Name: Valutazione di sperma di pesce utilizzando Software e dispositivi di raffreddamento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Impara a valutare la qualità dello sperma di pesce con la tecnologia CASA e dispositivi di raffreddamento per l'acquicoltura. Questo metodo permette un'analisi accurata della motilità spermatica a basse temperature.

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Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dall'associazione di costo (cibo e agricoltura costo azione FA1205: AQUAGAMETE, programma ricerca e innovazione Orizzonte 2020 dell'Unione europea sotto il Marie Sklodowska-Curie progetto IMPRESS (GA No 642893). Vorremmo ringraziare il team scientifico di PROiSER, in particolare allo studente Alberto Vendrell Bernabéu, per la sua partecipazione attiva nella registrazione video di questo progetto.

Procedure che coinvolge soggetti animali sono stati approvati (2015/VSC/pisello/00064) dalla direzione generale della produzione agricola e del bestiame presso la Universitat Politècnica de València.
1. raccogliere lo sperma da anguille adulte europee in cattività
Nota: Maschi di anguilla europea uso mantenuti in vasche con acqua di mare e un sistema di ricircolo a temperatura costante (20 ° C). Trattare con gli ormoni attraverso iniezione intraperitoneale settimanale (gonadotropina corionica umana (hCG); 1,5 IU / g del peso corporeo di pesce). Acclimatare pesci gradualmente, cominciando con 3 giorni in acqua dolce seguita da sostituzione con acqua di mare (1/3 del totale dell'acqua del serbatoio) ogni 2 giorni fino a raggiungere una salinità di 37,0 g/mL.
<ol><li>Anestetizzare l'Anguilla 24 h dopo l'iniezione di ormone per ottenere campioni con migliore qualità dello sperma.<ol>
<li>Preparare in anticipo l'anestesia: aggiungere 300 mg di benzocaina per 100 mL di etanolo al 70%. Mescolare bene e conservare a 4 ° C.</li>
		<li>Diluire benzocaina in un secchio flessibile con 5 L di acqua dell'impianto per ottenere una concentrazione finale di 60 mg/L e mescolare bene.</li>
		<li>Trasferire il pesce al secchio con acqua dell'impianto e benzocaina. Attendere alcuni minuti fino a quando il pesce si calmi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cancellare l'area genitale con acqua e asciugare con carta assorbente per evitare la contaminazione dei campioni di sperma da feci, urine o acqua di mare.</li>
	<li>Applicare una leggera pressione nella zona addominale e raccogliere i campioni di sperma in tubi di plastica da 15 mL con la pompa a vuoto. Volume di sperma fino a 6-7 mL, a seconda del maschio.</li>
	<li>Mantenere i campioni di sperma a 4 ° C per almeno 1 h fino a motilità analisi viene svolta.</li>
</ol>2. mettere in frigorifero e diluire i campioni di sperma
<ol><li>Preparare la soluzione di diluente in anticipo. Nota: I campioni di sperma devono essere diluiti in soluzione di estensione specifica per ciascuna specie.<ol>
<li>Preparare il supporto non-attivatore per campioni di sperma di Anguilla (P1 medio). Aggiungere 0,42 g di bicarbonato di sodio, 1,828 g di cloruro di sodio, 0,127 g di cloruro di magnesio, 0,56 g di cloruro di potassio e 0,037 g di cloruro di calcio a 250 mL di acqua distillata. Miscela bene per dissolvere. Conservare a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Impostare il blocco di raffreddamento a 4 ° C per mantenere i campioni a temperatura costante. Attendere che la temperatura si stabilizzi.</li>
	<li>Diluire i campioni di sperma usando il DILUENTE soluzione specifici per ogni specie. Nota: Il rapporto di diluizione è specie specifico e deve essere definito per standardizzare il protocollo. In primo luogo, stimare la concentrazione di spermatozoi basata sulla concentrazione ottenuta in pre-analisi della motilità utilizzando software, come spiegato nei passaggi 3 e 4. Con questa analisi, è anche possibile selezionare i migliori campioni di sperma sulla base della percentuale di motilità. Dopo questo, il ricercatore può iniziare a raccogliere dati per l'esperimento con i migliori campioni con la giusta concentrazione.<ol>
<li>Diluire i campioni di sperma di Anguilla in mezzo P1 con un rapporto di 01:50. Per preparare 500 µ l di sperma diluito di Anguilla, aggiungere 50 µ l del campione di sperma fresco e 450 µ l di P1. Mescolare bene.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. valutare i parametri di motilità dello sperma
<ol><li>
Set-up del modulo di motilità del Software
	<ol>
<li>Impostare la fase di raffreddamento a 4 ° C e attendere finché non si stabilizza.</li>
		<li>Aprire il software e selezionare il Modulo di motilità. Se necessario, creare nome utente e password.</li>
		<li>Selezionare Proprietà e scegliere i parametri desiderati prima di iniziare l'analisi dello sperma.<ol>
<li>Fare clic su specie di | Pesce.</li>
			<li>Selezionare i Fotogrammi al secondo e il Numero di immagini, a seconda delle condizioni tecniche migliori per ciascuna specie. Impostare entrambe le opzioni 120 immagini al secondo.</li>
			<li>Scegliere contrasto negativo. È obbligatorio per la ricostruzione accurata delle traiettorie spermatozoi16.</li>
			<li>Selezionare la corrispondente Camera di conteggio e la scala della videocamera. Calibrare la videocamera per la lente di ingrandimento usata nell'esperimento. Impostare SpermTrack10 come camera di conteggio e 10 X scala. Nota: In generale, una profondità di 10 µm nella camera di conteggio e una lente di ingrandimento di 10x sono condizioni raccomandate poiché forniscono la migliore messa a fuoco di tutti gli spermatozoi e catturare il maggior numero di cellule. Tuttavia, si consiglia di fare uno studio precedente delle condizioni ottimali per l'analisi di motilità di ogni specie.</li>
			<li>Regolare l'Area delle particelle e la connettività per ciascuna specie. Impostare area minima particella a 2 µm2 e connettività a 7 µm. Nota: Per i pesci, il valore minimo di particelle zona varia tra 2-5 µm e connettività dipende la velocità di spermatozoi e il frame rate.</li>
			<li>Salvare il set-up.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Selezionare cattura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analizzare lo sperma di anguilla europea con Software
	<ol>
<li>Preparare la soluzione di attivatore (acqua di mare artificiale) aggiungendo 0,946 g di sale commerciale a 25 mL di acqua distillata con 2% BSA.</li>
		<li>Prendere 500 mL di soluzione di attivatore (acqua di mare artificiale) e nel blocco di raffreddamento. Nota: In generale, la sperma di pesce viene attivato da un evento shock osmotico, anche se per alcune specie la concentrazione di ioni potrebbe inoltre essere importante. Per le specie d'acqua dolce, il mezzo di attivatore dovrebbe avere osmolalità ipotonico, mentre per le specie marine il mezzo dovrebbe essere ipertonico.</li>
		<li>Mettere la vaschetta del conteggio sotto la fase di raffreddamento e attendere che la temperatura si stabilizza a 4 ° C.</li>
		<li>Mescolare l'attivatore e sperma diluito per attivare gli spermatozoi e avviare la registrazione tra 5-10 s dopo l'attivazione del video di motilità.<ol>
<li>Prendere 4 µ l di soluzione attivatore e posto nella camera di conteggio.</li>
			<li>Delicatamente e omogeneizzare lo sperma diluito agitando microcentrifuga 3 volte per evitare danni in cellule di spermatozoi.</li>
			<li>Prendere 0,5 µ l di sperma diluito, mescolare con l'attivatore e riporre il coperchio della camera di conteggio rapidamente. Nota: Questo passaggio non dovrebbe richiedere più di 5 s per avviare l'analisi appena possibile.</li>
			<li>Concentrarsi sulle cellule degli spermatozoi e trovare la migliore area visiva, che è definito da un numero basso di spermatozoi (150-200 celle) per evitare l'intercettazione tra cellule (Supplemental Figura 1A). Selezionare Acquisisci Video per ottenere le tracce di spermatozoi, che sono separate in base alla velocità.</li>
			<li>Selezionare Capture per ottenere campi da 3 a 7, che sono l'intervallo ottimale per ottenere una bassa variabilità nei risultati e procedere come prima. Registrare video fino a 120 post-attivazione s al fine di evitare fenomeni di condensa sul coperchio della camera di conteggio.</li>
			<li>Selezionare uscita per avere una visione generale di tutti i campi.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ottenere i dati di motilità
<ol><li>Selezionare campi di | Parziale | Salvare e scegliere un nome di file. Fare clic su Salva. Nota: Il foglio di calcolo fornisce i valori medi di dati parziali, grafici e immagini di tracce di spermatozoi.</li>
	<li>Selezionare dati generali | Nome del file | Salvare. Nota: I dati forniscono valori cinetici per spermatozoi individuali di tutti i campi.</li>
</ol>

<ol><li>Kime, D. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0166445X96008065">Use of computer-assisted sperm analysis (CASA) for monitoring the effects of pollution on sperm quality of fish; application to the effects of heavy metals.</a> Aquatic Toxicology. 36, 223-237 (1996).</li>
<li>Kime, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-assisted+sperm+analysis+%28CASA%29+as+a+tool+for+monitoring+sperm+quality+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+-+Part+C%3A+Toxicology+%26+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).</li>
<li>Bobe, J., Labbé, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egg+and+sperm+quality+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Egg and sperm quality in fish.</a> General and Comparative Endocrinology. 165, 535-548 (2010).</li>
<li>Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0044848603008330">The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish.</a> Aquaculture. 234, 1-28 (2004).</li>
<li>Bekkevold, D., Hansen, M. M., Loeschcke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+reproductive+competition+in+spawning+aggregations+of+cod+%28Gadus+morhua%2C+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Male reproductive competition in spawning aggregations of cod (Gadus morhua, L.).</a> Molecular Ecology. 11, 91-102 (2002).</li>
<li>Chong, A. P., Walters, C. A., Weinrieb, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neglected+laboratory+test%3A+the+semen+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">The neglected laboratory test: the semen analysis.</a> Journal of Andrology. 4, 280-282 (1983).</li>
<li>Overstreet, J. W., Katz, D. F., Hanson, F. W., Fonesca, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+tests+for+human+male+reproductive+risk+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Teratogenesis%2C+Carcinogenesis%2C+and+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Laboratory tests for human male reproductive risk assessment.</a> Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis. 4, 67-82 (1984).</li>
<li>Gallego, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+European+eel+%28Anguilla+anguilla%29+sperm+motility+evaluation+by+CASA+software%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Standardization of European eel (Anguilla anguilla) sperm motility evaluation by CASA software.</a> Theriogenology. 79, 1034-1040 (2013).</li>
<li>Fauvel, C., Suquet, M., Cosson, J. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1439-0426.2010.01529.x">Evaluation of fish sperm quality.</a> Journal of Applied Ichthyology. 26, 636-643 (2010).</li>
<li>Mortimer, S. T., Schoëvaërt, D., Swan, M. A., Mortimer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+observations+of+flagellar+motility+of+capacitating+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Quantitative observations of flagellar motility of capacitating human spermatozoa.</a> Human Reproduction. 12, 1006-1012 (1997).</li>
<li>Bompart, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CASA-Mot+technology%3A+How+results+are+affected+by+the+frame+rate+and+counting+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+Fertility+and+Development%22%5BJournal%5D)">CASA-Mot technology: How results are affected by the frame rate and counting chamber.</a> Reproduction, Fertility and Development. , (2018).</li>
<li>Vladić, T., Järvi, T. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1095-8649.1997.tb01632.x">Sperm motility and fertilization time span in Atlantic salmon and brown trout - the effect of water temperature.</a> Journal of Fish Biology. 50, 1088-1093 (1997).</li>
<li>Rurangwa, E., Volckaert, F. A. M., Huyskens, G., Kime, D. E., Ollevier, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11245263">Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer-assisted sperm analysis (CASA), viable staining and standardizes fertilisation in African catfish (Clarias gariepinus).</a> Theriogenology. 55, 751-769 (2001).</li>
<li>Cosson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+fish+spermatozoa%3A+racing+ephemeral+swimmers%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Marine fish spermatozoa: racing ephemeral swimmers.</a> Reproduction. 136, 277-294 (2008).</li>
<li>Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+best+frame+rate+for+evaluation+of+sperm+motility+in+different+species+by+computer-assisted+sperm+analysis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis?</a> Fertility and Sterility. 96, 24-27 (2011).</li>
<li>Soler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+holographic+solution+for+sperm+motility+analysis+in+boar+samples.+Effect+of+counting+chamber+depth%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+Fertility+and+Development%22%5BJournal%5D)">A holographic solution for sperm motility analysis in boar samples. Effect of counting chamber depth.</a> Reproduction, Fertility and Development. , (2018).</li>
<li>Elliot, F. I., Sherman, J. K., Elliot, E. J., Sullivan, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photo+method+of+measuring+sperm+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">A photo method of measuring sperm motility.</a> Journal of Animal Science. 37, 310(1973).</li>
<li>Katz, D. F., Dott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+measuring+swimming+speed+of+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Fertility%22%5BJournal%5D)">Methods of measuring swimming speed of spermatozoa.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 45, 263-272 (1975).</li>
<li>Liu, Y. T., Warme, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computerized+evaluation+of+sperm+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Computers+and+Biomedical+Research%22%5BJournal%5D)">Computerized evaluation of sperm cell motility.</a> Computers and Biomedical Research. 10, 127-138 (1977).</li>
<li>Jecht, E. W., Russo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+the+quantitative+analysis+of+human+sperm+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Andrologia%22%5BJournal%5D)">A system for the quantitative analysis of human sperm motility.</a> Andrologia. 5, 215-221 (1973).</li>
<li>Holt, W. V., Palomo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+continuous+real-time+computerized+semen+analysis+system+for+ram+sperm+motility+assessment%2C+and+evaluation+of+four+methods+of+semen+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+Fertility+and+Development%22%5BJournal%5D)">Optimization of a continuous real-time computerized semen analysis system for ram sperm motility assessment, and evaluation of four methods of semen preparation.</a> Reproduction, Fertility and Development. 8, 219-230 (1996).</li>
<li>Stephens, D. T., Hickman, R., Hoskins, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description%2C+validation%2C+and+performance+characteristics+of+a+new+computer-automated+sperm+motility+analysis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Description, validation, and performance characteristics of a new computer-automated sperm motility analysis system.</a> Biology of Reproduction. 38, 577-586 (1988).</li>
<li>Mortimer, D., Goel, N., Shu, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+CellSoft+automated+semen+analysis+system+in+a+routine+laboratory+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the CellSoft automated semen analysis system in a routine laboratory setting.</a> Fertility and Sterility. 50, 960-968 (1988).</li>
<li>Mortimer, S. T., Swan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinematics+of+capacitating+human+spermatozoa+analysed+at+60+Hz%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Kinematics of capacitating human spermatozoa analysed at 60 Hz.</a> Human Reproduction. 10, 873-879 (1995).</li>
<li>Holt, W. V., O'Brien, J., Abaigar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+and+interpretation+of+computer-assisted+sperm+analyses+and+sperm+sorting+methods+in+assisted+breeding+and+comparative+research%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+Fertility+and+Development%22%5BJournal%5D)">Applications and interpretation of computer-assisted sperm analyses and sperm sorting methods in assisted breeding and comparative research.</a> Reproduction, Fertility and Development. 19, 709-718 (2007).</li>
<li>Gill, H. Y., Van Arsdalen, K., Hypolote, J., Levin, R., Ruzich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+two+computerized+semen+motility+analyzers%5BTitle%5D)+AND+%22Andrologia%22%5BJournal%5D)">Comparative study of two computerized semen motility analyzers.</a> Andrologia. 20, 433-440 (1988).</li>
<li>Jasko, D. J., Lein, D. H., Foote, R. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2254179">A comparison of two computer-assisted semen analysis instruments for the evaluation of sperm motion characteristics in the stallion.</a> Journal of Andrology. 11, 453-459 (1990).</li>
<li>Vantman, D., Koukoulis, G., Dennison, L., Zinaman, M., Sherins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-assisted+semen+analysis%3A+Evaluation+of+method+and+assessment+of+the+influence+of+sperm+concentration+on+linear+velocity+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Computer-assisted semen analysis: Evaluation of method and assessment of the influence of sperm concentration on linear velocity determination.</a> Fertility and Sterility. 49, 510-515 (1988).</li>
<li>Kime, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-assisted+sperm+analysis+%28CASA%29+as+a+tool+for+monitoring+sperm+quality+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+-+Part+C%3A+Toxicology+%26+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).</li>
<li>Scherr, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+and+numerical+simulation+as+methods+for+standardization+of+zebrafish+sperm+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Microfluidics and numerical simulation as methods for standardization of zebrafish sperm cell activation.</a> Biomedical Microdevices. 17, 65-75 (2015).</li>
<li>Mortimer, S. T., Swan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+image+sampling+frequency+on+established+and+smoothing-independent+kinematic+values+of+capacitating+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effect of image sampling frequency on established and smoothing-independent kinematic values of capacitating human spermatozoa.</a> Human Reproduction. 14, 997-1004 (1999).</li>
<li>Hoogewijs, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+counting+chamber+type+on+CASA+outcomes+of+equine+semen+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">Influence of counting chamber type on CASA outcomes of equine semen analysis.</a> Equine Veterinary Journal. 44, 542-549 (2012).</li>
<li>Soler, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/289987642_Effect_of_counting_chamber_on_seminal_parameters_analyzing_with_the_ISASv1_R">Effect of counting chamber on seminal parameters, analyzing with the ISASv1®.</a> Revista Internacional de Andrología. 10, 132-138 (2012).</li>
<li>Didion, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-assisted+semen+analysis+and+its+utility+for+profiling+boar+semen+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Computer-assisted semen analysis and its utility for profiling boar semen samples.</a> Theriogenology. 70, 1374-1376 (2008).</li>
<li>David, G., Serres, C., Jouannet, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2384341">Kinematics of human spermatozoa.</a> Gamete Research. 4, 83-95 (1981).</li>
<li>Björndahl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+normal+semen+quality%3F+On+the+use+and+abuse+of+reference+limits+for+the+interpretation+of+semen+results%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Fertility+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">What is normal semen quality? On the use and abuse of reference limits for the interpretation of semen results.</a> Human Fertility (Cambridge). 14, 179-186 (2011).</li>
<li>Verstegen, J., Iguer-ouada, M., Onclin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-assisted+semen+analyzers+in+andrology+research+and+veterinary+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Computer-assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice.</a> Theriogenology. 57, 149-179 (2002).</li>
<li>Alavia, S. M. H., Cosson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+motility+in+fishes.+I.+Effects+of+temperature+and+pH%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Sperm motility in fishes. I. Effects of temperature and pH: a review.</a> Cell Biology International. 29, 101-110 (2005).</li>
<li>Islam, M. S., Akhter, T. <a target="_blank" href="http://article.sapub.org/10.5923.j.als.20110101.03.html">Tale of Fish Sperm and Factors Affecting Sperm Motility: A Review.</a> Advancements in Life Sciences. 1, 11-19 (2011).</li>
<li>Dadras, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+common+carp+Cyprinus+carpio+sperm+motility+and+lipid+composition+using+different+in+vitro+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Anim.+Reprod.+Sci%22%5BJournal%5D)">Analysis of common carp Cyprinus carpio sperm motility and lipid composition using different in vitro temperatures.</a> Anim. Reprod. Sci. 180, 37-43 (2017).</li>
<li>Soler, C., García, A., Contell, J., Segervall, J., Sancho, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinematics+and+subpopulations%27+structure+definition+of+blue+fox+%28Alopex+lagopus%29+sperm+motility+using+the+ISASV1+CASA+system%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">Kinematics and subpopulations' structure definition of blue fox (Alopex lagopus) sperm motility using the ISASV1 CASA system.</a> Reproduction in Domestic Animals. 49, 560-567 (2014).</li>
<li>Vásquez, F., Soler, C., Camps, P., Valverde, A., GarcíaMolina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermiogram+and+sperm+head+morphometry+assessed+by+multivariate+cluster+analysis+results+during+adolescence+%2812-18+years%29+and+the+effect+of+varicocele%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">Spermiogram and sperm head morphometry assessed by multivariate cluster analysis results during adolescence (12-18 years) and the effect of varicocele.</a> Asian Journal of Andrology. 18, 824-830 (2016).</li>
<li>Soler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dog+sperm+head+morphometry%3A+its+diversity+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">Dog sperm head morphometry: its diversity and evolution.</a> Asian Journal of Andrology. 19, 149-153 (2017).</li>
<li>Valverde, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometry+and+subpopulation+structure+of+Holstein+bull+spermatozoa%3A+variations+in+ejaculates+and+cryopreservation+straws%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">Morphometry and subpopulation structure of Holstein bull spermatozoa: variations in ejaculates and cryopreservation straws.</a> Asian Journal of Andrology. 18, 851-857 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il software di analisi dello sperma utilizzato in questo protocollo è stato utilizzato dai ricercatori in tutto il mondo per le diverse specie, tra cui pesce. Tuttavia, i pesci hanno alcune caratteristiche specifiche che possono influenzare la valutazione di sperma. Spermatozoi di pesce ha mostrati ad alta velocità al momento dell'attivazione che declina rapidamente e conduce ad un a breve termine della motilità dopo l'attivazione. Inoltre, la temperatura della riproduzione è specie-dipendente e, in alcuni casi, potrebbe...

L'efficacia di riproduzione dipende dalla qualità dei due gameti (uova e spermatozoi)1,2. Questo è il fattore principale che contribuisce alla fecondazione, permettendo lo sviluppo di prole vitale3,4. Il conveniente valutazione della qualità dei gameti è lo strumento migliore per definire il potenziale di fertilità di un esemplare.
Miscelazione di sperma da più maschi è una pratica comune nella produzione di molte specie acquatiche commerciali4. Tuttavia, la variabilità di sperma tra maschi può portare a concorrenza dello sperma e, di conseguenza, non tutti i maschi sono ugualmente contribuendo al pool genico5. In questo senso, la corretta valutazione delle caratteristiche individuali eiaculare/spermatozoi, come motilità, è fondamentale per ottenere informazioni discriminatorie per quanto riguarda la fertilità maschile individuale potenziale. Osservazione diretta di motilità dello sperma può produrre dati inesatti e soggettivi come richiede tempo ed esperienza, che porta a una mancanza di coerenza e incompatibilità di risultati6,7. Tuttavia, ci sono molte tecniche innovative, rapide e quantitative che possono fornire un affidabile sperma qualità analisi2,4.
Analisi computerizzata dello sperma è stata sviluppata per offrire dati accurati su sperma qualità8. Questa tecnologia comprende lo sviluppo di software associato con un microscopio di contrasto di fase che permette la valutazione della motilità spermatica. Tuttavia, un fattore limitante del parametro motilità è la frequenza dei fotogrammi della telecamera. Individuali degli spermatozoi traiettorie si basano su spermatozoi testa posizione di baricentro in fotogrammi consecutivi di registrazioni video, che è correlata con il movimento flagellare modelli3,9,10, 11. i principali parametri cinetici misurati sono la velocità lineare (VSL), la velocità curvilinea (VCL) e la velocità di percorso medio (VAP). VSL è la distanza tra l'inizio e il punto finale presi dagli spermatozoi divisi da tempo. VCL è la reale velocità lungo la traiettoria precisa presa di spermatozoi. VAP è la velocità lungo un percorso levigato derivata della traiettoria. Questi parametri consentono ulteriori informazioni cinetiche, tra cui linearità (LIN), rettilineità (STR), wobble (WOB) e misurazioni di battitura come ampiezza di movimento laterale della testa (ALH) e frequenza di battimento-Croce (BCF)4,10.
Il sistema di analisi dello sperma è stato originariamente utilizzato per specie di mammiferi, e uno dei requisiti per il sistema è quello di operare alla temperatura corporea del donatore (circa 37 ° C). Questo software potrebbe essere utilizzato anche per le specie ittiche; anche se, è necessario effettuare alcuni adattamenti per ridurre l'errore di risultati di analisi dello sperma. In alcune specie di pesci, come i salmonidi e anguille8,12, la fecondazione avviene a bassa temperatura (circa 4 ° C)2,4. Così, dispositivi di raffreddamento dovrebbero essere sviluppato per evitare scomode condizioni di lavoro. Inoltre, gli spermatozoi di pesce sono immotile nel liquido seminale e richiedono un shock osmotico per attivare la motilità. Per le specie d'acqua dolce, il mezzo di attivatore dovrebbe avere osmolalità ipotonico, mentre per le specie marine il mezzo dovrebbe essere ipertonico. Tuttavia, per alcune specie, come i salmonidi, la concentrazione di ioni potrebbe anche essere importante3,4,9. Dopo l'attivazione, sperma di pesce è caratterizzato da una rapida diminuzione della motilità (meno di 2 min)13,14 e ad alta velocità, essendo essenziale per determinare la frequenza di fotogrammi ottimale per ottenere dati affidabili15.
Gli obiettivi di questo studio sono per progettare e applicare sistemi di refrigerazione per campioni di sperma di pesce. Inoltre, il presente protocollo definisce le modalità determinare i tassi di fotogrammi ottimale per l'istituzione di protocolli standard a seconda della specie. L'utilizzo di questo protocollo apre nuove porte nel contesto della valutazione seminale pesce, utilizzando l'anguilla europea come un modello.

<table><tbody><tr><td>Gonadotropina corionica umana</td><td>Argent Chemical Laboratories</td><td>ormone hCG</td><td></td></tr><tr><td>benzocaina</td><td>Merck</td><td>E1501 Sigma</td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>bicarbonato di sodio</td><td>Merck</td><td>S5761 Sigma</td><td>P1 medio</td></tr><tr><td>cloruro di sodio</td><td>Merck</td><td>1.06406 EMD Millipore</td><td>P1 cloruro di</td></tr><tr><td>magnesio</td> medio <td>Merck</td><td>1374248 USP</td><td>P1 cloruro di</td></tr><tr><td>potassio</td> medio <td>Merck</td><td>P3911-500G</td><td>P1 cloruro di</td></tr><tr><td>calcio</td> medio <td>Merck</td><td>C7902-500G</td><td>P1</td></tr><tr><td>sale commerciale</td> medio <td>Aqua Medic</td><td>Soluzione Meersalz</td><td>Activator&nbsp;</td></tr><tr><td>Soluzione BSA</td><td>Merck</td><td>05470 Sigma</td><td>Activator&nbsp;</td></tr><tr><td>Provette Falcon 15 ml</td><td>Merck</td><td>T1943-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Supporto provette Falcon</td><td>Merck</td><td>R5651-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorfs</td><td>Merck</td><td>T9661-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet 20 &; l</td><td>Gilson</td><td>PIPETMAN&reg; </td> Micropipetta Classica <td></td></tr><tr><td>10 & micro; l</td><td>Merck</td><td>Z683787-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Punte per micropipette 20 &; micro; l</td><td>Merck</td><td>Z740030-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Punte per micropipette 10 &; l</td><td>Merck</td><td>Z740028-2000EA</td><td></td></tr><tr><td>Spermtrack</td><td>PROiSER</td><td>Camera</td><td></td>di conteggio</tr><tr><td>TruMorph</td><td>PROiSER</td><td>TruMorph</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio UB 200i Serie</td><td>PROiSER</td><td>Microscopio Piastra</td><td></td></tr><tr><td>di raffreddamento</td><td>PROiSER Prototipo PROiSER</td><td></td><td></td></tr><tr>Blocco<td>di raffreddamento</td><td>PROiSER</td><td></td><td>Prototipo</td></tr><tr><td>ISAS v1</td><td>Software PROiSER</td><td>ISAS</td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione di sperma di pesce utilizzando software e dispositivi di raffreddamento

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

Per la valutazione della qualità dei gameti, esistono tecniche innovative, rapide e quantitative che possono fornire dati utili per l'acquacoltura. Sistemi computerizzati per l'analisi dello sperma sono stati sviluppati per misurare diversi parametri e uno dei più comunemente misurato è la motilità degli spermatozoi.
Inizialmente, questa tecnologia informatica è stata progettata per specie di mammiferi, anche se può anche essere utilizzato per l'analisi dello sperma dei pesci. I pesci hanno caratteristiche specifiche che possono influenzare la sperma valutazione come un momento di breve motilità dopo l'attivazione e, in alcuni casi, adattamento a temperature più basse. Pertanto, è necessario modificare i componenti hardware e software per analisi di motilità più efficiente per l'analisi dello sperma dei pesci. Per gli spermatozoi dei mammiferi, la piastra di riscaldamento viene utilizzata per mantenere la temperatura ottima di spermatozoi. Tuttavia, per alcune specie di pesci, è vantaggioso utilizzare una temperatura più bassa per prolungare la durata della motilità, dato che gli spermatozoi rimangono attivi per meno di 2 min. Di conseguenza, dispositivi di raffreddamento sono necessari per refrigerare i campioni a temperatura costante sopra il tempo di analisi, tra cui il microscopio ottico. Questo protocollo descrive l'analisi di motilità dello sperma di pesce utilizzando il software per l'analisi dello sperma e nuovi dispositivi per ottimizzare i risultati di raffreddamento.

Analisi dell'effetto tempo sulla motilità dello sperma
Nel caso l'anguilla europea, la percentuale degli spermatozoi statici aumentato da 15 s a 120 s dopo l'attivazione (dal 24,4% al 40,7%) e la percentuale di spermatozoi mobili progressivi è diminuito (da 36,9% al 20,9%) (Figura 1A e 1B). Basato su velocità, le cellule degli spermatozoi hanno mostrato una diminuzi...

Il presente protocollo descrive una procedura di valutazione di sperma di pesce mediante analisi computerizzata dello sperma e dispositivi di raffreddamento. Il software dà un rapido, accurato e l'analisi quantitativa della qualità dello sperma di pesce basata sulla motilità degli spermatozoi, che può essere un utile strumento nel settore dell'acquacoltura per migliorare il successo di riproduzione.

Valutazione di sperma di pesce utilizzando Software e dispositivi di raffreddamento

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...

L'obiettivo principale di questa procedura è analizzare la qualità dello sperma di pesce in base alla motilità degli spermatozoi al fine di contribuire al successo della fecondazione artificiale. Sono il Dr.Carles Soler, professore all'Università di Valencia e direttore scientifico di PROiSER R+D. Sono Carina Caldeira, una borsa di studio di Impress Project.La tecnologia CASA è stata sviluppata alcuni decenni fa per l'analisi dello sperma delle specie di mammiferi utilizzando un'analisi dello sperma assistita da computer. Nel caso del pesce, è necessario tenere conto di due cose. Il primo, è il fatto che questi animali normalmente fecondano a basse temperature, intorno ai quattro gradi, e per questo motivo, non è possibile analizzare il seme a temperatura domestica, ma è necessario sviluppare strumenti specifici per la refrigerazione dei campioni.L'altro problema, è che la motilità diminuisce molto velocemente dopo l'attivazione, ed è necessario analizzare questo fatto, per definire quale sia il momento giusto per l'analisi della qualità, o della qualità del seme. Quindi, mostreremo l'analisi dello sperma di pesce, e questo protocollo sarà una modifica del protocollo dei mammiferi

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Si tratta di un high-throughput protocollo di crioconservazione degli spermatozoi per zebrafish. Spermatozoi crioconservati utilizzando questo protocollo ha una media del 25% la fertilità fertilizzazione in vitro successive ed è stabile per molti anni.

A High-Throughput Metodo per la crioconservazione dello sperma e Zebrafish In Vitro Fecondazione

Questo video-articolo descrive, passo dopo passo, come elaborare un campione di sperma per raggiungere una buona qualità di...

Fluorescenza In situ</emIbridazione> (FISH) Protocollo di sperma umano

Uova e rivestimenti extracellulare intorno uova di frequente rilascio peptidi, proteine ​​e piccole molecole che comunicano con lo sperma per guidarli verso l'ovulo promuovendo in tal modo la fecondazione. Con sperma rana che descrivere e confrontare due classi di test utilizzato per rilevare chemiotassi degli spermatozoi - analisi di accumulo dello sperma e test di tracciamento degli spermatozoi.

Due tipi di saggi per chemiotassi Frog rilevamento sperma

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Lo scopo principale di questo studio era di adattare l'ago immerso procedura di vitrificazione (NIV) per crioconservare intero zebrafish testicoli. Inoltre, è stata testata la ripetibilità del metodo in cinque zebrafish diversi ceppi.

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Impara a valutare la qualità dello sperma di pesce con la tecnologia CASA e dispositivi di raffreddamento per l'acquicoltura. Questo metodo permette un'analisi accurata della motilità spermatica a basse temperature.

Valutazione di sperma di pesce utilizzando Software e dispositivi di raffreddamento

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