Genome-wide quantificazione della traduzione nel lievito gemmante mediante profilatura, ribosoma

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare quali regioni dell'mRNA sono tradotte in proteine, misurare quantitativamente la traduzione proteica nel lievito in gemmazione saccharomyces cerevisiae a livello di genoma. Il profilo ribosomiale può essere utilizzato per monitorare il tasso di proteine e malattia e per studiare i meccanismi di regolazione traduzionale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che aggiunge una sensibilità molto maggiore rispetto ad altri metodi, e di quelli che misurano le proteine e la malattia in vivo alla risoluzione a contatto singolo.

Sebbene questo protocollo sia specifico per il lievito in gemmazione, è utile anche per i ricercatori che stanno cercando di stabilire la profilazione dei ribosomi in altri sistemi modello, come le cellule e i tessuti dei mammiferi. Gli estratti saranno preparati da cellule di lievito cresciute fino alla fase logaritmica media. Utilizzare un gruppo filtro portavetro per filtrare la coltura attraverso filtri a micromembrana da 0,45.

Raschiare il pellet con la spatola, congelare in azoto liquido e conservare a meno 80 gradi Celsius. Metti tre perline di acciaio cromato da 3,2 millimetri in un tubo di acciaio inossidabile da 1,8 millilitri e pre-raffredda il tubo in azoto liquido. Aggiungere il pellet congelato e coprire il tubo d'acciaio con un tappo di gomma siliconica.

Omogeneizzare il campione mediante criomacinazione per 10 secondi a 4200 giri/min. Per mantenere i campioni congelati durante l'intera procedura di macinazione, è fondamentale raffreddare la provetta in azoto liquido per almeno 10 secondi tra una macinazione e l'altra. Al termine dell'omogeneizzazione, aggiungere al campione un millilitro di tampone di lisi che contiene cicloesimide.

Mescolare bene pipettando e trasferire il campione in una nuova provetta da 1,5 millilitri. Centrifugare a 20.000 volte g a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 millilitri.

Trasferire 100 microlitri di lisato in un'altra nuova provetta da 1,5 millilitri per l'isolamento del poli(A)mRNA. Congelare le provette con i campioni di mRNA sul resto del lisato, che verrà utilizzato per l'estrazione dell'impronta in azoto liquido, e conservarle a meno 80 gradi Celsius. La notte prima dell'estrazione dell'impronta, scongelare i gradienti di saccarosio precedentemente preparati a quattro gradi Celsius.

Il giorno seguente, scongelare il lisato cellulare su ghiaccio. Trasferire un'aliquota di lisato cellulare contenente 50 unità OD260 in una nuova provetta da 1,5 millilitri, aggiungere un tampone di lisi fresco fino a un millilitro e 10 microlitri di RNasi. Incubare a temperatura ambiente con una leggera rotazione su un rotatore a testa in giù per un'ora.

Quindi, sovrapporre delicatamente il campione di lisato sopra un gradiente di saccarosio dal 10% al 50% in provette polimeriche. Utilizzando un rotore SW41 ti, centrifugare a 35.000 giri/min a quattro gradi Celsius per tre ore. Durante l'ultra cetrifugazione, impostare il sistema di frazionamento a gradiente.

Accendere i componenti e lasciare che il monitor UV si riscaldi per almeno 30 minuti. Riempi la siringa con la soluzione chase e rimuovi eventuali bolle d'aria all'interno della siringa e della canula. Al termine dell'ultracentrifugazione, installare e forare la provetta dell'ultracentrifuga contenente il gradiente di saccarosio.

Avviare la pompa a siringa a un millilitro al minuto e raccogliere frazioni di un millilitro monitorando i valori A254. Le frazioni che rappresentano il picco del monosoma ADS vengono raccolte e raggruppate. Filtrare le frazioni attraverso filtri centrifughi da 0,5 millilitri a 12.000 volte g a quattro gradi Celsius per 10 minuti, scartare il flusso e ripetere fino a quando il volume è inferiore a 100 microlitri.

A 400 microlitri di tampone di rilascio miscelato mediante pipettaggio e incubazione su ghiaccio per 10 minuti, trasferire l'unità in una nuova provetta di raccolta e centrifugare a 12.000 volte g a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Raccogli il flusso. Successivamente, purificare i frammenti di impronta e precipitare i campioni utilizzando la precipitazione dell'etanolo come descritto nel protocollo di testo.

Per iniziare questa procedura, centrifugare l'impronta precipitata e i campioni di mRNA frammentati a 20.000 volte g e quattro gradi Celsius per 30 minuti. Dopo aver rimosso l'etanolo e asciugato all'aria il pellet, sospendiamo ogni pellet in 7,75 microlitri di acqua. A ogni pellet, aggiungere un microlitro di tampone polinucleotide chinasi 10XT4, un microlitro di polinucleotide chinasi T4 e 0,25 microlitri di inibitore della RNasi.

Incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Aggiungere 10 microlitri di tampone per campioni di urea 2X TBE a 10 microlitri di ogni impronta e campione di mRNA. Incubare i campioni e gli opportuni controlli a 75 gradi Celsius per tre minuti, centrifugare e mettere in ghiaccio per un minuto.

Caricare ogni campione in due pozzetti di un gel di urea al 15% di TBE e separare i frammenti di RNA mediante elettroforesi su gel a 180 volt per un'ora. Colorare il gel con una macchia di gel di acido nucleico, al riparo dalla luce per cinque minuti. Durante la visualizzazione del gel sotto un transilluminatore a luce blu, asportare la banda corretta tra 28 e 32 nucleotidi per i campioni di impronte e tra 50 e 70 nucleotidi per i campioni di mRNA.

Congelare i pezzi di gel di poliacrilammide asportati a meno 80 gradi Celsius per almeno 10 minuti prima di estrarre l'RNA dal gel di poliacrilammide. Prima della trascrizione inversa, eseguire la legatura con tre adattatori primi e precipitare i campioni come descritto nel protocollo di testo. Risospendere ogni pellet in 11,5 microlitri di acqua priva di nucleasi.

Quindi aggiungere 0,5 microlitri di primer per trascrizione inversa a otto micromolari e un microlitro di miscela dNTP. Incubare a 65 gradi Celsius per cinque minuti e poi mettere sul ghiaccio. A ciascun campione, aggiungere quattro microlitri di tampone 5x primo filamento, due microlitri di DTT molare 0,1, 0,5 microlitri di inibitore della RNasi e 0,5 microlitri di trascrittasi inversa.

Incubare a 48 gradi Celsius per 30 minuti, 65 gradi Celsius per un minuto e 80 gradi Celsius per cinque minuti. Procedere immediatamente all'idrolisi dell'RNA aggiungendo 0,8 microlitri di idrossido di sodio a due molari a ciascun campione e incubando a 98 gradi Celsius per 30 minuti. Aggiungere 0,8 microlitri di acido cloridrico a due molari per neutralizzare la reazione.

Dopo aver precipitato i campioni come descritto nel protocollo di testo, risospendere ogni pellet in cinque microlitri di acqua priva di nucleasi e aggiungere cinque microlitri di tampone per campioni di urea 2x TBE. Incubare a 75 gradi Celsius per tre minuti, centrifugare e mettere in ghiaccio per un minuto. Caricare il campione in un pozzetto di un gel di urea al 10% di TBE.

Separare i prodotti della reazione di trascrizione inversa mediante elettroforesi su gel a 180 volt per 50 minuti. Colorare il gel con una macchia di gel di acido nucleico protetta dalla luce per cinque minuti. Utilizzando un transilluminatore a luce blu, asportare la banda intorno a 128 nucleotidi e oltre.

Congelare i pezzi di gel di poliacrilammide a meno 80 gradi Celsius per almeno 10 minuti prima di estrarre il DNA dal gel di poliacrilammide. Per circolarizzare il DNA, risospendere ogni pellet di DNA in 16,75 microlitri di acqua priva di nucleasi. Aggiungere due microlitri di tampone DNA ligasi a filamento singolo 10x, un microlitro di cloruro di manganese da 50 millimolari e 0,25 microlitri di DNA ligasi a filamento singolo.

Incubare a 60 gradi Celsius per un'ora, seguito da 80 gradi Celsius per 10 minuti. Senza precipitare, conservare il prodotto della reazione di legatura del DNA a filamento singolo a meno 20 gradi Celsius. Successivamente, eseguire l'amplificazione della libreria PCR seguita dalla quantificazione della libreria e dal sequenziamento ad alto rendimento come descritto nel protocollo di testo.

Vengono mostrati i profili rappresentativi dell'analizzatore biologico della libreria di impronte amplificate PCR e della libreria di sequenziamento ottenuta per i campioni di mRNA. La dimensione media prevista della libreria di impronte è compresa tra 148 e 152 nucleotidi e la dimensione prevista della libreria di mRNA è compresa tra 170 e 190 nucleotidi. Questo grafico mostra il numero combinato di letture di mRNA, impronte e rRNA ottenute per due repliche biologiche indipendenti di un campione wild type e del mutante di delezione hbs1.

Dal 50% al 60% di tutte le letture sequenziate nelle librerie di impronte corrispondeva a frammenti di impronte protetti da ribosoma. Al contrario, solo il 3% dei frammenti di rRNA è stato osservato nelle librerie di mRNA, dimostrando che l'isolamento del poli(A)mRNA consente un'efficace eliminazione delle letture di rRNA. Sia le librerie di campioni di impronte che quelle di mRNA mostrano una buona riproducibilità, come indicato da un coefficiente di correlazione di Pearson di circa 0,99 tra i campioni abbinati.

Se combinato con le misurazioni dell'abbondanza dell'mRNA, il profilo dei ribosomi consente di misurare i cambiamenti nell'efficienza di traduzione tra le condizioni sperimentali. I geni significativamente sovra-regolati e sotto-regolati nel mutante di delezione hbs1 sono raggruppati a seconda che siano influenzati da un cambiamento nella trascrizione dell'mRNA, dall'efficienza della traduzione o da un effetto comune. Una volta padroneggiato, l'intero protocollo può essere eseguito in circa 11 giorni.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di indossare i guanti ed eseguire tutti i passaggi utilizzando reagenti e materiali di consumo privi di RNasi per evitare la contaminazione da RNasi e ridurre il rischio di degradazione dell'RNA nei campioni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare impronte di ribosomi utilizzando la digestione della nucleasi, isolare complessi di impronte di ribosomi intatti mediante frazionamento del gradiente di saccarosio e preparare librerie di DNA per il sequenziamento profondo. Non dimenticare che lavorare con l'azoto liquido può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come indossare occhiali di sicurezza e crio-guanti dovrebbero essere sempre prese quando si maneggiano materiali estremamente freddi.