Valutazione di sperma di pesce utilizzando Software e dispositivi di raffreddamento

L'obiettivo principale di questa procedura è analizzare la qualità dello sperma di pesce in base alla motilità degli spermatozoi al fine di contribuire al successo della fecondazione artificiale. Sono il Dr.Carles Soler, professore all'Università di Valencia e direttore scientifico di PROiSER R+D. Sono Carina Caldeira, una borsa di studio di Impress Project.

La tecnologia CASA è stata sviluppata alcuni decenni fa per l'analisi dello sperma delle specie di mammiferi utilizzando un'analisi dello sperma assistita da computer. Nel caso del pesce, è necessario tenere conto di due cose. Il primo, è il fatto che questi animali normalmente fecondano a basse temperature, intorno ai quattro gradi, e per questo motivo, non è possibile analizzare il seme a temperatura domestica, ma è necessario sviluppare strumenti specifici per la refrigerazione dei campioni.

L'altro problema, è che la motilità diminuisce molto velocemente dopo l'attivazione, ed è necessario analizzare questo fatto, per definire quale sia il momento giusto per l'analisi della qualità, o della qualità del seme. Quindi, mostreremo l'analisi dello sperma di pesce, e questo protocollo sarà una modifica del protocollo dei mammiferi e includerà l'analisi della motilità utilizzando Quindi, iniziamo. I pesci vengono anestetizzati per l'iniezione di ormoni e i campioni di sperma vengono raccolti 24 ore dopo.

L'area genitale viene pulita per evitare contaminazioni. Lo sperma viene raccolto applicando una leggera pressione. I campioni di sperma vengono conservati a quattro gradi, fino a quando non vengono effettuate le analisi della motilità.

Il diluitore e l'attivatore vengono preparati in anticipo. Impostare il blocco di raffreddamento a quattro gradi per mantenere i campioni a una temperatura costante. Attendi che si stabilizzi.

Diluire i campioni di sperma utilizzando il diluitore specifico per ogni specie. Per l'anguilla europea, lo sperma viene diluito nel terreno P1, con un rapporto di 1:50. Preparare 500 microlitri di spermatozoi diluiti, aggiungendo 450 microlitri di P1 e 50 microlitri di campione di sperma fresco.

Mescola bene. Prendi un aliquarter di soluzione attivatore e mettilo nel blocco frigorifero. Imposta il livello più fresco a quattro gradi.

Attendi che si stabilizzi. Selezionare il modulo di motilità e, se necessario, utilizzare un nome e una password. Scegli le proprietà.

Fare clic sulla specie e selezionare il pesce. Seleziona i fotogrammi al secondo e il numero di immagini che desideri utilizzare. È obbligatorio utilizzare il contrasto negativo.

Selezionare la camera di conteggio e la bilancia corrispondenti. Per ogni specie, adattare l'area delle particelle e la connettività. Per l'anguilla europea, l'area minima delle particelle dovrebbe essere due e la connettività sette.

Salvare la configurazione. Apri l'acquisizione. Prendi quattro microlitri di soluzione attivatrice e mettili nella camera.

Omogeneizzare bene lo sperma diluito. Prendi 5 microlitri di sperma e mescola con l'attivatore. Posiziona il coperchio.

Metti a fuoco il campione e trova l'area visiva migliore. Selezionare Acquisisci video per ottenere tracce di spermatazoi, che vengono separate in base alla velocità. È possibile acquisire più campi.

Seleziona Acquisisci e procedi come prima. Fare clic su Esci per ottenere una visione generale di tutti i campi. Le catture di spermatozoi sono state effettuate a intervalli di tempo specifici dopo l'attivazione.

Tuttavia, l'analisi dello sperma è stata eseguita per ogni intervallo di tempo replicato. Il report parziale per ogni intervallo di tempo può essere ottenuto selezionando i campi e cliccando su parziale. Il foglio Excel fornisce i valori medi dei dati parziali, i grafici e le immagini delle tracce degli spermatozoi.

Ripetere la stessa procedura per gli altri campi. L'altra opzione sono i dati generali. Questi dati forniscono valori cinetici per i singoli spermatozoi di tutti i campi.

Con il report parziale, la motilità percentuale e la progressività per i diversi tempi possono essere confrontate immediatamente, utilizzando grafici a torta. I dati generali danno la possibilità di ottenere diverse analisi statistiche utilizzando i parametri cinetici. Le tracce degli spermatozoi forniscono tre parametri.

VCL, velocità curvilinerale, VSL, velocità progressiva e VAP, velocità di percorso. VCL è il parametro più importante e cambia con il numero di fotogrammi al secondo. Aumentando il numero di fotogrammi, aumenta anche il VCL, consentendo un'analisi della traccia quasi perfetta.

Il frame rate migliore può variare a seconda della specie. L'obiettivo è quello di trovare il valore più alto di VCL, dopodiché si possono osservare eventuali differenze potenziali con altri strumenti, come le camere di conteggio. Le sottopopolazioni sono attualmente un'importante analisi statistica che fornisce maggiori informazioni sul campione di sperma.

Questo è un esempio di campioni di sperma di salmone atlantico. Diverse sottopopolazioni di spermatozoi possono essere osservate in diverse generazioni prodotte in cattività. Abbiamo mostrato come utilizzare un sistema informatico per l'analisi dello sperma di pesce e anche come ottimizzare aspetti tecnici e metodologici come la camera di conteggio, la temperatura e i frame rate.

Quindi, con questi dati, possiamo fare molte analisi in diversi campi, come l'allevamento ittico, non solo per l'acquacoltura, ma anche per programmi di conservazione, studi filogenetici o per aumentare le conoscenze sulla popolazione di spermatozoi. Quindi, spero che questo protocollo ti aiuti nei tuoi studi.