, N. R., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dom34+rescues+ribosomes+in+3%27+untranslated+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions.</a> Cell. 156 (5), 950-962 (2014).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling%3A+new+views+of+translation%2C+from+single+codons+to+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+ribosome+profiling+reveals+complex+translational+regulation+in+response+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).</li>
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<li>Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+redefinition+of+UGA+codons+is+regulated+by+selenium+availability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability.</a> J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonuclease+selection+for+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ribonuclease selection for ribosome profiling.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), e6(2017).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+inhibitors+cause+abnormalities+in+ribosome+profiling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments.</a> Nucleic Acids Res. 42 (17), e134(2014).</li>
<li>O'Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+survey+of+the+relative+impact+of+mRNA+features+on+local+ribosome+profiling+read+density%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density.</a> Nat Commun. 7, 12915(2016).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

L'approccio di Ribo-Seq è emerso come una potente tecnologia per l'analisi del mRNA traduzione in vivo presso il genoma di livello 3. Gli studi che utilizzano questo approccio, che permette di monitorare la traduzione con risoluzione di singolo-codone, ha contribuito alla nostra comprensione della regolazione traduzionale. Nonostante i suoi vantaggi, Ribo-Seq presenta diverse limitazioni. Frammenti di RNA ribosomiale (rRNA) sono sempre co-purificate durante l'isolamento delle orme protett...

traduzione del mRNA è uno dei processi fondamentali nella cellula, che svolge un ruolo importante nella regolazione dell'espressione della proteina. Di conseguenza, la traduzione degli mRNA è strettamente controllato in risposta a diversi stimoli fisiologici interni ed esterni 1,2. Tuttavia, i meccanismi di regolazione traduzionale rimangono Zito. Qui, descriviamo il protocollo per la quantificazione del genoma della traduzione nel lievito gemmante dal ribosoma profilatura. L'obiettivo generale della tecnica di profilatura del ribosoma è studiare e quantificare la traduzione di specifici mRNA sotto diverse condizioni cellulari. Questa tecnica utilizza sequenziamento di nuova generazione per analizzare quantitativamente l'occupazione del ribosoma in tutto il genoma e permette di monitorare il tasso di proteine sintesi in vivo al singolo codone risoluzione 3,4. Attualmente, questo metodo fornisce i mezzi più avanzati di misurare i livelli di traduzione di proteine e ha dimostrato di essere uno strumento di scoperta utile fornire informazioni che non possono essere rivelati da altre tecniche attualmente disponibili, ad esempio microarrays o Traduzione stato matrice analisi (TSAA) 5. Come ribosoma profilatura report sui cambiamenti combinati nei livelli della trascrizione e uscita traslazionale, fornisce anche sensibilità molto maggiore rispetto ad altri metodi.
Questo approccio si basa sul sequenziamento profondo del ribosoma-protetto mRNA frammenti 3. Durante la traduzione di proteine, i ribosomi proteggono ~ 28 porzioni di nt del mRNA (chiamato tracce) 6. Determinando la sequenza dei frammenti ribosoma-protetto, Ribo-Seq può mappa la posizione dei ribosomi su mRNA tradotta e identificare quali regioni del mRNA sono probabili essere attivamente tradotto in proteina 3,7. Inoltre, possiamo misurare quantitativamente la traduzione di mRNA contando il numero di impronte che si allineano a una determinata trascrizione di mRNA.
Al fine di isolare i frammenti ribosoma-protetto, lisati cellulari sono inizialmente trattati con un inibitore di traduzione di stallo i ribosomi seguiti da digestione di ribonucleasi. Considerando che libero mRNA e porzioni dei mRNAs tradotta non protetti dai ribosomi sono degradate da ribonucleasi, i frammenti di mRNA ribosoma-protetti possono essere recuperati da purificare complessi intatti ribosoma-impronta. Queste impronte di mRNA sono quindi convertite in cDNA biblioteca e analizzate mediante sequenziamento profondo (Figura 1). In parallelo alla profilatura del ribosoma, mRNA intatto viene estratta dallo stesso campione e sequenziato. Confrontando il livello di traduzione identificato da Ribo-Seq con misure di abbondanza del mRNA, possiamo identificare i geni che sono specificamente up - o down-regolato a livello della traduzione e calcolare l'efficienza della traduzione del mRNA a livello del genoma. Mentre il protocollo descritto in questo articolo è specifico per il lievito, dovrebbe essere anche utile per i ricercatori che cercano di stabilire il protocollo di Ribo-Seq in altri sistemi.

<table><tbody><tr><td>0,45 &mu; Filtri a membrana M</td><td>Millipore</td><td>HVLP04700</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>Filtri centrifughi 0,5 mL (100 kDa MWCO)</td><td>Millipore</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7,0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9850G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7,5 (pH 8,0 a 4 gradi; C)</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>10X tampone TBE</td><td>Invitrogen</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>10% TBE-urea gel</td><td>Invitrogen</td><td>EC6875BOX</td><td></td></tr><tr><td>15% TBE-urea</td><td>gel Invitrogen</td><td>EC6885BOX</td><td></td></tr><tr><td>2 M MgCl2</td><td>RPI</td><td>M24500-10.0</td><td></td></tr><tr><td>2X TBE-urea tampone</td><td>campione Invitrogen</td><td>LC6876</td><td></td></tr><tr><td>3M NaOAc, pH 5,5</td><td>Invitrogen</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>5' Deadenilasi (10 U/&mu; L)</td><td>Epicentro</td><td>DA11101K</td><td></td></tr><tr><td>5X Tampone di caricamento del campione di acido nucleico</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0767</td><td></td></tr><tr><td>8% TBE</td><td>gel Invitrogen</td><td>EC6215BOX</td><td></td></tr><tr><td>Acido-Fenolo:Cloroformio, pH 4,5 (con IAA, 125:24:1)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>Transilluminatore a luce blu</td><td>Clare Chemical Research</td><td>DR-46B</td><td></td></tr><tr><td>Perline in acciaio cromato, 3,2 mm</td><td>BioSpec Products</td><td>11079132c</td><td></td></tr><tr><td>Cryogrinder</td><td>Biospec prodotto</td><td>3110BX</td><td></td></tr><tr><td>Cicloesimide</td><td>RPI</td><td>C81040-5.0</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di acquisizione dati</td><td>DATAQ Instruments</td><td>DI-245</td><td></td></tr><tr><td>Miscela di soluzioni di deossinucleotide (dNTP) (10 mM)</td><td>NEB</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Invitrogen</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di frazionamento a gradiente</td><td>Brandel</td><td>BR-184X</td><td></td></tr><tr><td>DNA polimerasi ad alta fedeltà (2.000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td>Fornito con tampone Phusion HF 5X</td></tr><tr><td>Kit di quantificazione della libreria di sequenziamento di nuova generazione</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td></td></tr><tr><td>Colorante su gel di acido nucleico</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuga Optima XE-90</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>Kit di isolamento dell'mRNA Poly(A)</td><td>Invitrogen</td><td>61011</td><td></td></tr><tr><td>Rec J esonucleasi (10 U/&mu; L)</td><td>Epicentro</td><td>RJ411250</td><td></td></tr><tr><td>Trascrittasi inversa (200 U/&mu; L)</td><td>Invitrogen</td><td>18080093</td><td>Fornito con tampone 5X per il primo filamento e tampone</td></tr> di <tr><td>frammentazione dell'RNA</td> DTT 0,1 M <td>NEB</td><td>E6186A</td><td></td></tr><tr><td>RNasi I (100 U/&mu; L)</td><td>Invitrogen</td><td>AM2295</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della RNasi (20 U/&mu; L)</td><td>Invitrogen</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>Tappi in gomma siliconica BioSpec</td><td>Products</td><td>2008</td><td></td></tr><tr><td>ssDNA ligasi (100 U/&mu; L)</td><td>Epicentro</td><td>CL9021K</td><td>Fornito con 10 tamponi CircLigase II e 50 mM di MnCl2</td></tr><tr><td>Stainless steel microfiales, 1,8 mL</td><td>BioSpec Products</td><td>2007</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>RPI</td><td>S24060-5000.0</td><td></td></tr><tr><td>SW-41 Ti rotore</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a siringa</td> New <td>Era Pump</td><td>Systems NE-300</td><td></td></tr><tr><td>Polinucleotide chinasi T4 (10.000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td>Fornito con 10X tampone polinucleotidico chinasico</td></tr><tr><td>T4 RNA ligasi T4 troncato KQ (200.000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0373S</td><td>Fornito con 10X tampone RNA ligasi T4 e 50% PEG8000</td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td>Bio-Rad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>Provette in poliallomero a parete sottile, 13,2 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Monitor UV Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>7318160</td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae ceppo BY4741</td><td>Open Biosystems</td><td>YSC1048</td><td></td></tr></tbody></table>

genome-wide quantificazione della traduzione nel lievito gemmante mediante profilatura, ribosoma

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Traduzione di mRNA in proteine è un processo complesso che coinvolge diversi strati di regolamento. Spesso si presume che cambiamenti nella trascrizione del mRNA riflettono cambiamenti nella sintesi proteica, ma sono state osservate molte eccezioni. Recentemente, una tecnica chiamata ribosoma profilatura (o Ribo-Seq) è emerso come un potente metodo che permette l'identificazione, con alta precisione, quali regioni di mRNA vengono tradotti in proteine e quantificazione della traduzione a livello di genoma. Qui, presentiamo un protocollo generalizzato per la quantificazione del genoma di traduzione utilizzando Ribo-Seq in lievito. Inoltre, combinando Ribo-Seq dati con misure di abbondanza del mRNA permette di quantificare contemporaneamente l'efficienza della traduzione di migliaia di trascrizioni del mRNA nello stesso campione e confrontare le modifiche a questi parametri in risposta a sperimentale manipolazioni o in diversi stati fisiologici. Descriviamo un protocollo dettagliato per la generazione delle orme di ribosoma tramite digestione nucleasi, isolamento dei complessi intatti ribosoma-impronta tramite frazionamento gradiente di saccarosio e la preparazione delle librerie di DNA per sequenziamento profondo insieme appropriato controlli di qualità necessari per garantire l'accurata analisi della traduzione in vivo .

Sono state dettagliate condotte per analisi bioinformatica del ribosoma profiling dei dati descritto in precedenza 8,9. Inoltre, diversi gruppi di ricerca hanno sviluppato strumenti bioinformatici per l'analisi dell'espressione genica differenziale e trattamento dei dati di sequenziamento, che sono specifici per ribosoma profilatura metodo 10,11,<sup class="xref...

Regolazione traduzionale svolge un ruolo importante nel controllo dell'abbondanza di proteine. Qui, descriviamo un metodo di alto-rendimento per analisi quantitativa di traduzione nel lievito Saccharomyces cerevisiae.

Genome-wide quantificazione della traduzione nel lievito gemmante mediante profilatura, ribosoma

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare quali regioni dell'mRNA sono tradotte in proteine, misurare quantitativamente la traduzione proteica nel lievito in gemmazione saccharomyces cerevisiae a livello di genoma. Il profilo ribosomiale può essere utilizzato per monitorare il tasso di proteine e malattia e per studiare i meccanismi di regolazione traduzionale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che aggiunge una sensibilità molto maggiore rispetto ad altri metodi, e di quelli che misurano le proteine e la malattia in vivo alla risoluzione a contatto singolo.Sebbene questo protocollo sia specifico per il lievito in gemmazione, è utile anche per i ricercatori che stanno cercando di stabilire la profilazione dei ribosomi in altri sistemi modello, come le cellule e i tessuti dei mammiferi. Gli estratti saranno preparati da cellule di lievito cresciute fino alla fase logaritmica media. Utilizzare un gruppo filtro portavetro per filtrare la coltura attraverso filtri a micromembrana da 0,45.Raschiare il pellet con la spatola, congelare in azoto liquido e conservare a meno 80 gradi Celsius. Metti tre perline di acciaio cromato da 3,2 millimetri in un tubo di acciaio

genome-wide-quantification-translation-budding-yeast-ribosome

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimica

Qui, descriviamo un metodo per analizzare le modifiche l'apertura di traduzione dell'mRNA di cellule eucariotiche in risposta alle condizioni di stress. Questo metodo si basa sulla separazione velocità su gradienti di saccarosio di traduzione ribosomi da ribosomi non traslanti.

Analisi della traduzione innesco durante condizioni di stress da polisoma Profiling

Ribosomi svolgono un ruolo centrale nella sintesi proteica. Polyribosome (polisoma) frazionamento da saccarosio centrifugazione in gradiente di densità permette la determinazione diretta delle efficienze traduzione di mRNA individuali su una scala genome-wide. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per l'analisi biochimica dei ribosomi e fattori polisoma associati come accompagnatori e molecole di segnalazione.

Polisoma Frazionamento e analisi dei mammiferi Translatomes su scala Genome-wide

La capacità delle cellule di adattarsi allo stress è fondamentale per la loro sopravvivenza. La regolazione della traduzione dell'mRNA è una di queste strategie di adattamento, che prevede una rapida regolazione del proteoma. Qui, forniamo un protocollo standardizzato di profilazione dei polisomi per identificare mRNA specifici che vengono tradotti selettivamente in condizioni di stress.

Valutazione della Selective mRNA Traduzione in cellule di mammifero per polisoma Profiling

Questo manoscritto descrive un metodo per visualizzare e quantificare gli eventi di conversione localizzata in compartimenti subcellulari. L'approccio proposto in questo manoscritto richiede un sistema di imaging confocale base e reagenti ed è rapido ed economico.

Quantitativa immunofluorescenza su misura globale localizzato traduzione

Il protocollo qui descritto si basa sulla quantificazione genoma di nuova sintesi mRNA purificato da cellule di lievito etichettate con 4-tiouracile. Questo metodo permette di misurare la sintesi di mRNA disinserita dalla degradazione del mRNA e, quindi, fornisce una misurazione accurata della trascrizione del RNA polimerasi II.

Saccharomyces cerevisiae Metabolica etichettatura con 4-tiouracile e la quantificazione di nuova sintesi mRNA come Proxy per attività di RNA polimerasi II

Qui descriviamo le fasi di raccolta e preparazione dei campioni per RIBO-seq nei batteri. Il sequenziamento delle biblioteche elaborate secondo queste linee guida si traduce in dati sufficienti per un'analisi bioinformatica completa. Il protocollo che presentiamo è semplice, utilizza attrezzature di laboratorio standard e richiede sette giorni dalla lisi all'ottenimento delle biblioteche.

RIBO-seq in Bacteria: un protocollo di raccolta dei campioni e preparazione della biblioteca per il sequenziamento NGS

Presentiamo una tecnica per stabilizzare rapidamente complessi traslazionali (biosintesi proteica) con reticolazione di formaldeide in cellule di lievito vivo e di mammifero. L'approccio consente di sezionare intermedi transitori e interazioni dinamiche RNA:proteina. I complessi reticolati possono essere utilizzati in molteplici applicazioni a valle come nei metodi di profilazione basati sul sequenziamento profondo, nella microscopia e nella spettrometria di massa.

Rapida fissazione in vivo e isolamento dei complessi traslazionali dalle cellule eucariotiche

Questo protocollo descrive come generare un profilo polisomico senza utilizzare generatori di gradienti automatizzati o sistemi di frazionamento del gradiente.

Profilazione dei polisomi senza generatori di gradienti o sistemi di frazionamento

Le interazioni co-traslazionali svolgono un ruolo cruciale nelle modifiche della catena nascente, nel targeting, nella piegatura e nei percorsi di assemblaggio. Qui, descriviamo il Selective Ribosome Profiling, un metodo per l'analisi diretta in vivo di queste interazioni nel modello eucariota Saccharomyces cerevisiae.

Identificazione globale delle reti di interazione co-traslazionale mediante profilazione selettiva dei ribosomi

La traduzione dei ribosomi decodifica tre nucleotidi per codone in peptidi. Il loro movimento lungo l'mRNA, catturato dalla profilazione dei ribosomi, produce le impronte che mostrano la periodicità caratteristica della tripletta. Questo protocollo descrive come utilizzare RiboCode per decifrare questa caratteristica prominente dai dati di profilazione dei ribosomi per identificare i frame di lettura aperti tradotti attivamente a livello di trascrittoma intero.

De novo Identificazione di frame di lettura aperti tradotti attivamente con dati di profilazione dei ribosomi

Scopri la quantificazione genome-wide della traduzione nel lievito Saccharomyces cerevisiae mediante ribosome profiling. Questo metodo ad alta sensibilità permette di analizzare le regioni mRNA tradotte e regolazione traduzionale.

Genome-wide quantificazione della traduzione nel lievito gemmante mediante profilatura, ribosoma

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